Arabidopsis yapraklarına vakum infiltrasyonu yoluyla bakteriyel bir patojenin aşılanması

Yaprak dokusunu enfekte edebilen bir bakteri kültürü alın.

Kolonileri kazıyıp tuz çözeltisine askıya alın.

Bakteri konsantrasyonunu değerlendirmek için optik yoğunluğu ölçün, ardından istenen OD'ye kadar seyreltin.

Son aşı konsantrasyonuna ulaşmak için seri seyreltmeler yapın.

Yüzey gerilimini azaltmak ve yaprakta bakterilerin eşit şekilde yayılmasını sağlamak için yüzey aktif madde ekleyin.

Süspansiyonu bir Petri kabına aktarın.

Sonra, bir Arabidopsis saksının üstüne iki tahta çubuk yerleştirin.

Bitkiyi tabağın üzerine ters çevirin, yaprakları askıya daldırın.

Kurulumu vakum odasına yerleştirin ve vakum darbesi uygulayın

Uygulanan vakum, doğal açıklıklardan yaprak dokusundan havayı uzaklaştırır.

Vakumu serbest bırakmak atmosfer basıncını geri getirir ve bakterileri yapraklara zorla taşır.

Maksimum sızma sağlamak için darbeleri tekrarlayın.

Tencereyi çıkarın. Sonra fazla aşıyı lekeleyin.

Bakteri enfekte Arabidopsis yaprakları ise sonraki analizlere hazırdır.

İlgilendiğiniz Pseudomonas şırıngae sürünün gliserol stokunu -80 derece Celsius'tan uygun antibiyotiklerle takviye edilmiş bir LB plakasına doğru çizerek çıkarın. Plakayı 28 derece Celsius'ta 40 ila 48 saat boyunca kuluçka edin. Bakteriyel biyokütleyi kazıyıp beş mililitre 10 milimolar magnezyum klorüre yeniden yerleştirin.

Optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün ve 10 milimolar magnezyum klorür ekleyerek 0,1'e ayarlayın. 10 milimolar magnezyum klorürde seri seyreltme işlemi yaparak mililitre başına 5 kat 10 ile beşinci CFU arasında nihai inokulum konsantrasyonu elde edin. Sonra, Arabidopsis bitkileri için 200 mililitre, fasulye bitkileri için ise 50 mililitre aşı hazırlayın.

Aşılamadan önce, yüzey aktif madde Silwet L-77'yi fasulye aşısı için %0,02 ve Arabidopsis için %0,01 konsantrasyona ekleyin. Arabidopsis infiltrasyonu için, tencerenin üzerine X şeklinde iki tahta çubuk yerleştirin ve saksı, 200 mililitre inokulum içeren 14 santimetre çapında bir Petri kabının üzerine bakacak şekilde yerleştirin. Fasulye yaprağı aşısı için, bitkileri ve inokulum çözeltisini vakum odasına yerleştirin ve yaprağı aşıyı içeren 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne sokabilirsiniz.

Yapraklara sızmak için 30 saniye boyunca 500 milibar darbe verin. Fazla inokulum çözeltisini bir kağıtla boşaltın ve bitkileri ilgili büyüme odalarına geri döndürün.