Name: Rekombinant RBD tabanlı SARS Aşılar için Protokol: Protein hazırlanması, Hayvan Aşılama ve Nötralizasyon Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Öğrenin, SARS'a karşı rekombinant RBD aşısı geliştirme yöntemini: 293T hücrelerinde protein ifadesi, fare aşılaması ve psödovirüs nötralizasyon testi ile bağışıklık yanıtını değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (RO1 AI68002) tarafından desteklenmiştir.

1. Rekombinant SARS-CoV RBD Protein Hazırlık <ol><li> Kalsiyum fosfat transfeksiyon reaktif hazırlayın <ol><li> 2X HBS tampon hazırlanması: 16 g NaCl, 0,4 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O ve Hepes 13,0 g birlikte karıştırın. PH 7.00 ayarlayın ve toplam hacmi 1000 ml distile su getirmek. Sterilizasyon, kısım için çözüm filtreleme ve -20 ° C&#39;de saklayın sonra İpucu: pH değerinin herhangi bir değişiklik transfeksiyon sonuçlarını etkileyebilir. Böylece, etrafında birkaç pH değerleri 7.00 (örneğin, 6.99, 7.00, veya 7.01) test etmek ve aşağıda tanıtılan yöntem kullanarak transfeksiyon için en uygun olanı bulmak için tavsiye edilir. </li><li> 2.5 M CaCl 2 hazırlık: 73.5 g CaCl 2 * 2H 2 O son hacim 200 mL distile su ekleyin. Filtre -20 ° C&#39;de çözüm ve mağaza </li></ol></li><li> Rekombinant plazmid transfeksiyon ve protein saflaştırılması <ol><li> Transfeksiyon 24 saat önce confluency 293T hücrelerin% 50-70 Böl. 40 ml DMEM FBS ve% 1 penisilin / Streptomisin (P / S) 37% 10 ısı ile inaktive edilmiş (HI) içeren ° C,% 5 CO 2 T-175 cm 2 doku kültürü şişeler hücrelerin büyütün . </li><li> Tüm transfeksiyon ayıraçları, önce oda sıcaklığına kadar transfeksiyon getirilmelidir. Bu reaktifler 2X HBS, 2.5M CaCl 2 dih 2 O, ve rRBD plazmid 6 içerir. İpucu: protein ekspresyonu kültür süpernatant ifade rekombinant proteinlerin salgılanmasını sağlamak için bir sinyal peptid içermelidir son rekombinant plazmid inşa. 6x Onun etiketi için kolay arıtma ifade protein C-terminal eklenebilir. </li><li> 50 ml (A) ve 15 ml (B) BD Falcon tüp hazırlanması ve Tablo 1&#39;de gösterildiği gibi tüplere reaktifler eklemek. Tüp B tüp A. 2X HBS tampon, 2.5M CaCl 2 eklemek ve plazmid rRBD ve dih 2 O. gereksinimi ses getirmek <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> A. Bir T-175 cm 2 doku kültürü balonuna (4000 mcL / şişesi): rRBD ifade hazırlanmak </td></tr><tr><td colspan="2"> Tüp A </td><td colspan="2"> Tüp B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 2000 mcL </td><td> 2.5M CaCl 2 </td><td> 200 mcL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> rRBD plazmid DNA </td><td> 40 mikrogram </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Dih 2 O </td><td> 2000 mcL </td></tr><tr><td colspan="4"> B. Bir 100-mm petri (1000 mcL / yemek): SARS pseudovirus üretim için hazırlamak </td></tr><tr><td colspan="2"> Tüp A </td><td colspan="2"> Tüp B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 500 mcL </td><td> 2.5M CaCl 2 </td><td> 50 mcL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> SARS-CoV S plazmid DNA </td><td> 5 mikrogram </td></tr><tr><td></td><td></td><td> (PNL4 3.luc.RE) HIV-1 plazmid </td><td> 5 mikrogram </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Dih 2 O </td><td> 500 mcL </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Transfeksiyon karışım hazırlama ve birimler Tablo 1&#39;de belirtilen miktarlar bir transfeksiyon ünitesi için. Daha fazla matara veya yemekler transfeksiyon için kullanılırsa, buna göre hacimleri ayarlayabilirsiniz. </li><li> Bir girdap sabit ve yumuşak bir karıştırma korurken, tüp damla damla bir şekilde bir tüp B DNA kalsiyum çözüm ekleyin. Karışımı 20-30 dakika oda sıcaklığında bekletin. Başarılı kalsiyum fosfat transfeksiyon için anahtar boyutu ve şekli, oluşan çökelti bağlıdır. Böylece, karışımın bir sonucu olarak, transfeksiyon etkinliğini arttırmak, bu gereksinimi karşılamak için sürekli ve yavaş yavaş vortekslenmiş ve olmalıdır. </li><li> 293T hücreleri (4000 mcL / balon) içine damla damla ve hatta bir şekilde karışımı ekleyin. 37 ° inkübatör Kültür hücreleri ° C,% 5 CO 2 . </li><li> Taze serum OPTI-MEM İndirgenmiş-Serum Orta (50 ml / balon) 8-10 saat sonrası transfeksiyon ile kültür ortamı değiştirin. Kültür hücreleri aynı durumun iki gün daha devam edin. </li><li> Süpernatant içeren ifade rRBD protein 72 saat sonrası transfeksiyon toplayın. Hücre enkaz kaldırmak için 6000 rpm&#39;de 15 dakika santrifüjleyin. 4 ° C gecede toplanan süpernatant ve mağaza proteaz inhibitörü kokteyl ekleyin. </li><li> Ertesi gün, Ni-NTA Superflow aşağıdaki üreticinin talimatlarına kullanarak kültür süpernatant rRBD rekombinant protein arındırmak. </li><li> Amicon Ultra -15 konsantrasyon tüpler kullanılarak proteinin saflaştırılmış konsantre ol. Protein konsantrasyonuPBS toplama tüplerine ekleyin ve imidazol elüsyon tampon kaldırmak için tekrar santrifüj. -80 ° C kullanana kadar az protein saflaştırılmış protein konsantrasyonu ve mağaza hesaplayın. </li></ol></li></ol> 2. Fare Bağışıklama ve Örnek Toplama <ol><li> 40-45 Pre-sıcak Sigma adjuvan sistemi (SAS) ° C ile üreticinin talimatlarına göre. Flakon başına 1 ml PBS ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Tablo 2&#39;de protokole göre protein-adjuvan emülsiyon hazırlayın. Pipet, 1.5 mL tüp içine rRBD protein hesaplanır. SAS adjuvan eşit hacim ve emülsiyon oluşturmak için 2-3 dakika boyunca kuvvetlice vorteks tüp ekleyin. İpucu: Tablo 2&#39;de belirtilen miktarlar bir fare. Hacimleri kullanılan gerçek fare numaralarına göre ayarlayın. Her grup için, her aşı için gerekli protein ve adjuvan karıştırın. Doğruluğunu sağlamak için aşılama için her zaman ekstra bir örnek hazırlamak. <table border="1"><tbody><tr><td> Grup </td><td> 1 st aşı (200 mcL / fare) </td><td> 2 nci aşı (200 mcL / fare) </td><td> 3 üncü aşı (200 mcL / fare) </td></tr><tr><td> rRBD protein </td><td> PBS içinde 20 mg protein (100 mcL) + 100 mcL SAS </td><td> PBS içinde 10 mg protein (100 mcL) + 100 mcL SAS </td><td> PBS içinde 10 mg protein (100 mcL) + 100 mcL SAS </td></tr><tr><td> PBS kontrolü </td><td> 100 mcL PBS + 100 mcL SAS </td><td> 100 mcL PBS + 100 mcL SAS </td><td> 100 mcL PBS + 100 mcL SAS </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Fare bağışıklama protokolü </li><li> Subkutan prime-bağışıklık kadın BALB / c farelerde (eski 4-6 hafta, 5 fare / grup) ve rRBD ve SAS ile iki kat artırmak gibi Tablo 2&#39;de gösterilmiştir. PBS grup kontrol olarak kullanın. Genellikle seçilen subkutan enjeksiyonlar için site, kürek kemikleri arasındaki gevşek deri. Alternatif olarak, ventral karın enjekte etmek kolaydır, çünkü yaygın olarak kullanılır, ve herhangi bir sızıntı enjeksiyon siteleri gözlemlemek olabilir. Tekrarlanan doz aşı kullanıldığında, potansiyel yerel deri reaksiyonları önlemek, çeşitli enjeksiyon siteleri seçmek kolaydır. </li><li> Her aşıdan sonra aşılama ve 10 gün önce 56 ° C&#39;de 30 dakika için tamamlayıcı inaktive anestezi ile retro-orbital, ısı ve sera ile fareler Bleed. Kullanana kadar -20 ° C&#39;de saklayın fare sera. </li></ol> 3. Nötralizasyon Algılama kullanarak Pseudovirus Nötralizasyon Testi <ol><li> SARS pseudovirus hazırlayın <ol><li> Transfeksiyon önce 100 mm doku kültürü petri kaplarına (2x10 6 hücre / yemek) 16 saat 293T hücreler Split, ve yukarıdaki gibi hücreleri büyümek. </li><li> Tablo 1&#39;de gösterildiği gibi transfeksiyon ayıraçları hazırlayın. Co-transfect plazmid kodlama SARS-CoV S protein ve plazmid kodlama Env kusurlu, lusiferaz-HIV-1 genom ifade (pNL4 3.luc.RE) kalsiyum fosfat transfeksiyon reaktifi kullanılarak. </li><li> 10 ml taze DMEM% 10 FBS ve% 1 P / S 8-10 saat sonrası transfeksiyon içeren orta değiştirin. Süpernatant içeren SARS pseudovirus 72 saat sonrası transfeksiyon toplayın. </li><li> 0.45 mikron filtre ile filtre pseudovirus. Kısım ve mağaza -80 ° C kullanana kadar. </li></ol></li><li> SARS pseudovirus nötralizasyon tayini <ol><li> 16 saat önce 96-iyi doku kültürü plakaları 4 cells/100 mcL / 10 SARS-CoV reseptörü ACE2 (ACE2/293T) ifade 293T hücreleri enfeksiyon Bölünmüş. </li><li> ACE2/293T hücrelerde virüs titresi tespit etmek için 2 kat SARS pseudovirus sulandırınız. </li><li> Seri 96-iyi doku kültürü plakaları fare sera sulandırmak ve titre SARS pseudovirus eşit miktarda ekleyin. 1 saat 37 ° C&#39;de plakaları Preincubate </li><li> ACE2/293T hücreleri inkübasyondan sonra, sera pseudovirus karışımı 100 mcL ekleyin ve 37 ° hücreler büyümeye devam ° C,% 5 CO 2 . Taze DMEM 24 saat sonra ekleyin. </li><li> Tamamen kültür süpernatantlar plakaları 72 saat enfeksiyon sonrası çıkarın. 1X lusiferaz hücre kültürü reaktifi (60 mcL / iyi) ekleyin ve oda sıcaklığında 1-2 saat süreyle sabit plaka titreme ile hücre parçalama teşvik. </li><li> Luminometre tabak içine transfer hücre ilginçtir (50 mcL / iyi) (Microfluor 96-kuyucuğu). Lusiferaz tahlil sistemi dahil lusiferaz substrat (50 mcL / kuyu) ekleyin ve Ultra 384 luminometre göreli lusiferaz aktivitesini algılar. </li><li> % 50 nötralizan antikor titresi (NT 50) 6 olarak SARS pseudovirus nötralizasyon titresi ve mevcut hesaplayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+large-scale+use+of+recombinant+VP2+vaccine+for+the+prevention+of+infectious+bursal+disease+of+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens.</a> Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).</li>
<li>Tait, A., Hall, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theileria+annulata%3A+control+measures%2C+diagnosis+and+the+potential+use+of+subunit+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines.</a> Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).</li>
<li>Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mouse%2C+guinea+pig+and+rabbit+models+for+evaluation+of+plague+subunit+vaccine+F1%2BrV270%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270.</a> Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).</li>
<li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension%3A+a+rapid+mammalian+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li>
<li>Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenicity+and+immunogenicity+of+SARS-CoV+S+protein+receptor-binding+domain+stably+expressed+in+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).</li>
<li>Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+expressed+in+mammalian%2C+insect+and+E.+coli+cells+elicits+potent+neutralizing+antibody+and+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity.</a> Virology. 393, 144-150 (2009).</li>
<li>Ambrosino, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+270+to+510+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+spike+protein+are+required+for+interaction+with+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor.</a> J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).</li>
<li>Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin-converting+enzyme+2+is+a+functional+receptor+for+the+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus.</a> Nature. 426, 450-454 (2003).</li>
<li>He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+induces+highly+potent+neutralizing+antibodies%3A+implication+for+developing+subunit+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).</li>
<li>Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+high+copy+number+plasmid+into+mammalian+cells+by+calcium+phosphate+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection.</a> Gene. 270, 61-68 (2001).</li>
<li>Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+activation+and+down-regulation+by+cationic+lipid+transfection+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents.</a> BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).</li>
<li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension%3A+a+rapid+mammalian+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li>
<li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca2%2B-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li>
<li>Jiang, M., Deng, L., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca%282%2B%29-phosphate+transfection+efficiency+enables+single+neuron+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis.</a> Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).</li>
<li>Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+safe+neutralization+assay+for+SARS-CoV+and+characterization+of+S-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein.</a> Virology. 326, 140-149 (2004).</li>
<li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li>
</ol>

