Name: Lipofilik boya birleştiren In situ Hibridizasyon, İmmünohistokimya ve Histoloji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Öğrenin fare dokusunda lipofilik boya, in situ hibridizasyon ve immünohistokimya tekniklerini birleştirerek genetik mutasyonları morfoloji ve ekspresyon profilleriyle ilişkilendirmeyi. Bu yöntem tek bir örnekten maksimum veri toplar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Görüntüleme için Iowa Carver Merkezi Üniversitesi&#39;nde Konfokal görüntüleri elde edildi. Finansman SBIR hibe (MH079805) tarafından sağlanan bu proje için farelerde üreme için ek destek BF BF NIDCD (5R01DC00559007) tarafından sağlanan

<ol><li>Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+three-color+neuronal+tracing+in+fixed+tissue+using+NeuroVue+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes.</a> Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).</li>
<li>Tonniges, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-+and+bio-physical+characterization+of+novel+violet+and+near-infrared+lipophilic+fluorophores+for+neuronal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing.</a> Journal of Microscopy. , (2010).</li>
<li>Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+tracing+with+DiI%3A+decalcification%2C+cryosectioning%2C+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li>
<li>Gurung, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+embryonic+midbrain+thalamic+and+thalamic+auditory+connection+development+in+mice+as+revealed+by+carbocyannine+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection.</a> J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).</li>
<li>Fritzsch, B., Nichols, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+reveals+a+prenatal+arrival+of+efferents+at+the+differentiating+otocyst+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice.</a> Hear Res. 65, 51-60 (1993).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+suppresses+hair+cell+differentiation+in+ear+ganglia+and+regulates+hair+cell+subtype+development+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea.</a> PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).</li>
</ol>

Fare doku Üniversitesi (ACURF 0.804.066) Iowa Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak toplanmıştır.

Bu video, belirli bir hayvan içinde veri ilişkilendirerek (Şekil 3) veri toplama ve dayanışmanın en üst düzeye çıkarmak için dört teknikleri birleştirmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu yaklaşım, ıslah miktarını azaltmak ve böylece ortak yerelleştirme ve mutantlar bağıntılı etkileri hakkında bilgi artırırken yayınlanabilir veri elde etmek için gerekli. Bu video, yetişkin farenin yanı sıra tavuk, Xenopus ve Zebra balığı gibi diğer hayvanların embriyonik fareler kullanılmıştır rağmen de bu teknikleri kullanılarak analiz edilebilir. Diğer türler kullanırken proteinaz k sindirim değişmiş gerekebilir. Burada özellikle ilgi üç nöron popülasyonları etiket farklı floresanlama NeuroVue boyaları kullanabilirsiniz. Bu boyaların yararı sadece ya da analiz edilecek mutasyonlar tarafından etkilenmiş olabilir ya da olmayabilir immünohistokimya dayanarak sorunlu olabilir mutant fareler, kullanılabilir olması, ve onlar retrograd ve anterogradely 5 nöronlar etiket . Yeni yapılan bir çalışmada da aynı anda altı 2 etiketli olabilir nöron popülasyonları sayısı artmıştır . Sonra, aynı ilgi doku izleme lipofilik boya sonra gen transkripsiyonu analizi için, in situ hibridizasyon kullanarak analiz edilebilir ve daha sonra protein dağıtımı için immunhistokimya ile analiz edilebilir. Son analizi fenotip karakterizasyonu 6 ekleyebilirsiniz detaylı histoloji eklenebilir. Bu çok yönlü analiz aksi imkansız ya da en azından daha geniş bir protokol ve fare üreme ihtiyacı olabilir aynı hayvan içinde bağıntılı analizi yoluyla yeni anlayışlar kazanmak için bir potansiyele sahiptir.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; Hibritleme:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC DIG yıkama + bloklama tampon seti</td><td>Roche Group</td><td>1585762</td><td></td></tr><tr><td>Premix 20x SSC Tamponu</td><td>Roche Group</td><td>1666681</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K 20mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Dietil Pirokarbonat (DEPC)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D43060</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran Sülfat</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D20020</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple</td><td>Roche Group</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dig-AP Fab fragmanları</td><td>Roche Group</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>RNaz A enzimi 10mg/ml</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Research Products International Corp.</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>Somon Spermi DNA'sı 10mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Filtre Ünitesi 0.22&amp;mu;m; 500ml</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Diskleri 0.2&amp;mu;m; 25mm</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin pH 7.4 paketleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;İmmünohistokimya:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keçi Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst Boyası</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>9460</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Histoloji:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly/Bed 812 Gömme Ortamı/DMP-30 Kiti</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>Propilen oksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit Çözeltisi %50</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151</td><td></td></tr><tr><td>DPX Kapatma Ortamı</td><td>Fluka</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Sallayıcı</td><td>MidSci</td><td>55D1114</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma Bloğu</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-715-125D</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>60&amp;#x00B0;'ye ayarlı inkübatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Boya izleme:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro makas</td><td>Geuder</td><td>G-19775</td><td></td></tr><tr><td>Hassas Pens</td><td>E.M.S</td><td>72680-F</td><td></td></tr><tr><td>NeuroVue boyası: Maroon, Red, Jade</td><td>MTTI</td><td>FS-100(1,2,6)</td><td></td></tr><tr><td>1X fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>36&amp;#x00B0;'ye ayarlı inkübatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-506DQ</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Lamlar</td><td>Surgipath</td><td>00240</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Surgipath</td><td>00106</td><td></td></tr><tr><td>RPI</td><td>Gliserol</td><td>G22025-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (%4 ve %0,4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr></tbody></table>

