Kan Bazlı Makrofaj Taşıma Nanoformulated antiretroviral ilaçlar Geliştirme Yöntemleri

Bu prosedürün amacı, nano art olarak adlandırdığımız kristal antiretroviral nanopartiküllerin üretilmesi; bunların hücresel alım, salgılanma ve antiretroviral özelliklerinin test edilmesidir. Bu işlem, öncelikle antiretroviral ilaçların sonikasyon homojenizasyonu veya yaş öğütme yoluyla işlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, primer monositlerin karşı akımlı santrifügal ayırma ile izole edilmesinin ardından nano art partiküllerinin fiziksel özelliklerinin karakterize edilmesidir.

Hücreler, monosit kaynaklı makrofajlara farklılaşmalarını uyaran makrofaj koloni uyarıcı faktör (MCSF) içeren DMEM'de yedi gün boyunca kültüre edilir. Üçüncü adım, nano art'ın insan monosit kaynaklı makrofajlar tarafından alımını, tutulumunu ve salınımını test etmektir. Prosedürün son adımı, nano art'ın monosit kaynaklı makrofajlardaki in vitro antiretroviral etkinliğini test etmektir.

Nihayetinde, nano sanatın hücreler tarafından kolaylaştırılmış alımı, hücrelerden yavaş salınımı ve güçlü antiretroviral etkinliği gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bunlar; ilaç seviyelerinin yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC ile ölçülmesiyle ve enfekte kültür süpernatant materyallerinin ters transkriptaz aktivitesi ölçümüyle test edilmesiyle belirlenir. Merhaba, ben Hanta Aldi; Nebraska Tıp Merkezi'nde Dr. Howard Gelman'ın laboratuvarında doktora sonrası araştırma görevlisiyim.

Sunduğumuz yöntemler, hücre tabanlı ilaç iletim sistemlerinin translasyonel araştırma faaliyetlerini geliştirmek için nasıl kullanılabileceği dahil olmak üzere nanotıptaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu, uzatılmış yarı ömürlere sahip nano formüle edilmiş antiretroviral terapi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Çalışmalarımız, nano art'ın klinik kullanım potansiyelini desteklemektedir.

Merhaba, benim adım Ari Noche; Carol Schwartz Emerging Neuroscience Laboratuvarı'nda çalışan bir MD PhD öğrencisiyim. Dr. Gendelman'ın rehberliğinde, burada size gösterdiğimiz tekniklerin etkileri antiretroviral terapiye kadar uzanmaktadır; çünkü nano formülasyonlu bileşikler, ilaçla ilişkili yan etkileri azaltırken aynı zamanda biyoyararlanımı ve farmakokinetiği eş zamanlı olarak iyileştirebilir. Klinik olarak mevcut olan antiretroviral ilaçları alıp onları nanoparçacıklar halinde yeniden paketleyerek, uyumluluğu artırabilir ve hastalık sonuçlarını da olumlu yönde etkileyebiliriz.

Merhaba, ben Dr. Howard Gendelman. Klinik bilim insanıyım; aynı zamanda University of Nebraska Medical Center'da Farmakoloji ve Deneysel Nörobilim Bölümü'nde profesör ve bölüm başkanıyım. Genel amacımız, antiretroviral ilaçları basitleştirerek onlara erişimi kolaylaştırmak, biyodağılımlarını ve farmakokinetiklerini iyileştirmektir.

Şimdi sizi, araştırma laboratuvarına götürerek bu nanopartiküllerin üretiminin ve geliştirilmesinin nasıl yapıldığını gösterecek olan Ari ve Sean'a bırakıyorum. Nebraska Tıp Merkezi'ndeki klinik fayda ve geliştirme çalışmaları kapsamında, ıslak öğütme yoluyla nano art üretimi gerçekleştirilecektir. İlk olarak, nano formülasyonların hazırlanmasında kullanılacak ilaç kristalleri ve çeşitli sürfaktanlar tartılır ve T 18 ultra Turx karıştırıcı kullanılarak tamamen dağılana kadar 10 millimolar heis tamponu pH 7.8 ile karıştırılır; sürekli öğütme için formülasyondaki ilaç yüzdesi %1 ile %2 arasında olmalıdır.

Soğutucunun ve kompresörün açık olduğundan ve çıkış basıncının şu anda yaklaşık 100 PSI olduğundan emin olun; ardından öğütme ortamının tanka yüklenebileceği şekilde düzenleme yapın ve öğütme haznesine 50 mililitre boncuk ekleyin. Mekanik sızdırmazlık elemanında sızıntı oluşmasını önlemek için bir huni kullanarak dişlerde veya öğütme haznesinin dışındaki herhangi bir yerde boncuk kalmadığından emin olun. Şimdi, O-ringin öğütme haznesindeki yerinde olduğundan emin olun.

Ardından uygun bir elek gözenek boyutu seçin ve somunları sıkarak kapakları sabitleyin. Elek gözenek boyutu, boncuk boyutunun en az yarısı kadar olmalıdır. Sürekli öğütme sırasında ürünün filtreyi tıkamasını önlemek için büyük bir elek gözenek boyutu kullanın.