Hücre yoğunluğu kalsiyum fosfat tabanlı transfeksiyon etkinliğini etkileyen önemli bir faktördür. Deneyimlerimize göre,% 70 daha az hücrelerin confluency en iyi sonuçları getiriyor. Böylece, transfeksiyon verimliliğini artırmak için, hücre yoğunluğu confluency, yaklaşık% 50-70 tutulması tavsiye edilir. Kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntem genellikle lipid transfeksiyon 16 gibi diğer transfeksiyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha az etkili olduğu düşünülmektedir. Ancak, bu protokolde, böylece Transfeksiyonu verimliliği artırmak, sürekli ve yavaş bir girdap transfeksiyon çözüm karıştırma uygun boyutu ve şekli ile bir çökelti oluşumunu sağlar böylece değiştirilmiş bir kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi kullandı.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2429</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;*2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12430</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Besiyeri</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitör kokteyli</td><td>Roche Group</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30450</td><td></td></tr><tr><td>Sigma adjuvan sistemi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6322</td><td></td></tr><tr><td>Lusiferaz assay sistemi</td><td>Promega Corp.</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>Lusiferaz hücre kültürü lizis reaktifi (5X)</td><td>Promega Corp.</td><td>E1531</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra - 15</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Microfluor 96 kuyucuklu plakalar</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>7905</td><td></td></tr><tr><td>Ultra 384 lüminometre</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinant rbd tabanlı sars aşılar için protokol: protein hazırlanması, hayvan aşılama ve nötralizasyon algılama

