Biyofilm oluşumu sırasında gerçek zamanlı görüntüleme ve basınç takibi için mikrofluidik bir cihaz

Mikroskop aşamasına monte edilmiş bir mikrofluidik cihazla başlayın.

Cihaz, gözenekli bir ortamı taklit eden silindirik sütunlu bir mikrokanalı kapsayan polimer-cam bir montajdan oluşur.

Bir şırınga pompası, kültür ortamını filtreli bir şırınga aracılığıyla kanala ulaştırır; kanal ise çıkış borusu üzerinden atık konteynerine boşalır.

Kanala bağlı bir sensör kullanarak temel sıvı basıncını izleyin.

Çıkış borusunu bakteriyel süspansiyon içeren bir şişeye yerleştirin.

Akışı tersine çevirin, süspansiyon kanalı doldurana kadar filtre bakterilerin enjektöre girmesini engeller.

Bakteri hücrelerinin yüzeylere yapışması, çoğalması ve biyofilm oluşumunu başlatması için kuluçka kullanın.

Sonra filtreyi çıkarın ve çıkışı atık konteynerine geri döndürün.

Ortam akışına devam edin ve biyofilm büyüdükçe basıncı izleyin ve kanalı tıkadıkça izleyin.

Biyofilm büyümesini zaman içinde görselleştirmek için zaman geçişli mikroskobik görüntüler yakalayın. Biyofilm büyümesini basınç kaymalarıyla ilişkilendirerek gözenekli ortamda biyotıkanmayı incelemek.

Deneyden üç saat önce mikroskopun kutu kuluçka makinesini açarak 25 derece Celsius sıcaklığı stabil hale getirin.

Giriş ve çıkış borusunu mikrofluidik cihaza bağlayın. Boru ile şırınga arasındaki bağlantıyı, giriş borusuna 0,6 milimetre dış çaplı bir iğne yerleştirerek sabitleyin. Mikrofluidik cihazı, 30 mililitre deiyonize su ve 30 mililitre kültür ortamını vakum kurutucuya yerleştirin ve en az bir saat boyunca gazdan çıkarın.

Bittikten sonra, kültür ortamını ve deionize suyu yavaşça iki ayrı 30 mililitrelik şırıngaya çekin. Sonra, mikrofluidik cihazı mikroskopa monte edin ve çıkış borusunu bir atık konteynerine yerleştirin. Deiyonize su ile doldurulmuş şırıngayı mikrofluidik boru üzerinden mikrofluidik kanala bağlayın ve suyu yavaşça basınç sensörü çıkışından çıkana kadar enjekte edin.

Basınç sensörünü suyla doldurun ve mikrofluidik kanal ile basınç sensörünü bağlayan tüpten tüm kabarcıkları yıkayın. Basınç sensörünün çıkışını, basınç sensörüne ayrılmış vidalarla kapatın. Mikrofluidik kanalın geri kalanını deiyonize su ile doldurun.

Sonra, kültür ortamı şırıngasına 1.2 mikrometrelik bir filtre yerleştirin. Su şırıngasını çıkarın ve şırıngayı dikkatlice giriş mikrofluidik boruya bağlayın. Şırıngayı şırınga pompasına monte ettikten sonra, kanalı kültür ortamıyla saatte iki mililitre akış hızında bir saat boyunca yuyusun.

Daha sonra, deney sırasında şırınga pompasını istenen akış hızına ayarlayın ve basınç sensörlerinin basınç okumasını sıfıra ayarlayın. Sonra, 600 nanometre dalga boyunda 0,1 optik yoğunlukta Bacillus subtilis NCIB 3610 kültüründen 1,5 mililitre santrifüj şişesine pipetlenin. Bakteri kültürünü mikrofluidik kanala yüklemek için, çıkış tüpünü santrifüj şişesine yerleştirin ve tüpün çıkışındaki olası hava kabarcıklarını temizlemek için beş dakika bekleyin.

İşlem tamamlandıktan sonra, mikrofluidik kanal bakteriyel kültürle dolana kadar saatte 1 mililitre akış hızında 150 mikrolitre bakteriyel çözelti çekilin. Sonra, kültür ortamı şırıngası filtresini dikkatlice çıkarın ve çıkışı atık konteynerine yerleştirin. Bakteri hücreleri, yüzeylerinin gözenekli ortamda tutunmasına izin vermek için mikrofluidik kanalda üç saat boyunca sıfır akış koşullarında bırakın.

Deneyi başlatmak için, şırınga pompasını istenen akış hızına ayarlayarak akışı başlatın ve basınç okumasını 1 hertz'de başlatın, ardından büyüyen biyofilmlerin istenen zaman aralığı, optik konfigürasyon ve büyütme görüntülerini alın.