JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 3:48 dk. • February 26th, 2026
Vibrio cholerae'nin antibiyotik dirençli suşuyla enfekte olmuş yetişkin bir zebra balığıyla başlayın. Bu patojenik bakteri, β-galaktosidaz enzimini ifade eder ve bağırsak yolunu kolonileştirir.
Balığı toplayıp aşırı doz anestezi içeren bir çözeltiye aktararak ötenazi yapın.
Balığın ventral tarafını yukarı koyun ve iğnelerle sabitleyin.
Karın bölgesini dezenfekte edin, uzunlamasına bir cilt kesisi ve başa doğru iki yan kesi yapın, ardından deriyi iğneleyerek bağırsak yolunu açığa çıkarın.
Traktı, cam boncuklarla dolu soğuk tampon içeren bir homojenleştirme tüpüne aktarın.
Cam boncukların dokuyu bozup bakterileri serbest bırakmasına izin vererek tahrik ile inkübe yapın.
Homojenatı seri olarak seyreltirin, ortama kaplama yapın ve kuluçka yapın. Ortam, kromojenik β-galaktosidaz substratı ve kirleticileri ortadan kaldırmak için bir antibiyotik içerir.
Bakteriler, kromojenik substratı hidrolize eden β-galaktosidaz enzimini ifade eder ve mavi pigmentli kolonilerin oluşumuna yol açar.
Bağırsak bakteri yükünü tahmin etmek için kolonileri sayın.
Deney istenen son noktaya ulaştığında, tanı amaçlı enfeksiyon suyundan 15 mililitre örnek alın. Sonra balıkları topla ve enfekte suyu uygun şekilde bertaraf et. Ventral tarafı yukarı doğru konumlandırın ve gövdeyi alt çeneden bir pim ile anüsün hemen arkasında başka bir pimle sabitleyin.
Her iki pimi gövdeden uzaklaştırın. Sonra, balığın ventral yüzeyini %70 etanol ile silin. Sonra, %70 etanol ve alev kullanarak bir neşter ve Vannas makaslarını sterilize edin.
Şimdi, skarını kullanarak karnında pulları nüfuz eden ama sadece deri kadar derin kesen küçük bir uzununa kesik açın. Sonra, makasla kesiyi vücut boyunca dikkatlice uzatın, cilt seviyesinden derin kesin. Anüsü kesmekten kaçının.
Sonra açılışı genişletmek için başa doğru iki yan kesik yapın. Sonra, yan kesilerin her iki tarafındaki deriyi diseksiyon yüzeyine sabitleyin, iğneleri vücuttan uzaklaştırarak dışarı doğru eğin. Bağırsak sistemi artık çok ince, soluk bir tüp olarak görünür olmalıdır.
Şimdi, iki çift alevle sterilize edilmiş pensis kullanarak tüm bağırsak traktını dikkatlice çıkarabilirsiniz; bu sistem oldukça hassas olabilir. Dokuyu cam boncuklar ve bir mililitre soğuk tampon içeren bir homojenizasyon tüpüne aktarın. Sonra, metin protokolünde tanımlandığı gibi dokuları homojenleştirin ve bağırsak kolonizasyon seviyelerini niceleştirin.
Sonra, bağırsak homojenatı ve tamponu seri seyreltmeleri yapın. Her balık için, bir mililitre hacimde beş veya altı on katlık seyreltme hazırlayın. Karışım için tüpleri vortex ile tutuyorum.
Daha sonra, streptomisin ve X-gal içeren LB agar plakalarına her seyreltmeden 100 ila 200 mikrolitre plaka ekleyin. Plakaları 30 derece Celsius'ta 16 ila 18 saat boyunca kuluçka edin. Gece kuluçkasından sonra, plakalarda V. cholerae kolonilerini sayın.
Bu bakteriler genellikle X-gal ile LB ortamında soluk mavi koloniler üretir.