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Güvenlik profili ve enfeksiyonlara karşı güçlü bir bağışıklık yanıtları uyardığı yeteneği dayanarak, alt ünite aşıları 1-3 patojenleri geniş bir yelpazede aday olarak kullanılmaktadır. Memeli hücresi sistemi, böylece düzgün katlanmış ve glikozile proteinleri oluşturan, post-translasyonel değiştirme yeteneğine sahip olduğu için, memeli hücrelerinde ifade rekombinant proteinlerin yüksek antijenik ve immünojenite 4-6 korumak için en büyük potansiyel göstermiştir. SARS, 2004 yılından bu yana hiçbir yeni vaka bildirilmiş olmasına karşın, gelecekte salgınları sürekli bir tehdit ve bu nedenle, SARS-CoV karşı aşıların geliştirilmesi, ihtiyatlı bir önleyici adımdır ve yapılmalıdır. SARS-CoV S protein RBD reseptör bağlayıcı ve virüs enfeksiyonu 7-9 karşı spesifik nötralizan antikorlar indüksiyon önemli rol oynar. Bu nedenle bu protokol, RBD tabanlı altbirim SARS karşı aşı geliştirmek için yeni yöntemler açıklanmaktadır. Kısaca, rekombinant RBD protein (rRBD), uygun konformasyon ve yüksek immünojenite 6 ile doğru katlanmış bir protein elde etmek için, memeli 293T hücrelerinin kültür süpernatant ifade edildi. Hücrelere rekombinant plazmid kodlama RBD transfeksiyon sonra, bazı değişikliklerle birlikte kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi 6,10 kullanılarak gerçekleştirildi . Lipid transfeksiyon yöntemi 11,12 ile karşılaştırıldığında, bu değiştirilmiş kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi işlemek için ucuz, kolay ve uygun boyutu ve şekli ile transfeksiyon kompleksi 13,14 oluşur kez yüksek etkinliğini ulaşmak için bir potansiyele sahiptir. Son olarak, SARS pseudovirus nötralizasyon tayini protokol tanıttı ve sera rRBD protein ile aşılanan farelerin nötralize aktivite tespit etmek için kullanılır oldu. Bu testte, nispeten güvenli, bulaşıcı bir SARS-CoV dahil değildir ve bir biyogüvenlik-3 laboratuvar 15 gereksinimi olmadan yapılabilir . Burada açıklanan protokol aynı zamanda örneğin, HIV, respiratuar sinsisyal virüs (RSV), Ebola virüsü, grip virüsü gibi, Nipah ve Handra virüsler, tasarım ve diğer virüslere karşı rekombinant altbirim aşıları sınıf I füzyon proteinleri ile çalışma kullanılabilir. Buna ek olarak tüm bu virüslerin pseudovirus üreten ve daha sonra pseudovirus nötralizasyon tayini kurulması için yöntemler uygulanabilir.