Öğütme haznesini indirdikten sonra, çeşitli miktarlarda sürfaktan içeren ilaç süspansiyonunu ürün girişine ekleyin. Süspansiyonun minimum hacmi 100 milliliters olmalıdır. Bu, öğütme haznesinin aşırı ısınmasını önleyecek ve parçaların daha az aşınması sayesinde boncuk kontaminasyonunun önüne geçecektir.

Ardından, pompayı çalıştırın. Formülasyonunuz için kontrol ünitesini kullanarak akış hızını değiştirmek gereklidir. Daha sonra karıştırıcıyı açın ve kontrol ünitesi üzerinden hızı ayarlayın.

Hız, dakikada 600 devirden dakikada 4.320 devire kadar artırılabilir. Bir micro sur üzerinde, aşırı ısınma olmadığından emin olmak için öğütme haznesinin üst kısmında bulunan sıcaklık göstergesini kullanarak sıcaklığı izleyin. Şimdi numuneyi çeşitli hızlarda ve akış hızlarında öğütün ve difraksiyon ışık saçılımı malvern zeta sizer kullanarak boyut ve yük ölçümleri yapmak için formülasyondan yaklaşık bir mililitrelik küçük alikotlar alın.

İstenen boyut elde edildikten sonra, kontrol ünitesini kullanarak öğütmeyi durdurun ve pompa hâlâ çalışırken, ilacın tamamen süzülmesini sağlayarak örneği bir erlene toplayın. İşlem bittiğinde pompayı kapatmayı ve boncukları çıkarıp temizlemeyi unutmayın. Şimdi değirmen süspansiyonunu 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve santrifüjü 30 dakika boyunca dakikada 10.000 devir olacak şekilde ayarlayın.

Santrifüj döngüsü tamamlandığında, üst faz miktarını ölçün ve aynı miktarda taze sürfaktan çözeltisi ile değiştirin. Resüspansiyon işlemi tamamlandığında, süspansiyonu öğütme haznesine aktarın ve 10 dakika boyunca öğütün. Yaklaşık bir mililitrelik bir alikot alın ve Zeta sizer kullanarak örneğin boyutunu ve yükünü tekrar ölçün.

Son olarak, homojenizasyon yoluyla nano sanat üretmek için nano sanat formülasyonlarının konsantrasyonunu HBLC kullanarak ölçün. Avastin Emulex C five kullanarak, ilaç kristallerini ve çeşitli sürfaktanları daha önce açıklandığı gibi hazırlayın, ardından süspansiyonu homojenizasyon kabına aktarın ve resirkülasyonu başlatın. Numuneyi homojenize etmeye başlamadan önce soğutucunun açık olduğundan emin olun.

Basıncı, gösterge 20, 000 artı veya eksi 2000 PSI değerini okuyana kadar kademeli olarak artırın ve hedef partikül boyutu elde edilene kadar homojenizasyona devam edin. Bu işlem genellikle 45 ile 60 dakika arasında sürer. Periyodik olarak yaklaşık bir mililitre Eloqua alın ve daha önce açıklanan homojenize süspansiyon yöntemiyle, bir zeta sizer santrifüj kullanarak örneğin boyutunu ve yükünü ölçün.

Ardından Resus süspansiyonundan sonra, süspansiyonu C five homojenizatörüne aktarın. Sirkülasyonu yeniden başlatın ve homojenizasyon basıncını 20.000 ± 2000 PSI değerine geri getirip 30 dakika boyunca homojenize edin; ardından soğuk Palmer ultrasonik işlemciyi kullanarak sonikasyon yoluyla üretim yapın. Klorometan PLGA ve ilaç çözeltisini %1'lik PVA sürfaktan çözeltisinin içine dökün ve ultrasonik cihaz içindeki buz banyosuna yerleştirin.

Sonikasyonu %50 amplitude ile başlatın; ancak daha küçük numune grupları için amplitude yaklaşık %30'a düşürülebilir, numuneyi 10 dakika boyunca sonikate edin. Partikül boyutu analizi için küçük bir alikot alın. Partiküllerin boyutu 1.5 mikronun üzerindeyse, numuneleri toplamda maksimum 16 dakikaya kadar ikişer dakikalık aralıklarla sonikate edin.

Numuneleri mikroskop altında 20 kat büyütmede gözlemleyin ve gözlemleri belgeleyin. Süspansiyon için yeterli bir vorteks oluşturmak amacıyla bir manyetik karıştırıcı kullanın ve oda sıcaklığında gece boyunca karıştırmaya devam edin. 24 saat sonra süspansiyonu toplayın ve 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın.

