JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 3:15 dk • March 31st, 2026
Büyük bir cam slaytla başlayın, her iki kenara çift katmanlı olarak daha küçük cam slaytlar yerleştirilir.
Erimiş agarozu boşluğa dökün ve üzerine büyük bir cam sürgülü daha ekleyin.
Agarose sertleşmek için kurulumu soğut.
Cam sürgüleri çıkarın ve agarozu küçük pedler halinde kesin.
Agararoz pedleri, bir sürgüye bağlı bir yapışkan çerçevenin içine yerleştirin.
Konak enfeksiyonu için gerekli olan floresan etiketli salgı sistemini ifade etmek üzere genetik olarak modifiye edilmiş patojenik bakteri kültürünü alın.
Yoğun bir bakteriyel yama kullanın ve suya askılayın.
Vortex bakterileri eşit şekilde dağıtmak için kullanılır.
Bakterileri hareketsiz hale getirmek için agarose pedine süspansiyon uygulayın.
Nemi korumak için bir örtü ile kapatın.
Parlak alan aydınlatması altında, görüntüleme için bir hücre alanı seçin.
Mikroskop ayarlarını optimize ederek foto ağartmayı azaltın ve sinyal hassasiyetini artırın.
Flüoresans etiketli bakterileri tespit etmek için floresans kanalına geçin.
Canlı hücre görüntülemesi için agarose pedleri yaparak başlayın. Yaklaşık 30 mililitre %1 düşük erimiş agaroz çözeltisi suda hazırlayın ve yaklaşık 90 saniye boyunca cam şişede mikrodalgada ısıtın, arada bir agaroz tamamen çözünene kadar döndürün.
İki adet 22 x 22 x 0,15 mm cam slaytı, 25 x 75 x 1,1 milimetre cam slaytın kenarına birbirinin üstüne yerleştirin. Sonra, diğer kenara iki küçük slaytı daha üst üste koy. Yaklaşık 1 mililitre erimiş agarozu iki üst cam slayt arasındaki orta sürgüye pipet yapın ve erimiş agarozun üzerine bir başka büyük sürgülü yerleştirin; böylece hava kabarcıkları oluşmasını önleyin.
Slaytları dört derece Celsius'ta 15 dakika soğutun, ardından bir bistüri veya jilet bıçağı kullanarak pedi nazikçe küçük kareler halinde kesin. 25x75 x 1.1 mm ölçümlerindeki cam sürgüye çift taraflı bir yapışkan çerçeve sabitleyin ve sürgüye birkaç ped yerleştirin. Legionella pnömofila'nın yoğun bir yamasını 1 mililitre çift damıtılmış suda çöz.
Sonra vortex ve pipetle 2-3 mikrolitre seyreltme pedlere koyulur. Yapışkan çerçevenin üzerine nazikçe 58 x 24 x 0,15 milimetre boyutlarında bir kapak parçası yerleştirin. Parlak alan aydınlatması kullanılarak görüntüleme için hücreleri seçin.
Sonra, mikroskobun yazılımının yakalama penceresinde ND'yi 180'e, binlemeyi ise 2x2'ye ayarlayın. 488 nanometrelik kanalı kullanarak örneği 500 ila 1000 milisaniye boyunca maruz bırakın ve aynı parametrelerle etiketlenmemiş Legionella pnömofila'yı görüntülemek için floresansın özgüllüğünü doğrulayın.