Kronik bağırsak enfeksiyonu fare modelinde doku bakteriyel yükünün nicelendirilmesi

Kronik bağırsak enfeksiyonunu modelleyen antibiyotiklere dirençli bakteriyel suşla enfekte edilmiş ötenazi edilmiş bir fareyle başlayın.

Karın boşluğunu açığa çıkararak çekum ve dalağa ulaşın.

Bağırsak ve sistemik bakteriyelleşme bölgelerini temsil eden çek ve dalak dokularını toplayın.

Her dokuyu bir tampon ve çelik boncuk içeren ayrı bir tüpte yerleştirin.

Tüpleri hızla karıştırarak dokuyu homojenleştirin; böylece çelik boncuklar dokuya çarpmasına, parçalanmasına ve bakterilerin süspansiyona salınmasına neden olur.

Bakteri konsantrasyonunu azaltmak için tampon içindeki homojenatların seri seyreltilmesi uygulanır.

Her seyreltmeden alınan plaka aliquotları besin agara ve antibiyotikle takviye edilip antibiyotik dirençli bakterileri seçici olarak geri kazandırılır.

Plakaları kuluçkaya geçirerek canlı bakterilerin kolonilere dönüşmesini sağlar.

Kolonileri sayarak bir gram doku başına canlı bakteri sayısını tahmin edin ve sekum ile dalaktaki bakteri yüklerini karşılaştırın.

Öncelikle, 2 mililitrelik güvenli kilitli yuvarlak tabanlı mikrotüpler yerleştirin, her tüpte 1 mililitre steril PBS ve otoklavlanmış paslanmaz çelik boncuk ekleyin. Tüpleri doku toplamadan önce önceden tartın.

Fareleri ötenazi yaptıktan sonra, çek ve dalak dokularını rezeksiyon edin, bireysel hayvanlardan doku ayrı tüplere topladığınızdan emin olun. Her tüpü tartılı olarak doku ağırlıklarını belirleyin.

Dokuları 30 hertz'te 15 dakika boyunca homojenleştirmek için bir mikser frezen cihazı kullanın. Sonra, 96 kuyruklu 2 mililitrelik mega blokun her kuyusuna 900 mikrolitre PBS aktarın. 100 mikrolitre doku pipetle ilk kuyuya homojen olur ve iyi karıştırılır.

Sonraki kuyulara 100 mikrolitre ekleyerek seri seyreltmeler yapın, ta ki negatif altıncı 10'a kadar bir sulandırma elde edilene kadar. Her seyreltmeden 10 mikrolitre üç parça halinde plaka Streptomisin içeren LB agar'a yapılır. Sonra, ortalama koloni oluşum birimlerini sayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi doku başına koloni oluşum birimlerini belirleyin.