Gram-negatif bakterilerden sferoplastların üretimi

Hücre bölünmesini engelleyen bir antibiyotik içeren ortamı ele alalım.

Onu çubuk şeklinde, Gram-negatif bakterilerle aşılayın.

Sallama ile kuluçka yapın.

Antibiyotikin varlığında bakteriler bölünmeden büyümeye devam eder ve uzun filamentler oluşturur.

Kültürü toplayıp düşük sıcaklıkta santrifüj edin. Süpernatantı atın ve lifleri lizisi önlemek için bir sakroz çözeltisiyle yıkayın.

Sakaroz çözeltisini atın.

Bir tampon ekleyin, ardından enzimler ve EDTA ekleyin. EDTA, dış zarı zayıflatarak lizozimin girmesine ve peptidoglikan tabakasına parçalanmasına izin verir.

Bu, hücre duvarını kaldırır ve bakteri hücresinin küçülmesine izin verir. DNase I, hücrelerden salınan kromozomal DNA'yı koparır ve hücre tokelemesini önler.

Hücrenin suyu çekmesini sağlamak için hafif bir girdabla hipotonik bir çözelti ekleyin.

Esnek zarlar, hücrenin sferoplast adı verilen küresel bir şekil almasını sağlar.

Sferoplastları içeren bir aliquot'u iki tüpte soğuttulan izotonik çözelti ile aktararak sferoplastları stabilize edin.

Gram-negatif E.coli sferoplastları hazırlamak için, gece kültürünü 25 mililitrelik bir şişede 25 mililitre TSB ile 1'e 100 oranında seyreltin ve bakteriyi tekrar 2,5 saat boyunca sarsıntı kuluçka makinesine geri gönderin. Çözelti 600 nanometrede 0,5 ila 0,8 optik yoğunluğa ulaştığında, kültürü yeni 250 mililitrelik bir şişede taze TSB'de bire on oranında seyreltirin ve ikinci 2,5 saatlik kuluçka ile son etkili konsantrasyon her mililitre 60 mikrogram sefaleksin olur.

Yaklaşık 50 ila 150 mikrometre uzunluğunda tek hücreli filamentler üretmek, ışık mikroskobu altında 1000x büyütmede görselleştirilmiştir. Bakteriyel çözeltiyi santrifüjle ederek filamentleri toplayın ve süpernatantı boşaltın. Filamentleri, bir mililitre 0.8 molar sukroz ekleyerek yıkayarak peletin rahatsız edilmemesine dikkat edin.

Bir dakika sonra, süpernatantı pelleti rahatsız etmeden atın ve belirtilen reaktifleri filamentlere sıralarına göre ekleyin. Oda sıcaklığında on dakika sonra, bir dakika boyunca bir mililitre A çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi elle nazikçe çevirin. Çözeltiyi oda sıcaklığında dört dakika kuluçkaya geçirin, ardından filament süspansiyonunu, içinde dört derece Celsius çözeltisi B içeren iki mililitre 15 mililitrelik konik tüp arasında iki eşit aliquot olarak bölünün. Sonra, filamentleri santrifüjle pellet edin ve serolojik pipet kullanarak süpernatantın bir ila iki mililitresi hariç hepsini dikkatlice çıkararak pelletleri rahatsız etmeden çıkarın.

Pelletleri nazikçe yeniden süsküye almak için p1000 mikropipeti kullanın. Örnekte küçük bir aliquot sferoplast oluşumu için ışık mikroskopisiyle kontrol edin. Sferoplast daha sonra bir haftaya kadar veya üç dondurma çözülme döngüsünden geçene kadar -eksi 20 derece Celsius'ta saklanabilir.