Bakteriyel Enfeksiyonun Tespiti İçin Yapraklardan Toplam DNA Çıkarılması

Floemanın bakteriyel bir patojenle enfekte olduğu küçük soğutma yaprak dokusu parçalarıyla başlayın.

Parçaları, DNA bozucu nükleazların etkinliğini engellemek için sıvı azotlu bir harca yerleştirin.

Hücreleri mekanik olarak bozmak ve hücre içi bileşenleri serbest bırakmak için öğütün.

Tozu aktarmak için soğutulan bir spatula kullanın, lizis tamponu ekleyin ve süspansiyonu vortex edin.

Bitki çekirdeklerini ve bakteri hücrelerini lizlemek için kuluçka yapın, DNA ve RNA salınırken proteinleri denatüre eder.

RNase ekleyin ve RNA'yı bozgunlaştırmak için kuluçka yapın.

Proteinleri agregasyona protein çökeltme tamponu ekleyin, ardından onları ayırmak için santrifüj yapın.

Bitki ve bakteri DNA'sını içeren üst üste aktarılan DNA'yı izopropanol'e aktararak DNA'yı iplik benzeri iplikler halinde çökelttirin.

DNA toplamak ve süpernatantı atmak için santrifüj yapın.

Etanol ile yıkayıp sonra santrifüj yapın ve üst maddeyi atın.

DNA'yı hava ile kurut, ardından bir rehidrasyon tamponu ekleyip inkübe ile çözünür.

DNA örnekleri artık PCR tabanlı patojen tespitine hazırdır.

Narenciye ağacından taze bir yaprak kesmek için temiz makasla temiz bir plastik sandviç poşetine koyun. Sonra, az miktarda sıvı azot ekleyerek bir harç ve havanı soğutun. Sonra, makasla yaprak dokusunun yaklaşık bir inç kare boyutunda küçük parçalarını kesin.

Yaprak parçalarını hemen dondurmak için harca koyun. Yaprak dokusunu harçla hızla öğütmeye başlayın, sıvı azot buharlaşana kadar ve ince bir yeşil toz kalır. Sonra, metal spatula'yı sıvı azotta 10-15 saniye soğutun. Sonra soğuk spatula ile 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpünde harçtan topraklanmış dokuyu alabilirsiniz. Numuneye 600 mikrolitre çekirdek liz çözeltisi eklemek için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Sonra örneği bir ila üç saniye girdabla çevirin. Tüpü 65 derece Celsius'ta, su banyosunda 15 dakika kuluçka yapın.

Kuluçka dönemi bittikten sonra, 10 mikrolitrelik bir pipet kullanarak lizata 3 mikrolitre RNase çözeltisi ekleyerek RNA'yı çıkarabilirsiniz. Sonra, tüpün içeriğini iki ila beş kez ters çevirerek karıştırın. 37 derece Celsius'ta 15 dakika boyunca bir dolap kuluçka makinesinde kuluçka yapın. 15 dakika sonra, numuneye 200 mikrolitre protein çökeltme çözeltisi ekleyin. Tüpü 20 saniye boyunca yüksek hızda girdabla tutun.

Sonra, örneği 13000 g ile 3 dakika boyunca santrifüjle edin. Santrifüj sırasında, oda sıcaklığında tutulan 600 mikrolitre izopropanol yeni 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpüne eklenin. Santrifüj işlemi bittikten sonra, süpernatantı dikkatlice santrifüj tüpünden izopropanol içeren tüpe çıkarın. Pelleti at.

DNA'nın iplik gibi görünür olması için tüpü ters çevir. Sonra, numuneyi oda sıcaklığında bir dakika boyunca 13000 g santrifüjle yapın.

Santrifüjlemeden sonra süpernatantı dekant edin. Sonra, pellete %70 etanol içeren 600 mikrolitre ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirerek peleti yıkayın. Tüpü 13000 g ile 1 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işlemi bittikten sonra, süpernatantı dikkatlice aspire edin. Sonra, kapak açık iken, emici bir kağıt üzerinde tüpü ters çevirerek 15 dakika hava kurutmaya devam edin. Kuruduktan sonra, pellete 100 mikrolitre DNA rehidrasyon çözeltisi ekleyin. DNA süspansiyonunu 65 derece Celsius sıcaklığında bir saat boyunca su banyosunda kuluçka edin.