JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:00 dk. • March 31st, 2026
Başlar, sabit, immobilize edilmiş ve permeabilize edilmiş siyanobakteriyel hücreler bir örtü kapağına yapıştırılır.
Bu siyanobakteriyel hücreler, düşük bolluklu büyüme düzenleyici proteinleri ifade eder.
Yüksek çözünürlüklü floresans görüntüleme sırasında, siyanobakteriyel hücrelerdeki doğal ışığa duyarlı pigmentler arka plan floresansı yayar.
Bu, düşük bolluklu proteinleri görselleştirirken görüntü kalitesini düşürür.
Bu arka plan floresansını en aza indirmek için, siyanobakteriyel hücreleri içeren kapak kapını boyama kabına yerleştirin.
Sonraki işlem sırasında spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için serum proteinleri içeren bir bloklayıcı tampon ve hücre geçirgenliğini korumak için bir deterjan ekleyin.
Boyama kabını buzun üzerine koyun ve hücreleri yoğun ksenon ışığına maruz bırakın.
Yüksek yoğunluklu ışık, ışığa duyarlı pigmentleri parçalayarak fotobeyazlamayı başlatırken, düşük bolluklu büyüme düzenleyici proteinler etkilenmez.
Soğuk koşullar ısı kaynaklı hasarı en aza indirir ve hücresel bütünlüğü korur.
Bu süreç, yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopisi sırasında immünboyama yoluyla düşük bollukluğa sahip, büyümeyi düzenleyen proteinlerin net görselleştirilmesini sağlar.
Yıkanmış kapak kapını boyama kabına taşıyın.
Kapak kayağının üstüne 50 mikrolitre bloklama tamponu ekleyin. Tüm boyama kabını buzun üzerine koyun ve ardından en az 60 dakika boyunca fotobeyazlatma için ksenon ışık kaynağının altına alın. Fotobeyazlatma ve bloklamadan sonra, bloklayıcı tamponu çıkarmak için kağıt havlunun kenarını kullanın.