lipofilik boya birleştiren in situ hibridizasyon, İmmünohistokimya ve histoloji

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Tek bir genin işlevini gen düzenleyici ağların içine derin kesmek ötesine geçerek, tek bir hayvan kombine birden fazla mutasyonlar gerektirir. Bu tür iki veya daha fazla gen analiz hücresel ve doku ifade değişiklikler ayrıntılı çözümü için, bütün monte gelişmekte olan organ veya bölümleri, diğer genler, ya da proteinlerin immünohistokimya in situ hibridizasyon ile tamamlanması gerekiyor. Birden fazla gen değişiklikleri birleştiren CRE veya flipase koşullu genleri silmek ve embriyonik öldürücülüğü önlemek için kullanılmasını gerektirir. Gerekli ıslah planları dramatik çaba geliştirmek ve istenilen genetik değişiklikler tam bir repertuar ile çok az sayıda hayvan bir sonucu mutasyona uğramış genlerin sayısı ile doğru orantılıdır maliyet. Amortizing birden fazla mutasyonları taşıyan bu birkaç değerli örnekleri elde etmek için çaba ve zaman büyük miktarda doku optimizasyonu gerektirmektedir. Ayrıca, birden fazla tekniği ile tek bir hayvan soruşturma daha kolay ifade profilleri ile ilişkili gen delesyonu kusurları yapar. Biz belirli bir hayvan daha kapsamlı bir analiz elde etmek için bir teknik geliştirdik; monte edilmiş hem de tüm organları ve bölümleri aynı örnekten yanı sıra, gen ve protein ifade gibi tüm birkaç farklı histolojik olarak tanınabilir yapılar analiz etme yeteneğine sahip. Fareler, bu tekniğin etkinliğini göstermek için kullanılmıştır olmasına rağmen hayvanların geniş bir yelpazede uygulanabilir. Bunu yapmak için, maksimum olası veri miktarı ayıklamak için, in situ hibridizasyon, immünhistokimya ve histoloji lipofilik boya izleme, tüm montaj birleştirir.

Fare doku veri toplama maksimize etmek için farklı teknikler bir arada sunulmaktadır.

