Floresans görüntüleme ile bakteriyel protein dağılımının üç boyutlu görselleştirilmesi

Bakteriyel hücrelerin bulunduğu kapalı bir slaytla başlayın; sitoplazmik kırmızı floresan belirteç ve proteine özgü yeşil floresan işaretleyici ile işaretlenmiştir.

Slaytı floresans mikroskobu altında gözlemleyin.

İyi izole edilmiş bakteri hücrelerinin bulunduğu bir alanı bulun ve temsil bir hücrenin merkezine odaklanın.

İlk floresans kanalını ayarlayın ve temsil hücrenin ve yakınındaki hücrelerin üç boyutlu şeklini yakalamak için belirli parametrelerde bir z-stack görüntüsü alın.

Sonra, ikinci floresan kanalına geçin ve aynı parametrelerle aynı hücrelerin başka bir z-stack görüntüsünü alın.

Hücreler içindeki bakteriyel proteinlerin dağılımını yakalar.

Her z-yığından tek hücre analizi için ayrı hücreleri kırpın.

Bu görüntüleri, bakteriyel proteinlerin hücre şekline göre dağılımını görselleştirecek şekilde hizalamak, böylece konak-patojen etkileşimleri sırasında hassas analiz yapılmasını sağlar.

Kapak kapağı mühürlendikten hemen sonra, sürgü bir mikroskop aşamasına yerleştirilir ve beş dakikalık termal denge süresinden sonra mikroskop odak tekerleklerini kullanarak hücrenin ortasını odaklaştırır. ND Acquisition altındaki ilgili mikroskop yazılımında, Z kutusunu işaretleyerek Z yığını alın ve Ana butonuna tıklayarak hücrenin ortasını başlangıç noktası olarak ayarlayın. Step boyutunu 0.1 mikrometre, Aralığı dört mikrometreye ayarlayın ve Z Cihazının Piezo aşamasına ayarlandığından emin olun.

Hücrenin hem üst hem de alt kısmında yeterli bir bulanıklık olması kritik öneme sahiptir ki hücre arka plandan neredeyse ayırt edilemez olsun. Lambda penceresinin altındaki floresan kanalları görüntülenen floresan moleküllerin ayarlarına ayarlayın ve deney sırasının lambda olarak ayarlandığını doğrulayın, böylece her renk kanalında tam bir Z yığını elde edilecek, geçiş öncesi. Sonra, görüntü edinmeye başlamak için Şimdi Çalıştır seçeneğine tıklayın.

Tüm görüntüler alındıktan sonra, dosyaları uygun bir görüntü analiz yazılımında açın. Bir hücrenin etrafına bir kutu çizin ve o hücreyi iki kez, her kanal için bir kez çoğaltın, böylece Duplicate hyperstack kutusunun işaretlendiğinden emin olun ve kanalı bir ya da iki olarak değiştirin. Her iki yığın da kullanılabilir olduğunda, Resimler, Yığınlar, Araçlar ve Birleştirme seçeneklerini seçerek görüntüleri birleştirebilirsiniz.