JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:36 dk. • March 31st, 2026
Enfekte bir bitkiden izole edilmiş patojenik bir bakterinin süspansiyonunu alın.
Bakteriyel genom, virülans-düzenleyici genin promotorunun aynı zamanda aşağı akış, promotorsuz floresan protein geninin ekspresyonunu da yönlendirdiği transkripsiyonel bir füzyon içerir.
Bitki enfeksiyonu sırasında, promotor aktivasyonu düzenleyici ve floresan proteinlerin üretimini tetikler.
Düzenleyici protein virülans genlerini aktive ederken, floresans ise ölçülebilir bir virülans aktivasyonunu gösterir.
Hücreleri santrifüj edin, üst yüzeyi atın ve ardından tekrar süspansiyon ile konsantre bir süspansiyon elde edin.
Bir örtü üzerine bir damla koyup hücreleri yaymak ve hareketsiz hale getirmek için agaroz pediyle örtün.
Tüm bakteri hücrelerini tanımlamak için parlak alan görüntüsü alın, ardından tek hücreli floresansı tespit etmek için floresan görüntüsü alın.
Her ikisini birleştirerek floresans yoğunluk farklarını görselleştirin; bu da yüksek, düşük veya hiç virülans gen ekspresyonuna sahip alt popülasyonları ortaya çıkarır.
Bu fenotipik varyasyon, bitki kolonizasyonu sırasında bakterilerin hayatta kalmasını artıran adaptif bir stratejiyi yansıtır.
Tek hücreli analiz için, damıtılmış suda %1,5 agaroz çözeltisi hazırlayın. Eridikten sonra, yan yana yerleştirilmiş iki mikroskopi slaytı arasındaki boşluğu dolduracak kadar hacim ekleyin ve üstüne başka bir slayt yerleştirin. 15 dakika sürmesine izin verin ve üstündeki sürgüyü dikkatlice çıkarın.
Bir bıçak kullanarak, agarose pedini kullanmadan önce 5 milimetreye 5 milimetre boyutlarında parçalara kesin. Paralel olarak, apoplast ekstraksiyonu alan bakterilerden 1 mililitre santrifüj yapın. Süpernatantı pipet ile dikkatlice çıkarın ve pelleti hücreleri konsantre etmek için 20 mikrolitre suya yeniden süsleyin.
Konsantre hücrelerden 2 mikrolitre damlayı 0,17 milimetrelik bir kapak kılıfına yerleştirin ve damlayı agaroz pediyle örtün. Bakteri preparatını konfokal mikroskop altında görselleştirerek yeşil floresan bakterileri belirli lazerler kullanarak tanımlayın. Parlak alanı kullanarak tüm bakterileri tespit edin ve her iki alanı birleştirin.