JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:43 dk. • March 31st, 2026
Dokunun kolonizasyonunu oluşturan ve lezyonlar oluşturan mühendislik yapımı Gram-pozitif bakterilerle enfekte edilmiş bir fare böbreğiyle başlayın.
Tüm bakteriyel hücreler kırmızı floresansı ifade ederken, lezyona özgü konak koşulları belirli hücrelerde yeşil floresan protein ekspresyonunu mümkün kılar.
Böbreği fiksatif ile tedavi edin ve doku yapısını korumak için karanlıkta kuluçkaya geçirin ve hücre zarlarını kısmen geçirimlileştirin.
Organı uygun bir ortama göm, dondur ve ince doku dilimlerine ayır.
Dilimi yapışması için şarjlı bir cam sürgüye yerleştirin.
Dokuyu nükleer boyayla boyayın.
Boya konak ve bakteri hücrelerine nüfuz eder ve DNA'ya bağlanır.
Dokunun üzerine bir örtü koyun, slaytı belirli görüntüleme kanallarıyla floresan mikroskopu altında gözlemleyin.
Nükleer boyama, konak ve bakteri DNA'sını sınırlar.
Dokudaki tüm bakteriler kırmızı floresansı ifade ederken, yeşil floresans ekspresyonu konak-patojen etkileşim yerini gösterir.
Uygun deneysel son noktada, böbrek, kalp, karaciğer, akciğer ve dalak %10 tamponlu formalin içeren 15 mililitrelik polipropilen tüplere alın ve oda sıcaklığında 24 ila 48 saat boyunca hafif sallanma veya döndürme ile inkubasyon yapılsın.
Fiksasyonun sonunda, organları -80 derece Celsius sıcaklıkta depolamak için şeffaf doku dondurma ortamına gömülür. 10 mikrometre kalınlığında doku kesitleri almak için kriyostat kullanın ve bölümleri önceden temizlenmiş, şarjlı cam slaytlarda karanlıkta 20 dakika boyunca kurutun, ardından DAPI ile takviye edilmiş sert montaj ortamı uygulayın. Sonra örtük örtüleri uygulayın ve slaytları gece boyunca oda sıcaklığında kürleyin, ardından örnekleri 4 derece Celsius'ta uzun süreli depoya aktarın.
Örneklerdeki lezyonları tespit etmek için, bir slayt bir lazer taramalı konfokal mikroskobunun sahnesine yerleştirilin ve bireysel hücrelerin görselleştirilmesi için uygun bir hedef kullanılarak lezyonların görüntülerini elde edin.