Rekombinant RBD tabanlı SARS Aşılar için Protokol: Protein hazırlanması, Hayvan Aşılama ve Nötralizasyon Algılama

Bu prosedürde, SARS COV RBD proteinini eksprese eden rekombinant bir aşı hazırlanmakta ve bu aşının bir SARS psödovirüsüne karşı nötralize edici aktivite indükleme kapasitesi değerlendirilmektedir. İlk olarak, RBD proteini, transfekte edilmiş 2 9 3 T hücrelerinin kültür süpernatantından saflaştırılmış formda eksprese edilir. Saflaştırılmış protein daha sonra immünizasyon için kullanılır.

İmmün serumların nötralizasyon potansiyelini belirlemek amacıyla, immünizasyonu takiben çeşitli zaman noktalarında aşılanmış fareler ve serumları toplanır. Bir psödo virüs nötralizasyon testi gerçekleştirilir; rekombinant yöntemle üretilmiş lusiferaz eksprese eden sars psödo virüsü hazırlanır ve titre edilmiş fare serumu ile inkübe edilir. Ardından, nötralize edilen bu virüslerin SARS ko-reseptörü ACE eksprese eden hücreleri enfekte etme yeteneği, enfekte hücrelerdeki bağıl lusiferaz aktivitesi ölçülerek değerlendirilir.

%50 nötralize eden antikor titresi daha sonra hesaplanabilir. Benim adım tu. Şu an laboratuvarda doktora sonrası araştırmacıyım.

Psödovirüs nötralizasyon analizinin, canlı virüse dayalı nötralizasyon analizleri gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı, bu tekniğin nispeten güvenli olmasıdır. Enfeksiyöz bir SAR virüsü gerektirmez ve biyogüvenlik seviyesi üç olmayan bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygulamayı gösterecek olan kişi, laboratuvarımda SARS ve influenza gibi gelişmekte olan bulaşıcı hastalıklara karşı aşı geliştirme üzerine odaklanmış bir doktora sonrası araştırmacı olan DU'dur. Steril 2X HBBS tamponu (pH 7,2), 2,5 molar kalsiyum klorür ve RBD plazmid alikotlarını oda sıcaklığında çözdürün.

Çözeltiler çözündükten sonra, 50 mililitrelik konik tüpe iki mililitre iki XHBS aktarın; 15 mililitrelik bir tüpte 200 mikrolitre kalsiyum klorürü 40 mikrogram RBD plazmidi ile karıştırın. Steril beş mililitrelik bir pipet kullanarak hacmi oda sıcaklığındaki steril distile su ile iki mililitreye tamamlayın. Karışımı sabit ancak hafif bir vorteks altında tutarken, plazmid çözeltisini iki XHBS'ye damla damla ekleyin.

Yüksek transfeksiyon verimliliği için yeterli kıvamda bir çökelek elde etmek amacıyla, bu vorteks işleminin yavaş ve sürekli tutulması kritik öneme sahiptir. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bekletin. Bu inkübasyonun ardından, karışımı %50 ila %70 konfluens düzeyindeki 2 9 3 T hücrelerini içeren bir flaska damla damla ekleyin.

40 mililitre hücre kültür ortamı hacminde, transfeksiyon solüsyonunun eşit şekilde dağıtılması önemlidir. Transfeksiyon karışımını ekledikten hemen sonra ortamı karıştırın. Hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.

Sekiz ila 10 saatlik inkübasyonun ardından, hücre ortamının tamamını uzaklaştırın ve serumun sonraki protein saflaştırma aşamasına herhangi bir müdahalesini önlemek için bunu 50 mililitre taze serumsuz optimum, one ortamı ile değiştirin ve ardından hücreleri 37 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin. İki gün sonra, eksprese edilmiş RBD proteini içeren süpernatantı toplayın ve hücre döküntülerini uzaklaştırmak için 6.000 RPM'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücreler çöktürüldükten sonra, süpernatantı taze bir tüpe aktarın ve proteaz inhibitör kokteyli ekleyin.

Protein degradasyonunu önlemek için, hasat edilen süpernatanttan RBD rekombinant proteinini saflaştırmak amacıyla üretici talimatlarını takip ederek nikel NTA super flow kullanın. RBD proteinini 250 millimolar ole içeren tampon ile elüye edin. Ardından, Emon Ultra 15 tüpleri kullanarak, OLE içeren saflaştırılmış proteini dört degrees Celsius'ta 3000 RPM'de yaklaşık 15 dakika santrifüj ederek konsantre edin. Akış kısmını atın.

