Rekombinant RBD tabanlı SARS Aşılar için Protokol: Protein hazırlanması, Hayvan Aşılama ve Nötralizasyon Algılama

Bu prosedürde, SARS COV RBD proteinini eksprese eden rekombinant bir aşı hazırlanmakta ve bu aşının bir SARS psödovirüsüne karşı nötralize edici aktivite oluşturma yeteneği değerlendirilmektedir. İlk olarak, RBD proteini, transfekte edilmiş 2 9 3 T hücrelerinin kültür süpernatantından saflaştırılmış formda eksprese edilir. Saflaştırılmış protein daha sonra immünizasyon için kullanılır.

İmmün serumların nötralizasyon potansiyelini belirlemek amacıyla, aşılı farelerden immünizasyonu takip eden çeşitli zaman noktalarında fareler ve serumlar toplanır. Bir psödo virüs nötralizasyon testi gerçekleştirilir; rekombinant yöntemle üretilen lüsiferaz eksprese eden SARS psödo virüsü üretilir ve titrasyonu yapılmış fare serumu ile inkübe edilir. Ardından, nötralize edilen bu virüslerin SARS ko-reseptörü ACE eksprese eden hücreleri enfekte etme yeteneği, enfekte hücrelerdeki bağıl lüsiferaz aktivitesi ölçülerek değerlendirilir.

%50 nötralize eden antikor titresi daha sonra hesaplanabilir. Benim adım tu. Şu anda laboratuvarda postacıyım.

Psödovirüs nötralizasyon analizinin, canlı virüs tabanlı nötralizasyon analizleri gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı, bu tekniğin nispeten güvenli olmasıdır. Enfeksiyöz bir SARS virüsü gerektirmez ve biyogüvenlik seviyesi 3 olmayan bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Uygulama prosedürünü gösterecek olan kişim, laboratuvarımda SARS ve influenza gibi gelişmekte olan bulaşıcı hastalıklara karşı aşı geliştirme üzerine odaklanmış bir doktora sonrası araştırmacı olan Laying Due'dur. Steril 2X HBSS tamponu, pH 7,25 M kalsiyum klorür ve RBD plazmid alikotlarını oda sıcaklığında çözün.

Çözeltiler çözüldükten sonra, 50 mililitrelik konik bir tüpe iki mililitre 2X HBS aktarın; 15 mililitrelik bir tüpte 200 mikrolitre kalsiyum klorürü 40 mikrogram RBD plazmidi ile karıştırın. Steril beş mililitrelik bir pipet kullanarak, oda sıcaklığındaki steril distile su ile hacmi iki mililitreye tamamlayın. Plazmid çözeltisini, karışımı sabit ancak hafif bir vortekse tabi tutarken damla damla 2X HBS'ye ekleyin.

Yüksek transfeksiyon verimliliği için uygun kıvamda bir çökelek elde etmek adına, bu vorteks işleminin yavaş ve sürekli yapılması kritik önem taşır. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bekletin. Bu inkübasyonun ardından, karışımı %50 ila 70 konfluent 2 9 3 T hücreleri içeren bir flaska damla damla ekleyin.

40 mililitre hücre kültürü ortamı hacminde, transfeksiyon solüsyonunun eşit şekilde dağıtılması önemlidir. Transfeksiyon karışımını ekledikten hemen sonra ortamı karıştırın. Hücreleri 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatöre yerleştirin.

Sekiz ila 10 saatlik inkübasyonun ardından, tüm hücre besiyerini uzaklaştırın ve sonraki protein saflaştırma aşamasında serumun herhangi bir girişime neden olmasını önlemek için bununla 50 mililitre taze serumsuz optimum, bir besiyeri ekleyin ve ardından hücreleri 37 °C inkübatöre geri yerleştirin. İki gün sonra, eksprese edilmiş RBD proteini içeren süpernatantı toplayın ve hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için 6.000 RPM'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücreler pellete dönüştüğünde, süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve proteaz inhibitör kokteyli ekleyin.

Protein degradasyonunu önlemek için, hasat edilen süpernatandan rekombinant RBD proteinini saflaştırmak amacıyla üretici talimatlarını izleyerek nikel NTA super flow kullanın. RBD proteinini 250 millimolar ole içeren tampon ile elüe edin. Ardından, Emon Ultra 15 tüpleri kullanarak, OLE içeren saflaştırılmış proteini 4 °C'de 3000 RPM'de yaklaşık 15 dakika boyunca santrifüj ederek konsantre edin. Akış sıvısını atın.

