Bakterilerde Morfolojik Değişikliklerin Canlı Hücre Floresan Mikroskopisi Kullanılarak Görüntülenmesi

Bir bakteri kültürüyle başlayın, cam tabanlı bir tabada agaroz levha altında immobilize edilmiş.

Bakteriyel hücre zarları floresan bir boya ile etiketlenmiştir.

Bakteriler ayrıca, belirli bir mRNA'yı hedef alan ve temel hücre bölünme proteininin üretimini engelleyen antisens RNA ifade etmek üzere tasarlanmıştır.

Ters floresans mikroskobunun hedefine bir damla daldırma yağı ekleyin.

Çaneyi metal bir gövdeye yerleştirin ve mikroskop aşamasına sabitleyin.

Objektif yağ çanakla temas edene kadar yükseltin, sonra hücrelere odaklanın.

Birden fazla derinlikte görüntü yakalamak için Z-yığınlarını ayarlamak için görüntüleme yazılımı kullanın.

Floresans zaman geçişli görüntüler elde etmeye başlayın.

Hücreler antisens RNA ifadesine yanıt verdikçe bölünmez ve şişmiş şekiller geliştirirler.

Zar organizasyonu bozulur ve bu da dengesiz ve odaklı floresans ile sonuçlanır ve bu da kusurlu hücre bölünmesini gösterir.

Örneği görüntülemek için, mikroskopu mikroskop yazılımında başlatmadan önce hedefin tamamen aşağı indirildiğinden emin olmak için kaba ayar odak düğmesini kullanın. 100X yağ batırılma hedefine 1.517 kırma indisiyle bir damla bırakın ve numuneyi içeren cam taban kabını metal gövde tabutuna aktarın.

Çanı nazikçe sahne kelepçesine kaydırın ve kaba ayar düğmesini kullanarak objektif yağ çanak camının tabanına temas edene kadar kaldırın. Okulluk ve ince ayar düğmesini kullanarak örneği netleme hale getirin ve Kamera Modu'na geçin. Görüntüleme yazılımında Resolve 3D penceresinde Design/Run Experiment simgesini seçin.

Tasarım/Deneyi Çalıştır adlı yeni bir diyalog kutusu görünecek. Z yığınlarının sayısını ve örnek kalınlığını ayarlamak için diyalog kutusundaki Tasarım ve Bölümleme sekmelerini açın. Örnekteki hücrelerin kalınlığını ölçmek için, Resolve 3D diyalog kutusundaki yukarı ve aşağı oklarla Z-düzlemini kademeli olarak ayarlayın; böylece hücrelerin odak dışı olduğu yerler Görüntü Alımı için üst ve alt sınırlar olarak belirlenir.

Resolve 3D diyalog kutusunda seçilen kanallar için Işık Yoğunluğunun Yüzde Iletimi ve Pozlama süresini ayarladıktan sonra, Nokta Listesi'ni açmak için Nokta Listesi'ne tıklayın. Design ve Time Lapse sekmelerinde, Time Lapse (Time Lapse) işaret kutusunu seçin ve zaman geçişi parametrelerini girin. Visit Point listesi seçeneğini seçin ve metin kutusuna görüntülenecek noktaları girin; böylece noktaları virgül veya tire ile ile ayırarak tam dizileri elde edin.

Sonra, Çalıştır sekmesinde dosya adlarını ve dosya konumlarını düzenleyin ve deneyi başlatmak için Deneyi Başlat diyalog kutusundan Oynat'ı seçin.