JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 3:08 dk. • March 31st, 2026
Gastrointestinal traktı Clostridium difficile tarafından kolonileştirilen bir fareyle başlayın; bu patogen, anaerobik, spor oluşturan bakteriyel bir patogen.
Faresi kısırlaştırın ve doğal olarak steril, önceden tartılmış bir tüpte dışkılamasına izin verin.
Boş tüp ağırlığını toplam ağırlıktan çıkararak uygun seyreltmeler için dışkı örneğinin net ağırlığını belirleyin.
Numuneyi anaerobik bir ortama aktararak oksijene duyarlı bakterinin canlılığını koruyun.
Numuneye bir tampon ekleyin ve mekanik olarak bozarak içeriğini askıya alın.
Daha büyük kalıntıların yerleşmesini sağlamak için kuluçka, bakteri hücreleri ve sporları süpernatantta tutulur.
Buffer'daki üst yüzeyin seri seyreltmelerini gerçekleştirin.
Sulandırmaları seçici ortama örtün ve anaerobik koşullarda kuluçka yapın.
Bu ortam, sporların çimlenmesini ve Clostridium difficile'nin seçici büyümesini desteklerken, rakip bakterileri inhibe eder ve böylece ayrı koloniler oluşur.
Kolonileri sayarak dışkıdaki Clostridium difficile yükünü nicelikleştirin ve gastrointestinal kolonizasyonu değerlendirin.
Farelerden dışkı örnekleri toplamak için önce konu faresini boyun ve sırtındaki gevşek derisinden hafifçe ama sağlam bir şekilde tutarak hayvanın sıkıntı içinde olmadığından emin olun.
Serçe parmağını kullanarak hayvanın kuyruğunu nazikçe kaldırarak anüsü ortaya çıkar. Bilinen kilolu steril bir mikrosantrifüj tüpünü hayvanın anüsünün altına doğrudan tutun, böylece tüpün fareye doğrudan temas etmemesini sağlayın. Hayvan dışkı yaptığında, dışkı pelletini tüpten toplayın.
Tüm gerekli örnekler toplanana kadar tüpü oda sıcaklığında saklayın. Dışkı içeren tüpleri analitik bir tartıda tartın ve kütleyi dört ondalık basamakta kaydedin. Tüpün ağırlığını çıkararak dışkı pelletinin ağırlığını hesaplayın.
Sonra, içeriğin birden ona kadar seyreltilmesi hesaplayın ve 1x PBS'ye yeniden süzülün. Pipetin ucunu kullanarak dışkıyı nazikçe çözeltiye dönüştürün. Örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya geçirin, içeriğin çökmesini sağlayın.
Çözeltileri anaerobik olarak koruyarak, her örnek için 1x PBS ile seri seyreltmeler yapılabilir. Her seri seyreltmeden 100 mikrolitre TCCFA plakalarına aktarın. Steril L şeklinde bir yayıcı kullanın ve malzemeyi plakalara eşit şekilde uygulayın.
Plakaları anaerobik koşullarda 37 derece Celsius sıcaklıkta 24 saat boyunca kuluçka yapın. Son olarak, C.difficile kolonilerini sayın ve gram fekal içeriği başına koloni oluşum birimini hesaplayın.