Bu protokol, SARS karşı rekombinant reseptör-bağlayıcı etki alanı (RBD) tabanlı altbirim aşılar eğitim için genel bir yordam açıklanır. RBD 293T hücrelerinin protein, RBD ve fare sera kurulmuş bir SARS pseudovirus nötralizasyon tayini ile nötralizasyonu aktivitesi tespit ile farelerin bağışıklık transfeksiyon ve anlatım yöntemleri içerir.

Rekombinant RBD tabanlı SARS Aşılar için Protokol: Protein hazırlanması, Hayvan Aşılama ve Nötralizasyon Algılama

Güvenlik profilleri ve enfeksiyonlara karşı güçlü bağışıklık yanıtları oluşturma yetenekleri nedeniyle, subunit aşılar geniş bir... için adaylar olarak kullanılmıştır.

<a class="grey_button" href="/video/3351">
Çince
</a>

protocol-for-recombinant-rbd-based-sars-vaccines-protein-preparation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rift Vadisi ateşi virüs MP-12 aşı suşu için ters genetik sistemi ek MP-12 mutantlar artan zayıflama ve immünojenite oluşturmak için yararlı bir araçtır. Biz NSS mutant suşlar oluşturmak ve karakterize etmek için protokol açıklar.

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

Newcastle hastalığı virüsü (NDV) yaygın olarak, diğerleri arasında, aşı ve tedavi için yeni vektörler geliştirmek için, son birkaç yıl içinde incelenmiştir. Bu çalışmalar nedeniyle bu tür burada açıklandığı gibi rekombinant virüs cDNA'sından kurtarmak için teknikler, mümkün olmuştur.

