JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:06 dk. • March 31st, 2026
Hareketsiz, diseksiyonlu bir fare mesanesi ile başlayın; β-galaktosidaz eksprese eden üropatogenik E. coli ile enfekte olmuş, silikon kaplı çok kuyu bir plakaya yerleştirilir.
Mesanenin lümeni yukarıya bakarak hücre içi bakteriyel toplulukları (IBC) içeren epitel hücrelerini açığa çıkarır.
Mesanesi bir tampon ile yıkayarak kalıntıları ve ayrılmış bakterileri temizleyin.
Sonrasında, hücresel ve bakteriyel yapıları korumak için bir fiksatif ekleyin ve kuluçka yapın.
Fiksanti çıkarın ve bir tampon ile yıkayın.
Daha sonra, hücresel ve bakteriyel zarları geçirimlileştirmek için deterjan içeren bir tampon ile yıkayın.
Tamponu çıkarın, ardından β-galaktosidaz substratı olan X-gal çözeltisi ekleyin, redoks reaktifleriyle takviye edilip kuluçka yapın.
X-gal ve redoks reaktifleri bakteriye girer. β-galaktosidaz X-gal'ı parçalar ve redoks reaktifleriyle oksitlenerek mavi bir çökelti oluşturan renksiz bir ara madde oluşturur.
Bir diseksiya mikroskobu altında, mesanedeki mavi noktalar IBC'leri doğrular; bu da idrar yolu enfeksiyonunu gösterir.
IBC sayımı için, mesane hasat edildikten sonra, PBS içeren 6 kuyuklu bir plakanın silikon kaplı bir yuvasına yerleştirin ve makasla ikiye kesin.
En dış kenarlara yerleştirilen küçük metal pinler kullanarak, mesaneti nazikçe açarak lümenin yukarıya bakmasını ve maksimum miktarda üroteliumun ortaya çıkmasını sağlayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi LacZ boyama yapıldıktan sonra, diseksiyon mikroskobu altında mavi nokta şeklinde görünen IBC'leri gözlemleyin.