Lipofilik boya birleştiren In situ Hibridizasyon, İmmünohistokimya ve Histoloji

Tek gen fonksiyonunun ötesine geçerek gen düzenleyici ağların daha derinlemesine incelenmesi, tek bir hayvanda birleştirilmiş birden fazla mutasyon gerektirir. ...'nın bu şekildeki analizi...

Tek gen fonksiyonunun ötesine geçmek ve gen düzenleyici ağları analiz etmek, tek bir hayvanda birden fazla mutasyon gerektirir. Bu sistemde, genetik mutasyonları morfolojik ve ekspresyon profilleriyle ilişkilendirmek için tek bir dokudan elde edilen veri miktarını optimize ediyoruz. Bu, öncelikle birkaç ayrı nöronal popülasyonu görüntülemek için lipofilik boya enjekte edilerek gerçekleştirilir.Gen transkriptlarının mekansal ve zamansal örüntülerini görselleştirmek için in situ hibridizasyon uygulanır. İmmünohistokimya protein ekspresyonunun spesifik örüntülerini yansıtırken, histolojik kesit almanın eklediği boyut fenotip karakterizasyonuna katkı sağlar. Bu deneysel sistem, hem bütün halde monte edilmiş hem de kesitlenmiş preparatlarda, aynı örnek üzerinden histolojik olarak tanınabilir çeşitli farklı yapıların yanı sıra gen ve protein ekspresyonunu analiz etme imkanı sunar; lipofilik boya izleme, in situ hibridizasyon, immünohistokimya ve histolojiyi birleştiren bir sistemdir.Bu teknik, tüm doku diseksiyonları ve manipülasyonları için morfolojiyi gen ve protein ekspresyonu ile ilişkilendirirken, tek bir örnekten elde edilen bilgiyi maksimize eder. Hayvanları, uygun boyutlu iğnelere sahip peristaltik pompalar kullanarak trans kardiyak perfüzyon yoluyla 0,1 molar fosfat tamponunda %4 paraldehit ile fikse edin. DY'ler ışığa duyarlı olduğundan, bunları karanlık ve kapalı bir bölmede saklayın ve çapraz kontaminasyonu önlemek için, bir diseksiyon mikroskobu altında her bir boyayı işlemek üzere ayrı birer alet seti belirleyin.Dikkate alınan nöronal popülasyonu seçici olarak işaretlemek ve diğer ilgisiz yapıları dışarıda bırakmak için bir boya uygulama bölgesi belirleyin. Seçilen bölgeyi görsel olarak onaylamak ve boyanın yerleştirileceği alana erişmek için ilgisiz dokuları çıkarın. Şimdi, önceden yüklenmiş neuro view boya filtre şeritlerini mikro makasla uygun boyutlarda üçgen parçalar halinde kesin.Beyin gibi yumuşak dokulara doğrudan yerleştirme yaparken, diğer yapıların etiketlenmesini önlemek için mümkün olan en küçük parçayı kestiğinizden emin olun. Filtreyi, dokuyu delmek için filtre üçgeninin bir ucunu kullanarak yerleştirin. Daha sert dokular için, filtrenin daha kolay yerleştirilmesini sağlamak amacıyla bir insizyon yapın. Filtreyi dokuya itmek için diseksiyon iğnesi kullanmayın.Numuneleri, %4 paraformaldehit içeren sıkıca kapatılmış bir tüpe yerleştirin ve yaşa ve katedilecek difüzyon mesafesine bağlı olarak, karanlıkta 36 °C'de iki ila 14 gün boyunca inkübe edin. Epi-floresan özellikli bir disseksiyon mikroskobu kullanarak, boyanın istenen bölgeye difüze olduğunu doğrulayın ve ilgili dokuyu ayıklayın. Konfokal mikroskop ile görüntüleme yapmak için numuneyi gliserol ile bir lam üzerine sabitleyin.Lipofilik gözlerin görüntülemesinin ardından, gliserolü sistematik olarak durulamak için konfokal transfer örneklerini RNA'sız PBS içeren iki mililitrelik RNA'sız ep tube'lara aktarın. Örnekleri, dört