JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 3:47 dk. • February 26th, 2026
Biyofilm oluşturan bir bakterinin süspansiyonlarını içeren iki cam tabanlı mikro tabak ile başlayın.
Tedavi kabı aktif sinyal bozucu bir enzim içerirken, kontrol inaktive edilmiş enzimi içerir.
Tabakları kapatın ve mikrotabak yüzeyine bakteriyel yapışmasını sağlamak için kuluçka yapın.
Yapışmayan hücreleri temizlemek için yıkayım, ardından enzimleri içeren taze ortam sokup kuluçka yapın.
Kontrol kabında, bakteriler sinyal molekülleri aracılığıyla iletişim kurar ve ekstrahücre polimerik maddeler (EPS) üreterek bir biyofilm oluşturur.
Aktif enzim, sinyal moleküllerini bozar, işlevlerini bozar ve biyofilm oluşumunu azaltır.
Taze ortamla yenileyin ve enzimin biyofilm bozucu etkilerini güçlendirmek için daha fazla kuluçka yapın.
Ortamı çıkarın, floresan etiketli lektinler ekleyin ve lektinin EPS'ye bağlanmasını sağlamak için kuluçka yapın.
Bağlanmamış lektin çıkarmak için yıkayın.
Biyofilm mimarisini korumak için bir fiksantif ile kuluçka yapın, sonra kabı durulayın.
Biyofilm oluşumunun enzim aracılı baskılanmasını değerlendirmek için konfokal mikroskopik görüntüler alın.
A. baumannii S1 biyofilmlerinin konfokal lazer tarama mikroskopisini (CLSM) yapmak için, LB içinde 30 derece sıcaklıkta 16 saat boyunca sallanan kuluçka makinesinde 5 mililitrelik A. baumannii S1 kültürü yetiştirilecektir. A. baumannii S1'in kültürünü 0.8'likOD 600'e ayarlayın.
Sonra kültürü 1 ile 100 arasında seyreltmek için mililitrede 1,2 miligram saflaştırılmış GKL enzimi içeren taze LB kullanın ve 35 mililitrelik cam tabanlı mikrotabağa 1 mililitre ekleyin. Mikroçağı bir kapla kapatıp 10 litrelik plastik bir kaba koyup kapı kapatıp 30 derece Celsius'ta üç saat kuluçka geçirin. Ortamı nazikçe çıkardıktan sonra, 30 mikrolitre saflaştırılmış GKL enzimi içeren 1 mililitre taze ortam ekleyin, ardından 30 derece Celsius'ta 21 saat daha kuluçka yapın.
Ortamı ikinci kez nazikçe çıkarın ve yerine taze ortamda 1 mililitre GKL enzimi daha ekleyin. 30 derece Celsius'ta 24 saat kuluçka yapın. İnkubasyondan sonra, ortamı nazikçe çıkarın ve HBSS'de çözünmüş Alexa Fluor 488 konjuge buğday tohumu agglütininin 500 mikrolitrelik mililitrede 5 mikrolitre ekleyin.
Mikroçağı 37 derece Celsius'ta 30 dakika kuluçka içinde geçirerek biyofilmleri boyandırın. Biyofilmleri sabitlemek için, HBSS'de çözünmüş %3,7 formaldehit 500 mikrolitre ekleyin ve 37 derece Celsius'ta 30 dakika kuluçka yapın. Mikrokapı bir kez yıkamak için 2 mililitre HBSS kullanın, ardından çözeltiyi tamamen çıkarın.
CLSM görüntülemeden önce kabı 4 derece Celsius sıcaklığında karanlıkta sakla. CLSM görüntüleme ve analizi için, 63 X hedefi kullanarak her görüntü başına 97 yığın üretir, her yığın başına 0,21 mikron aralık olur.