Flüoresans Etiketli Bakterilerde Kromozom Ayrılmasının Zaman Kesmesi Görüntülemesi

Floresan etiketli kromozom kökenleri ve floresan mikroküreleri ifade eden bakterileri içeren metal bir çerçeve üzerinde besin açısından zengin bir agaroz pediyle başlayın.

Agararoz ped, bakteriyel bağlanma ve hareketliliği destekler, floresan mikroküreler ise kromozom ayrımını izlemek için bir referans görevi görür.

Ters geniş alan mikroskobun önceden ısıtılmış kuluçka odasında objektif merceğe daldırma yağı ekleyin.

Örneği lensin üzerine yerleştirin, ardından birden fazla bakteri ve en az bir floresan mikroküre içeren bir bölgeye odaklanın.

Zaman geçişli görüntülemeyi başlatın ve hem faz kontrastı hem de floresans görüntüleri yakalayın.

Floresan etiketli replikasyonun kökeni, hücrenin bir ucuna yakın parlak bir küme olarak görünür.

Bölünme sırasında, orijin çoğalıyor; bir küme orijinal uçta kalırken, diğer küme yeni oluşan hücre ucuna göç eder.

Bu düzen, kromozom ayrımının birden fazla bölünme boyunca izlenmesine olanak tanır ve konak etkileşimleri sırasında patojenik türler dahil olmak üzere diğer bakterilerde benzer dinamik süreçleri görselleştirmek için uyarlanabilir.

Zaman geçişli mikroskopi yapmak için mikroskobu açın ve mikroskop kontrol yazılımını başlatın. Doğru nesli ve doğru aynaları ve filtreyi seçin; faz kontrastı görüntüleri ile yeşil-floresan, kırmızı-floresan veya sarı-floresan proteinlerin görüntülerini elde edin. ObjektİF merceğine ve 32 derece Celsius'ta önceden inkubasyon edilmiş numunenin altına yüksek kaliteli daldırma yağı damlatın.

Delik tarafı objektîfe doğru, numuneyle birlikte metal çerçeveyi mikroskop aşamasına yerleştirin, ardından örneği aşama tutucusuna sıkıca sabitleyin. Sahneyi Z yönünde hedefe daha yakın hareket ettirerek hücrelere odaklanın. Objektif ve numunedeki yağ temas ettiğinde, aşamayı X/Y yönünde hareket ettirin.

Metamorph yazılımına geçin ve Acquire aracını açın. Ayar açılır menüsünden Faz Kontrastı'nı seçin ve Pozlama Süresi'ni 100 milisaniyeye ayarlayın. Canlı Göster, Hücreyi Odak Düzlemine Getir ve sahneyi X/Y yönünde hareket ettirin, görüş alanında birden fazla tek hücre görünür hale gelene kadar.

Alınan görüntüleri hizalamak için en az bir floresan mikrosferin görüş bölgesinde olduğundan emin olun. Sonra, mikroskop kontrol yazılımının Çok Boyutlu Alım sihirbazını açın; böylece mikroskobun gerekirse birden fazla dalga boyunda ve aşama konumunda görüntü almasını sağlayan bir zaman geçişli deney kurun.

Ana sekmede, zaman geçişi ve Çoklu Dalga Boyları aktive edin. Pencerenin sol tarafında ek sekmeler belirecek. Kaydetme sekmesine tıklayın ve Dizin'i seçerek bilgisayarın sabit diskinde boş bir klasörü seçerek alınan görüntüleri kaydedin, ardından ardışık veri setlerinin önceki veri setlerinin üzerine yazılmamasını sağlamak için Dosya Varsa Temel Adı Artırılması'nı etkinleştirin. Deneye tarih ve suş adı veya deneyin başlığı ile bir isim verin.

Time-lapse sekmesine tıklayarak zaman geçişi parametrelerini ayarlayın, ardından Zaman Aralığı'nı 20 dakikaya ayarlayın ve Süreyi 24 saat olarak ayarlayın. Zaman sayısı otomatik olarak değişir. Şimdi, Wavelengths sekmesine tıklayın.

Her zaman noktasında her görüntü için alınacak dalga boyları sayısını değiştirerek seçin. Her dalga boyu için ayrı donanım haberlenmiş AF konumuna izin ver seçeneğini seç. Üstten Birinci Dalga Boyu sekmesine tıklayın.

Aydınlatma açılır menüsünde Faz Kontrastı seçeneğini seçin. Pozlama için 100 milisaniye seçin ve Acquire açılır menüsünden Her Zaman Noktası'nı seçin. Açılır menüde Otomatik Pozlama'yı devre dışı bırakın, Hiç Zaman seçeneğini seçin ve Otomatik Odak için açılır menüden Her Edinim'i seçin.

Az önce gösterildiği gibi her dalga boyu için pozlamayı aşağıdaki parametrelerle ayarlayın. Sonra, birden fazla sahne konumundan görüntü almak için Ana sekmede Çoklu Sahne Pozisyonları'nı etkinleştirin. Sahne sekmesine tıklayın ve görüş alanına bakmak için Canlı butonuna tıklayın.

Sahneyi X/Y yönünde hareket ettirin, görüş alanına bir yatırım getirisi oluşana kadar. Sahne sekmesinde Plus işaretine tıklayarak X ve Y koordinatlarını kaydedin. Aşamayı tekrar X/Y yönüne hareket ettirin ve yeni bir yatırım getirisi bulunana kadar ve koordinatları tekrar kaydederek artı işaretine tıklayın.

İstenilen bölge sayısı kaydedilene kadar devam edin. Hücrelerin odakta olup olmadığını bir kez daha kontrol edin, farklı kaydedilen X ve Y konumlarına tıklayarak ve deney boyunca kaydedilen Z-konumunun sabit kalması için AFC basılı tuşuna tıklayarak donanım otomatik odaklamasını başlatın. Mikroskop kontrol yazılımının Çok Boyutlu Alma sihirbazında zaman geçişi kaydını başlatın ve Acquire'a tıklayın.

Zaman geçişi kayıtlarındaki ilk birkaç zaman noktasından sonra hücrelerin hâlâ odakta olup olmadığını kontrol edin; böylece görüntülerin kalitesini en üst düzeye çıkarın ve gerekirse yeniden odaklayın.