santigrat derecede kademeli bir metanol serisi iledehidrasyon ve rehidrasyon işlemlerinden geçirin. En az bir saat boyunca %100 metanolde inkübasyon ile başlayın ve 15 dakika boyunca %25 metanole kadar düşürerek devam edin.1x PBS ile beşer dakikalık üç yıkama yapın. Dokuyu, 2 ml taze PBS içindeki 20 mg/mL stok proteinaz K'den 2 µL ile sindirin. Sindirim reaksiyonunu, doku opaklığının opak halden neredeyse şeffaf hale gelerek değişmesini izleyerek takip edin.Enzim sindirimini durdurmak için örnekleri %4'lük paraformaldehit içerisinde beş dakika inkübe edin. Ardından PBS ile bir kez bir dakika boyunca, ardından üç kez beşer dakika boyunca yıkayın. Hibritleşme öncesi bir adım olarak, mümkün olduğunca fazla uzaklaştırmaya özel dikkat ederek son PBS yıkamasını dökün.Numuneleri 1,8 mililitre hibridizasyon çözeltisi içinde inkübe edin. Bir eviricide (inverter) 60 °C'de bir saat boyunca karıştırın; somon spermi DNA'sını 85 °C'de 10 dakika inkübe ederek denatüre edin ve buzdolabında (buz üzerinde) bekletin, ardından her bir numuneye 200 µL denatüre tek zincirli DNA ve yaklaşık 100 ng DIG işaretli riba probu ekleyin ve hibridizasyon fırınında 60 °C'de gece boyu hibridize edin.Numuneleri, hibridizasyon fırınında 60 °C'de, 2X SSC ile 10 dakikalık üç yıkama işlemine tabi tutun. Önemli bir adım olarak, bir ISO temp ısıtma bloğunda 70 °C'de 60 dakika boyunca 2X SSC ile yıkama yaparak tüm endojen alkalin fosfataz aktivitesini giderin. Numuneleri beş dakika boyunca PBS ile yıkayın.Şimdi PBS'yi değiştirin ve 10 mg/mL RNAs A'dan 1 µL ekleyin; ardından bir ISOtemp ısıtıcı blokta 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. PBS RNAs A'yı dökün ve yıkama solüsyonu ile her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın.Son olarak, kalan tüm RNA'ları bir ISO temp ısıtma bloğunda 70 °C'de 60 dakika boyunca inkübe ederek ısıtın ve aktive edin. Son adım, ribo probunu görselleştirmektir. Numuneleri bir katı blok tamponunda bir saat boyunca inkübe edin.Bloklama tamponunu dökün ve her örneğe bir mikrolitre anti ditch antikoru içeren iki mililitre bloklama tamponu ekleyin. Gece boyu inkübe edin ve belirtildiği gibi bir kat yıkama tamponu ile birkaç kez yıkayın. Ardından örnekleri bir kat yıkama tamponu içerisinde gece boyu inkübe edin.Numuneleri 10 dakika boyunca bir kez deteksiyon tamponu ile durulayın ve numuneleri bir kuyucuk plakasına aktarın. Tamponu boşaltın ve BM purple ile renk geliştirme işlemini gerçekleştirin; BM.Purple ışığa duyarlıdır. İstenen sinyal gücü elde edildiğinde numunelerin üzerini folyo veya bir kutu ile kapatın.Örnekleri, kuyucuklar içinde beş dakika boyunca bir kez deteksiyon tamponu ile durulayın. Örnekleri transmisyon mikroskopisi ile görüntüleyin veya 4% Paraformaldehit içinde dört derece santigrat sıcaklıkta saklayın. Gerekiyorsa, dokuyu dereceli bir etanol serisi ile lipofilik boyalardan arındırın.Ardından, beş ila 10 dakika boyunca kademeli olarak PBS ekleyerek dokuyu yeniden hidrate edin. Şimdi dokuyu, oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde %2,5 normal keçi serumu ve %0,5 Triton X 100 içerisinde bir saat boyunca bloklayın; bloklama solüsyonunda seyreltilmiş primer antikor ile dört derece Celsius'ta, bir çalkalayıcı üzerinde 48 saat boyunca inkübe edin; her biri bir saat sürecek şekilde üç kez PBS ile yıkayın. Örnekleri tekrar bloklayın, ardından bloklama solüsyonunda seyreltilmiş floresan konjuge sekonder antikor ile dört derece Celsius'ta, bir çalkalayıcı üzerinde 12 ila 24 saat boyunca inkübe edin. Bu noktadan itibaren, sekonder antikorlar ışığa duyarlı olduğu için örneğin ışıkla temasını kesmek için dikkatli olunmalıdır.