RBD konsantrasyon tüplerine PBS ekleyin ve 4 °C'de 3000 RPM'de 20 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Ole'nin tamamen uzaklaştırıldığından emin olmak için, saflaştırılmış protein şimdi PBS içinde çözülecektir; proteini temiz bir 1,5 ml'lik EPR tüpüne pipetleyin.

Son olarak, boş örnek olarak PBS kullanarak bir NanoDrop ile saflaştırılmış proteinin konsantrasyonunu hesaplayın ve örneği -80 °C'de saklayın. İlk olarak, bir tüp Sigma adjuvan sistemine 1 mL steril PBS ekleyin. 40 ila 45 °C'deki bir su banyosunda ön ısıtma yapın ve tüpü iki ila üç dakika boyunca iyice vorteksleyin.

Ardından, 1,5 mililitrelik bir einor tüpünde protein adjuvan emülsiyonunu hazırlayın. PBS içinde seyreltilmiş, çözünmüş saflaştırılmış proteinden istenen miktarı, eşit hacimdeki adjuvan sistemi ile karıştırın ve iki ila üç dakika boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Ayrıca, adjuvanı sadece PBS ile karıştırarak kontrol emülsiyonlarını hazırlayın. Subkutan olarak.

Dört ila altı haftalık en az beş BC faresine, doz başına 20 µg protein içeren başlangıç immünizasyon karışımından veya kontrol emülsiyonundan 200 µL subcutaneous olarak enjekte edin. İlk inokülasyonu takip eden 21. günde, her biri 200 µL son hacimde 10 µg protein içeren booster dozları enjekte edin. Her fareden başlangıç immünizasyonundan önce ve her aşılamadan 10 gün sonra kan örnekleri toplayın ve izole edilen serumu ısıl işlem sonrası -20 °C'de saklayın.

Transfeksiyondan 16 saat önce kompleman 56 °C'de 30 dakika boyunca inaktive edilir; 293 T hücreleri 100 mm'lik doku kültürü kaplarına kap başına 2 milyon hücre yoğunluğunda ekilir. Transfeksiyon reaktifi daha önce açıklandığı şekilde hazırlanır ve hücreler, SARS-CoV-2 S proteinini kodlayan bir plazmit ve ENV defektif lusiferaz eksprese eden HIV-1 genomunu kodlayan bir başka plazmit ile birlikte ko-transfekte edilir. Transfeksiyondan 8 ila 10 saat sonra.

Besiyeri, %10 serum içeren 10 mililitre taze DMEM besiyeri ile değiştirildi ve ardından hücreler inkübatöre geri yerleştirildi. İki gün sonra, SARS psödovirüsü içeren süpernatant hasat edildi. Hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için süpernatant 0,45 mikronluk bir şırınga filtresinden geçirildi ve virüs alikotlandı.

Hemen kullanın veya çok kanallı pipet plakası kullanarak gelecek kullanım için -80 °C'de dondurun. SARS COV reseptörü ACE2 eksprese eden 2 9 3 T hücrelerini, 96 kuyucuklu doku kültürü plağına her kuyucukta 100 µL başına 10.000 hücre konsantrasyonunda ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 16 saat inkübe edin. Rekombinant lusiferaz eksprese eden SARS psödovirüsü titrasyonu yapmak ve ilk plağın A ve B sıralarındaki nötralizasyon analizi için uygun virüs konsantrasyonunu belirlemek amacıyla ayrı bir 96 kuyucuklu plak kullanın.

Kuyucuk başına 150 µL %10 F-B-S-D-M-E-M ekleyin. Ardından, A1 ve B1 sıralarına 150 µL seyreltilmemiş virüs ekleyin ve birinci sıradaki kuyucuklardan bir sonraki sıradaki kuyucuklara 150 µL aktararak 11. sıraya kadar duble seri iki katlı seyreltme işlemini gerçekleştirin. Son 150 µL'yi atın ve 12. sıraya virüs eklemeyin.

Seri dilüsyon gerçekleştirilip ACE 2 93 T hücreleri 16 saat boyunca inkübe edildikten sonra, virüs plakasındaki her bir kuyucuktan 100 µL'yi, hücrelerin bulunduğu plakanın karşılık gelen kuyucuğuna aktararak hücreleri enfekte edin. Virüslerin hücreleri enfekte etmesine izin vermek için hücreleri 37 °C'de iki gün boyunca inkübe edin. Plakayı bir ultra 3 84 lüminometre ile okuyarak her bir kuyucuktaki enfeksiyon seviyesini belirleyin.

