GFP etiketli SKN-1 kullanılarak C. elegans'ta patojenin neden olduğu oksidatif stresin görselleştirilmesi

Bağırsak sitoplazmasında lokalize olan yeşil floresan protein etiketli SKN-1 olan C . elegans solucanlarını içeren iki plaka ile başlayın. Bu solucanlar ayrıca otofloresans gösteren bağırsak lipofuscin granülleri içerir.

Bir plakada kontrol grubu olarak patojenik olmayan bakteriler, diğerinde ise test grubu olarak patojenik bakteriler yerleştirilir.

Test grubunda, patojenin ürettiği hidrojen peroksit, oksidatif stresi indükleyerek SKN-1'in bağırsak çekirdeklerine geçişini tetikler.

Kontrol grubunda, SKN-1'in çoğu sitoplazmada dağınık olarak dağılmış halde kalır.

Her plakayı bir tampon ile yıkayın ve solucanları tüplere aktarın.

Solucanları ayırmak ve tamponu çıkarmak için santrifüj yapın.

Anestezi altına almak için sodyum azid içeren bir ortam ekleyin.

Solucanları agaroz pedlerine monte edin, örtük örtükleri yerleştirin ve floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Nükleer sınırları görselleştirmek için otofloresansı kullanın.

Testteki güçlü nükleer SKN-1 sinyali, kontrollerdeki diffüz sitoplazmik sinyale göre nükleer relokalizasyonu gösterir ve patojenin neden olduğu oksidatif stresi doğrular.

Bir pipet kullanarak, her THY streptococcus tohumlu ve NGM E.coli tohumlu plakalara yaklaşık 100 L4