Örnekleri tekrar, her biri bir saat sürecek şekilde üç kez PBS ile yıkayın. Son olarak, örnekleri epi floresan ve konfokal mikroskopi ile görüntüleyerek analiz edin. Epoksi gömme ve kesme işlemi, dokunun genellikle bir cam örnek tüpünde, gece boyunca %2,5 GLUTARALDEHYDE %1 PFA içeren 0,1 molar fosfat tamponunda fikse edilmesini gerektirir; dokuyu kademeli etanol inkübasyonları ile dehidrate edin, ardından çözücülere geçiş için bir bir oranında absolut ethanol ve propilen oksitte beş dakika inkübe edin ve bunu propilen oksitte yapılan beş adet 10 dakikalık yıkama ile takip edin; örneği, bir sallayıcı üzerinde gece boyunca bir bir oranında propilen oksit ve reçine içeren basit bir inkübasyon ile reçineye sızdırın.Numuneyi içeren çözeltiyi düz bir gömme kalıbına dökün ve propilen oksitin buharlaşması için tezgah üzerinde dört ila altı saat bekletin. Numuneleri son kalıpta dört saat boyunca %100 reçineye aktarın. Numuneleri reçineye gömün ve bir etiket yerleştirin.Reçineyi 60 °C'de 24 ila 48 saat inkübe ederek polimerleşmesini sağlayın. Fazla reçineyi en aza indirmek için, gerekirse reçine bloğunu bir jiletle yontun. Bir ultramikrotom üzerinde.Bir ila iki mikronluk seri kesitler alın, örnekleri monte edin ve transmisyon ile epi floresan mikroskopi kullanarak görüntüleyin. Farklı dalga boylarındaki lipofilik boyalar, üç farklı kranial sinirin merkezi projeksiyonlarının görselleştirilmesini kolaylaştırabilir. Burada, lipofilik boya trigeminal, glossopharyngeal ve vagus sinirlerinin periferik kısımlarına yerleştirilmiştir.Boya difüzyonu için inkübasyondan sonra, beyin sapına giden sinir merkezi çıkıntıları aydınlık alan mikroskopisi ile görselleştirilir. Arka beyin diseke edilip düz monte edildiğinde, işaretlenmiş üç sinirin merkezi çıkıntılarının bazı etiketlemeleri net bir şekilde görülür. Aydınlık alan mikroskopisi altında, konfokal mikroskop belirli alanların aydınlatıldığı boyutluluk imkanı sağlar ve üç farklı boyanın kullanımı her bir popülasyonun dağılımının değerlendirilmesine olanak tanır.Diğerleriyle karşılaştırıldığında, burada yeni doğmuş bir faredeki iç kulak aferentleri neuro view ile izlenmiştir. Prox1 için C iki hibridizasyonu kırmızı renktedir ve aferentleri görselleştirmek için anti-tübülin ile anti-prox1 immünoreaktivite kombinasyonu kullanılmıştır.Ek olarak, iki mikron kalınlığındaki bir epoksi reçine kesiti, kokleayı bir enine kesit şeklinde görüntüler. Bu prosedür uygulanırken, lipofilik göz yerleşiminin dikkatle seçilmesi önemlidir. Nöroanatominin iyi bilinmesi bu süreçte yardımcı olacaktır; ayrıca tüm foto-hassas adımlara karşı dikkatli olunmalıdır.Bu prosedür, mutantlardaki kolokalizasyon ve örtüşme etkileri hakkındaki bilgileri geliştirirken, üretim miktarını ve yayınlanabilir veri elde etmek için gereken süreyi azaltacaktır.