RBD konsantrasyon tüplerine PBS ekleyin ve 4 °C'de 3000 RPM'de 20 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Tüm kalıntıların tamamen uzaklaştırıldığından emin olmak için saflaştırılmış protein şimdi PBS içinde çözülecektir; proteini temiz bir 1,5 mL'lik EPR tüpüne pipetleyin.

Son olarak, boş olarak PBS kullanarak bir NanoDrop ile saflaştırılmış proteinin konsantrasyonunu hesaplayın ve örneği -80 °C'de saklayın. İlk olarak, bir viyol Sigma adjuvan sistemine 1 mL steril PBS ekleyin. 40 ila 45 °C'deki bir su banyosunda ön ısıtma yapın ve viyolu iki ila üç dakika boyunca iyice vorteksleyin.

Ardından, 1.5 mililitrelik bir eppendorf tüpünde protein adjuvan emülsiyonunu hazırlayın. PBS içinde seyreltilmiş çözünmüş saflaştırılmış proteinden istenilen miktarı, eşit hacimdeki adjuvan sistemi ile karıştırın ve iki ila üç dakika boyunca kuvvetlice vortekslayin. Ayrıca, adjuvanı sadece PBS ile karıştırarak kontrol emülsiyonları hazırlayın. Deri altına.

Dört ila altı haftalık en az beş BC faresine, doz başına 20 micrograms protein içeren başlangıç immünizasyon karışımından veya kontrol emülsiyonundan 200 microliters enjekte edin; bu işlem ilk inokülasyonu takip eden 21. günde deri altına uygulanmalıdır. Son hacmi 200 microliters olan ve her biri 10 micrograms protein içeren hatırlatma dozlarını enjekte edin. Her fareden başlangıç immünizasyonu öncesinde ve her aşılamadan 10 gün sonra kan örnekleri toplayın ve izole edilen serumu ısıtma işleminin ardından minus 20 degrees Celsius'ta saklayın.

Transfeksiyondan 16 saat önce, kompleman 56 °C'de 30 dakika boyunca inaktive edilir. 293T hücreleri, her kapta 2 milyon hücre yoğunluğunda olacak şekilde 100 mm'lik doku kültürü kaplarına ekilir. Transfeksiyon reaktifi daha önce açıklandığı şekilde hazırlanır ve hücreler, SARS-CoV S proteinini kodlayan bir plazmid ile ENV defektif lusiferaz ekspres eden HIV-1 genomunu kodlayan başka bir plazmid ile birlikte kotransfekte edilir. Transfeksiyondan 8 ila 10 saat sonra.

Besiyeri, %10 serum içeren 10 mililitre taze DMEM besiyeri ile değiştirildi ve ardından hücreler inkübatöre geri yerleştirildi. İki gün sonra, SARS psödovirüsü içeren süpernatan toplandı. Hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için süpernatan 0,45 mikronluk bir şırınga filtresinden geçirildi ve virüs alikotlara ayrıldı.

Hemen kullanın veya çok kanallı pipet plakası kullanarak ileriye dönük kullanım için -80 °C'de dondurun. 96 kuyucuklu doku kültürü plağında, kuyucuk başına 100 µL'de 10.000 hücre konsantrasyonunda SARS-CoV reseptörü ACE2 eksprese eden 293T hücrelerini ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 16 saat inkübe edin. Rekombinant lusiferaz eksprese eden SARS psödovirüsünü titre etmek ve ilk plakanın A ve B sıralarındaki nötralizasyon testi için uygun virüs konsantrasyonunu belirlemek amacıyla ayrı bir 96 kuyucuklu plaka kullanın.

Her kuyucuğa 150 µL %10 F-B-S-D-M-E-M ekleyin. Ardından, A1 ve B1 sıralarına 150 µL seyreltilmemiş virüs ekleyin ve birinci sıradaki kuyucuklardan bir sonraki sıradaki kuyucuklara 150 µL aktararak 11. sıraya kadar devam ederek iki katlı seri dilüsyonu çift paralel olarak gerçekleştirin. Son 150 µL'yi atın ve 12. sıraya virüs eklemeyin.

