Biyofilm Matris Bütünlüğünü Değerlendirmek İçin Etanol Direnç Testi

Besin agar üzerinde yetiştirilen patojenik bakteri kaynaklı biyofilmleri ele alalım.

İşlenmemiş biyofilm, koruyucu bir hücre dışı matriks içinde yoğun şekilde paketlenmiş bakterileri içerir.

İnhibörü ile işlenmiş biyofilm, seyrek bir matriks içinde gevşek ilişkili hücreleri içerir.

Her biyofilmi ikiye böl, ardından bir yarısını kontrol amaçlı tamponla, diğer yarısını ise antimikrobiyal stres için etanole maruz bırakın.

Tedavi edilmemiş, etanole maruz kalan biyofilmde, yoğun matriks etanol difüzyonu azaltır ve hücre nüfuzunu sınırlar, böylece bakteriyel öldürme daha az olur.

İnhibörüyle işlenmiş ve etanole maruz kalan biyofilmde, seyrek matriks etanolün daha kolay nüfuz etmesini sağlar ve bu da bakteriyel öldürmeyi daha fazla sağlar.

Tüpleri santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Hücreleri dağıtmak için tampon ve sonikat ekleyin.

Sulandırılmış süspansiyonları tabakalayın ve canlı bakterilerin büyümesini sağlamak için kuluçka yapın.

Koloni kuran birimleri (CFU'lar) sayın; inhibitörle işlenmiş ve etanole maruz kalan biyofilmden elde edilen daha az CFU, matris bütünlüğünün etanol direnci için gerekli olduğunu doğrular.

Temiz bir jilet bıçağını alın ve biyofilm kolonilerini şablonun yardımıyla iki eşit parçaya ayırın. Koloninin yarısını temiz bir spatula ile dikkatlice kaldırın ve 500 mikrolitre PBS içeren 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpüne aktarın.

Koloninin ikinci yarısını alın ve 500 mikrolitre %50 etanol içeren bir mikro-santrifüj tüpüne aktarın. Bunlar, sterilizasyon ajanlarına karşı direnci değerlendirmek için kullanılacaktır. Daha sonra, benzer şekilde D-lösin ile işlenmiş koloninin ilk yarısını alıp PBS'ye yerleştirin.

Sonra, bu koloninin ikinci yarısını alıp etanole aktarın. Biyofilm yarılarını içeren tüm tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka edin. Ve sonra, onları beş dakika boyunca 18.000 kat g ile santrifüjle yapın.

Pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın. 300 mikrolitre PBS ekleyin ve ardından hücreleri düşük bir ayarda, mikrotip sonikatör ile sonikasyon yapın. Ek olarak 700 mikrolitre PBS ekleyin, böylece nihai hacim bir mililitredir.

Sonra, PBS'de 10'dan negatif yediye seri seyreltme yapın. Sulandırılmış bir sıvıdan 100 mikrolitre alın ve %1,5 Agar LB tabakasını aşılayın. Bu adımı her örnek başına iki diğer seyreltme için tekrarlayın.

Aşıyı cam boncuklarla yayın ve ardından plakaları gece boyunca 30 derece Celsius sıcaklıkta kuluçkaya geçirin. Plakaları inceleyin ve koloni oluşturan birimleri (CFU) sayın. CFU mililitre başına hesaplandıktan sonra, PBS ile etanol tedavilerinde hayatta kalanların yüzdesini hesaplayın.