combining-lipophilic-dye-situ-hybridization-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Yerinde tetramer boyama in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek bir tekniği görselleştirme, haritalama ve analiz, virüs bulaşmış hedefleri virüs spesifik CD8 + T hücreleri mekansal yakınlığı ve bu bağışıklık etkileyiciler ve hedefleri arasındaki nicel ilişkilerin belirlenmesi sağlar enfeksiyon sonuçlarını.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

Kaynak: Jolly, S., et.al. Fare Beyin Bölümlerinde Üç Genin Ekspresyonunun Tespiti için Çift Floresan In Situ Hibridizasyonunun İmmünoetiketleme ile Birleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2016). Bu video, fare beyni bölümlerindeki iki RNA hedefinin ekspresyonunu görselleştirmek için çift floresan in situ hibridizasyonun kullanımını göstermektedir. Protokol, floresein, izotiyosiyanat ve digoksijenenin ile etiketlenmiş problar kullanılarak RNA'nın sıralı tespitini ve ardından duyarlılığı artırmak için...

 Fare Beyin Bölümlerinde Gen Ekspresyonunu Tespit Etmek için Çift Floresan In Situ Hibridizasyon Yapılması

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Gen ekspresyonunu spesifik hücre tiplerine lokalize etmek, spesifik antikorların eksikliği nedeniyle zor olabilir. Burada, çift floresan RNA'nın yerinde hibridizasyonunun immün boyama ile birleştirilmesiyle gen ekspresyonunun eşzamanlı üçlü tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Burada tarif biz multiplex floresan immunohistokimyasal boyama ve lenfoma içinde birden fazla kanser ilişkili antijenleri eş zamanlı yerelleştirme için görüntüleme için bir iletişim kuralı. Bu iletişim kuralı tüm doku bölümleri içinde biyolojik colocalization analizine genişletilebilir.

Çoğaltılmış floresan immunohistokimyasal boyama, görüntüleme ve analiz lenfoma histolojik örneklerinde

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, çok etiketli FISH ve floresan IHC sinyali elde etmek amacıyla hem taze dondurulmuş hem de sabit fare beyin bölümlerinde floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve floresan immünohistokimyasını (IHC) birleştirmek için bir yöntemi açıklar. IHC, sitoplazmik ve membrana bağlı proteinleri hedefledi.

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

Bu protokol, retinadaki sinaptik devreleri ve protein lokalizasyonunu keşfetmeye odaklanarak, önceden gömülü immünoelektron mikroskobunun ayrıntılı adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

İmmünoelektron Mikroskobunun Önceden Gömülmesi ile Retina Devrelerinin ve Moleküler Lokalizasyonun İncelenmesi

Öğrenin fare dokusunda lipofilik boya, in situ hibridizasyon ve immünohistokimya tekniklerini birleştirerek genetik mutasyonları morfoloji ve ekspresyon profilleriyle ilişkilendirmeyi. Bu yöntem tek bir örnekten maksimum veri toplar.

Lipofilik boya birleştiren In situ Hibridizasyon, İmmünohistokimya ve Histoloji

Daha fazla video keşfet