Fare kalp dokusu bölümünde bakteri dolu mikrolezyonların görüntüleme için immünbojenlenmesi

Patojenik bir bakteri olan Streptococcus pneumoniae ile enfekte edilmiş bir fareden kimyasal olarak sabitlenmiş bir kalp dokusu kesitini içeren bir slaytla başlayın.

Bu enfeksiyon, kalp kaslarında ekstrahücresel, bakteri dolu mikrolezyonların oluşmasına neden olur.

Bölümü bir tamponla yıkayarak kalan fiksatifleri çıkar.

Konak hücre zarlarını geçirimlileştirmek için iyon olmayan bir deterjan uygulayın.

Kalan deterjanı temizlemek için tekrar yıkayın.

Bölümü, spesifik olmayan bağlanma bölgelerini engellemek için bir bloklayıcı ajanla inkübe yapın.

Bağlanmamış engelleyici maddeyi çıkarmak için durulayın.

Bakterinin kapsül polisakkaridine bağlanan birincil bir antikor ekleyin.

Bağlanmamış antikoru çıkarmak için yıkay, ardından birincil antikora bağlanan yeşil florofor etiketli ikincil antikor ekleyin.

Konak hücre çekirdeklerini etiketlemek için nükleer boyayla karşı boya.

Bölümü yıkayın ve montaj ortamı ile monte edin.

Mikrolezyonlar içindeki etiketlenmiş bakterileri görselleştirmek için konfokal mikroskopi kullanarak bölümü gözlemleyin.

Pozitif yüklü cam slaytlarda 5 mikronluk bir kalp kesiti kullanarak, önce bölümleri dondurun, sonra eritip hava kurumasına izin verin. Slaytları %10 nötr tamponlu formalinde 25 derece Celsius'ta 10 dakika sabitleyin. Sonra, fiksatoru üç yıkama ve PBS ile her yıkamada beş dakika boyunca çıkarın.

Ardından dokuyu %0,2 Triton X-100 ile PBS içinde 15 dakika boyunca permeabilize edin. Deterjanı düz PBS'de üç yıkama daha ile çıkarın. Sonra, bir saat boyunca %10 keçi serumuyla PBS ile dokunun bloklanmasını yapın. PBS'de durulama yaptıktan sonra, bölümü 37 derece Celsius'ta iki saat boyunca antiserumla örtün. Negatif kontrolleri naif tavşan antiserumuyla tedavi edin.

Kalp dokusu XI İmmünoffloresan boyayı kolayca emdiği ve yüksek arka plan seviyelerine yol açtığı için, farklı antikor türlerinin kuluçka süresindeki konsantrasyonun optimize edilmesi gerekebilir.

İki saat sonra, anti-serumu PBS ile yıkayın. Sonra çözeltiyi ikincil bir antikorla değiştirin ve slaytların 37 derece Celsius'ta 30 dakika daha kuluçka olmasına izin verin. Şimdi, DAPI'yi mililitrede 5 miligram ile uygulayın ve slaytları PBS ile yıkayın. Son olarak, slaytları FluorSave'e monte edin ve konfokal mikroskopiyle görüntüleyin.