Enfeksiyon miktarı, lusiferaz aktivitesinin yoğunluğu ile orantılıdır. Relatif lusiferaz biriminin, 12. sütundaki hücrelerin tek başına oluşturduğu arka plan RLU'sundan yaklaşık bin kat daha fazla olduğu virüs konsantrasyonu, nötralizasyon analizinde kullanılacaktır. Nötralizasyonu, önce ayrı bir 96 kuyucuklu plakada, çok kanallı pipet kullanarak; birinci sütundaki kuyucuklara 150 µL %10 F-B-S-D-M-E-M ve diğer sütunlardaki kuyucuklara 120 µL ekleyerek hazırlayın.

Ardından, test edilecek her bir fare serumundan üç mikrolitreyi birinci sütundaki çift kuyucuklara ekleyin. Bu örnekte, ilk iki kuyucuk RBD ile bağışıklanmış bir fareden alınan 50 kat dilüye edilmiş serum içermektedir. Sonraki iki kuyucuk ikinci bir RBD bağışıklanmış fareden alınan serum içermektedir ve son dört kuyucuk ise iki kontrol PBS bağışıklanmış hayvandan alınan serum içermektedir. Çok kanallı bir pipet kullanarak, birinci sütundaki tüm kuyucuklardan ikinci sütundaki kuyucuklara 30 mikrolitre aktararak ve bu işlemi 11. sütuna kadar tekrarlayarak serumun beş katlı seri dilüsyonunu gerçekleştirin.

Kalan 30 µL'yi atın ve 12. sütundaki kuyucukları serumsuz bırakın. Ardından, her bir kuyucuğa 120 µL seyreltilmiş SARS psödovirüs ekleyin. Fare serumundaki anti-RBD antikorlarının SARS psödovirüsüne bağlanmasını ve onu nötralize etmesini sağlamak için plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Bu inkübasyonun ardından, her kuyucuktan 100 µL nötralize edilmiş virüsü, ACE2 eksprese eden 293T hücrelerini içeren 96 kuyucuklu plakanın karşılık gelen kuyucuklarına aktarın. Enfeksiyonun gerçekleşmesi için hücreleri 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin; hücreler enfekte olduktan sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak süpernatantı uzaklaştırın ve yerine kuyucuk başına 100 µL taze besiyeri ekleyin.

Plakayı 37 °C'de 72 saat beklettikten sonra inkübatöre geri yerleştirin. Süpernatantı tekrar uzaklaştırın. Bu noktada, fare serumu tarafından nötralize edilmemiş tüm psödovirüslerin, çok kanallı bir pipet kullanarak hücreleri enfekte edebilmiş olması gerekir. Kuyu başına 60 µL lusiferaz hücre kültürü lizis reaktifi ekleyin.

Plakayı oda sıcaklığında bir çalkalayıcıya yerleştirin ve hücrelerin bir ila iki saat boyunca liz olmasını sağlayın. Hücreler liz olduktan sonra, hücre lizatlarından 50 µL'lik miktarları 96 kuyucuklu bir lüminometre plağına aktarın ve her kuyucuğa 50 µL lüsiferaz substratı ekleyin. Plağı okumak ve farklı kuyucuklardaki bağıl lüsiferaz aktivitesini değerlendirerek nötralize edilen virüs yüzdesini belirlemek için, 96 kuyucuklu plak modunda lüminesans ayarına getirilmiş bir ultra 3 84 lüminometre kullanın.

Bu veriler, elde edilen virüs nötralizasyon yüzdesinin, RBD ile immunize edilmiş farelerden alınan serum konsantrasyonu ile orantılı olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, PBS enjekte edilen hayvanlardan alınan serumlar, bu verilere göre hiçbir konsantrasyonda virüsü nötralize edememiştir. Virüsün %50'sinin nötralize olduğu serum titresi olan NT 50 değeri kolayca türetilebilir.

Bu prosedürü uygularken, özgüven ve sabrın deneylerin başarısı için temel olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu videoları izledikten sonra, rekombinant SARS aşısının memeli hücre kültürlerinde nasıl eksprese edileceği ve fare modellerinde nötralize edici antikor yanıtı oluşturma kapasitesinin nasıl belirleneceği konusunda daha iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.