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Bu çalışmada açıklar yüksek işlem hacmi, nötralize antikorlar respiratuvar sinsityal virüs (RSV) için belirli titresi belirlemek için görüntüleme tabanlı mikro-nötralizasyon tahlil. Bu tahlil biçimi farklı örnek türleri üzerinde test edilmiştir.

Bir geliştirilmiş ve yüksek üretilen iş respiratuvar sinsityal virüs (RSV) mikro-nötralizasyon tahlil

Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

Burada kuduz aşılarında immünojenik glikoprotein içeriğini belirlemek için dolaylı bir ELISA sandviç immünoyakalama açıklar. Bu test glikoprotein düzelticileri tanıyan nötralize monoklonal antikor (mAb-D1) kullanır. Üretim sırasında aşı potens tutarlılığını takip etmek için in vivo NIH testine alternatiftir.

In Vitro ELISA Testi Kuduz Aşısı Potens Değerlendirmek için

Aşı geliştirmede kullanılmak üzere kendi kendine biraraya gelen protein nano taneciklerinin (SAPN' ler) saflaştırılmasını, yeniden katlanması ve karakterizasyonu nun tanımlanmasını açıklayan ayrıntılı bir yöntem burada verilmiştir.

Trimerik Epitop Sunumu Gerektiren Aşılar için E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nano tanecikleri Üretimi

Plazmid DNA'sından rekombinant rotavirüslerin üretimi, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinin incelenmesi, rotavirüs ekspresyonu vektörleri ve aşılarının geliştirilmesi için gerekli bir araçtır. Burada, floresan muhabir proteinleri ifade eden suşlar da dahil olmak üzere rekombinant rotavirüsler imal etmek için basitleştirilmiş bir ters genetik yaklaşımını tanımlıyoruz.

Rekombinant Rotavirüsleri İyileştirmek Için Basitleştirilmiş Ters Genetik Yöntemi Muhabir Proteinleri İfade Ediyor

Mevcut protokol, dış zar veziküllerinin biyomühendisliğini, üretim, saflaştırma, biyokonjugasyon ve karakterizasyon dahil olmak üzere bir "Tak ve Göster" aşı platformu olarak tanımlamaktadır.

SARS-CoV-2 Reseptör Bağlama Etki Alanını Gösteren Dış Membran Veziküllerine Dayalı Bir "Tak ve Görüntüle" Nanopartikül Aşı Platformu

Metodoloji, sığır monosit kaynaklı dendritik hücrelerin (MoDC'ler) oluşumunu ve sığırlarda potansiyel veteriner aşılarının geliştirilmesi sırasında antijenik adayların in vitro değerlendirilmesi için uygulamalarını açıklamaktadır.

Sığır Monosit Kaynaklı Dendritik Hücreler Kullanılarak Aşı İmmünojenitesinin Belirlenmesi

Psödotipli virüsler (PV'ler), otantik virüsleri işlemekten daha güvenli koşullar altında konak-virüs etkileşimlerini incelemek için kullanılan replikasyon kusurlu virionlardır. Burada, SARS-CoV-2 PV'lerin COVID-19 aşılamasından sonra hastaların serumunun nötralize edici yeteneğini test etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteren ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Nötralizasyon Testi Yoluyla SARS-CoV-2'ye Karşı Humoral İmmün Yanıtları İzlemek İçin Moleküler Bir Araç Olarak Psödotiplenmiş Virüsler

Öğrenin, SARS'a karşı rekombinant RBD aşısı geliştirme yöntemini: 293T hücrelerinde protein ifadesi, fare aşılaması ve psödovirüs nötralizasyon testi ile bağışıklık yanıtını değerlendirin.

Rekombinant RBD tabanlı SARS Aşılar için Protokol: Protein hazırlanması, Hayvan Aşılama ve Nötralizasyon Algılama

Daha fazla video keşfet