Seri dilüsyon işlemi tamamlanıp ACE 2 93 T hücreleri 16 saat boyunca inkübe edildikten sonra, virüs plakasının her kuyucuğundan 100 µL'yi hücrelerin bulunduğu plakanın karşılık gelen kuyucuğuna aktararak hücreleri enfekte edin. Virüslerin hücreleri enfekte etmesine izin vermek için hücreleri 37 °C'de iki gün boyunca inkübe edin. Plakayı bir ultra 3 84 lüminometrede okuyarak her kuyucuktaki enfeksiyon düzeyini belirleyin.

Enfeksiyon miktarı, lusiferaz aktivitesinin yoğunluğu ile orantılıdır. Relatif lusiferaz biriminin (RLU), 12. kolondaki sadece hücrelerin bulunduğu arka plan RLU değerinden yaklaşık bin kat daha fazla olduğu virüs konsantrasyonu, nötralizasyon analizinde kullanılacaktır. Nötralizasyonu önce ayrı bir 96 kuyucuklu plakada, çok kanallı pipet kullanarak kurun; birinci kolondaki kuyucuklara 150 µL %10 FBS'li DMEM ve diğer kolonlardaki kuyucuklara 120 µL ekleyin.

Ardından, test edilecek her bir fare serumundan üç µL'yi birinci sütundaki duble kuyucuklara ekleyin. Bu örnekte, ilk iki kuyucukta bir RBD immünize fareden alınan 50 kat dilüe edilmiş serum bulunmaktadır. Sonraki iki kuyucukta ikinci bir RBD immünize fareden alınan serum ve son dört kuyucukta ise iki kontrol PBS immünize hayvandan alınan serum yer almaktadır. Çok kanallı bir pipet kullanarak, birinci sütundaki tüm kuyucuklardan ikinci sütundaki kuyucuklara 30 µL aktarın ve bu işlemi 11. sütuna kadar tekrarlayarak serumun beş katlı seri dilüsyonunu gerçekleştirin.

Kalan 30 µL'yi atın ve 12. sütundaki kuyucukları serumsuz bırakın. Ardından, her birine kuyucuk başına 120 µL seyreltilmiş SARS psödovirüsü ekleyin. Fare serumundaki anti-RBD antikorlarının SARS psödovirüsüne bağlanıp onu nötralize etmesine izin vermek için plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Bu inkübasyonun ardından, her kuyucuktan 100 µL nötralize virüsü ilgili kuyucuklara aktarın. ACE2 eksprese eden 293T hücrelerini içeren 96 kuyucuklu plakayı kullanın. Enfeksiyonun gerçekleşmesi için hücreleri 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin; hücreler enfekte olduktan sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak süpernatantı uzaklaştırın ve yerine kuyucuk başına 100 µL taze besiyeri ekleyin.

Plakayı 37 °C'de 72 saat beklettikten sonra inkübatöre geri yerleştirin. Süpernatantı bir kez daha uzaklaştırın. Bu noktada, fare serumu tarafından nötralize edilmemiş tüm psödovirüslerin, çok kanallı bir pipet kullanarak hücreleri enfekte edebilmiş olması gerekir. Kuyucuk başına 60 µL lusiferaz hücre kültürü lizis reaktifi ekleyin.

Plakayı oda sıcaklığında bir çalkalayıcıya yerleştirin ve hücrelerin bir ila iki saat boyunca liz olmasını sağlayın. Hücreler liz olduktan sonra, hücre lizatlarının 50 µL'sini 96 kuyucuklu bir lüminometre plağına aktarın ve her kuyucuğa 50 µL lusiferaz substratı ekleyin. Plağı okumak ve farklı kuyucuklardaki bağıl lusiferaz aktivitesini değerlendirerek nötralize edilen virüs yüzdesini türetmek için 96 kuyucuklu plak modunda ve lüminesans ayarında bir ultra 3 84 lüminometre kullanın.

Bu veriler, elde edilen virüs nötralizasyon yüzdesinin, RBD ile immünize edilmiş farelerden alınan serum konsantrasyonu ile orantılı olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, PBS enjekte edilen hayvanlardan alınan serumlar, bu verilere göre hiçbir konsantrasyonda virüsü nötralize edememektedir. Virüsün %50'sinin nötralize edildiği NT 50 değeri veya serum titresi kolayca türetilebilir.

Bu prosedürü uygularken, deneylerin başarısı için özgüven ve sabrın temel olduğunu unutmamak önemlidir. Bu videoları izledikten sonra, rekombinant SARS aşısının memeli hücre alt kültürlerinde nasıl eksprese edileceği ve fare modellerinde nötralize edici antikor yanıtı oluşturma kapasitesinin nasıl belirleneceği konusunda daha iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.