Numuneleri 5 °C'de, dakikada 8.000 devir hızında 20 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı uzaklaştırın ve numunenin yarısını 75 mililitre filtrelenmiş ters ozmoz suyunda, diğer yarısını ise 75 mililitre %0,5 CTAB trimetil amonyum bromür sürfaktanında yeniden süspande edin. Numuneleri tekrar 5 °C'de, dakikada 8.000 devir hızında 20 dakika boyunca santrifüj edin ve her bir peleti toplam 20 mililitre mannitol çözeltisi ile yeniden süspande edin. Son olarak, homojenizasyon veya sonikasyon yoluyla üretilen partiküller için, partikül boyutunu zeta sizer kullanarak ölçün ve numunelerin konsantrasyonunu HPLC kullanarak belirleyin.

Mikroskopi ile görüntülemeye hazırlık için, hazırlanan nano sanat süspansiyonlarını alın ve 10 saniye boyunca sonikasyona tabi tutun. Bir sonikasyon probu ile %20 amplitudda, bir mikroskop lam örtü camı alın ve bunu ters mikroskoba yerleştirin. Örtü camının üzerine.

15 µL nano art süspansiyonunu 100 µL fosfat tamponlu salin ile karıştırın ve pipetle birkaç kez aşağı yukarı çekerek harmanlayın. Ardından, morfolojiyi gözlemlemek için nanopartikülleri 20x objektif kullanarak görselleştirin. Numuneler taramalı elektron mikroskobu ile görselleştirme için de hazırlanabilir.

Burada, kan kaynaklı monositlerin santrifüjle izole edilmesinin ardından, 1 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonda aşağıdaki katkı maddeleriyle desteklenmiş DMEM'e saflaştırılmış monositlerin eklendiği A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F düşük voltajlı alan emisyonlu taramalı elektron mikroskobuyla elde edilen görüntüleri görüyoruz. Ardından, monositlerin makrofajlara farklılaşmasını sağlamak, hücre alımını ve toplanmasını analiz etmek amacıyla, %5 karbondioksit ile desteklenmiş nemli bir atmosferde, altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 2 × 10⁶ hücre ekleyerek yedi gün boyunca kültüre edin. Nano art'ı, kültür ortamı ile 100 µM final konsantrasyona gelecek şekilde karıştırın ve istenen zaman noktasında veya hücreler nano art ile tamamen yüklendiğinde her bir kuyucuğa 1 mL işlem ortamı ekleyin.

Hücreler tarafından alınmamış tüm partikülleri uzaklaştırmak için tüm tedavi ortamını uzaklaştırın ve hücreleri üç kez 1 ml PBS ile yıkayın. Yapışık hücreleri kuyucuğun altından bir hücre kaldırıcı (cell lifter) kullanarak alın ve 1,7 ml'lik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Ardından hücreleri 4 °C'de, 1000 RCF'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri liz etmek için 200 µL %100 Metanol ekleyin; ardından nano art'ı çözmek için peleti bir sonik prob ile %20 amplitütta iki ila beş saniye boyunca kısaca sonikasyona tabi tutun. Örnekleri, ilaç içeriği analizine hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. Nano art'ın hücre içi tutulumu, burada görüldüğü gibi mikrotom ile kesitler hazırlandıktan sonra transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak da görselleştirilebilir.

Hücre alımı ve toplama analizleri için daha önce açıklandığı gibi, nano arch salınım işlemine tabi tutulan hücrelerin analizine ilişkin detaylar için bu makalenin beraberindeki metne bakınız. Ancak, hücreleri yıkadıktan sonra toplamak yerine, belirtilen günlerde veya besiyerinin sarıya dönmesiyle belirtildiği üzere PBS'yi, MCSF ve nano art içermeyen iki mililitre hücre kültürü besiyeri ile değiştirin; istenen günde besiyerinin yarısını yenileyin. Tekrarlayan hücrelerle birlikte bir mililitre hücre besiyerini toplayın ve ilaç analizi için işleme alın.

Nano art bifokal mikroskopisi ile gerçek zamanlı alımı görselleştirmek için, öncelikle vibrant gibi bir DRE alın ve bunu besiyerine ekleyin. Üretici talimatlarını takip ederek, boya içeren besiyerini olgun monosit türevli makrofajlara ekleyin ve ardından fazla boyayı uzaklaştırmak için hücreleri bir mililitre kültür besiyeri kullanarak üç kez durulayın. Şimdi, floresanla işaretlenmiş nano art kullanılarak nano art'ı kültür besiyeri ile karıştırın ve işaretli nano art içeren tedavi besiyerini ekleyin. Konfokal mikroskop ile görüntüleme yapmadan hemen önce, 60x objektif kullanarak dört saat boyunca her 30 saniyede bir görüntü yakalayın.

Son olarak, HIV-1 enfeksiyonu ve enfektivite analizleri gerçekleştirilebilir. Öncelikle hücrelere, art salınımının görüntülenmesi için açıklanan şekilde işlem uygulayın. Ardından istenen günlerde, tüm besiyerini uzaklaştırın ve yerine hücre başına 0,01 viral partikül enfeksiyon multiplicities (MOI) değerinde HIV-1 AA içeren MCSF'siz besiyeri ekleyerek 24 saat boyunca inkübe edin.

Ardından viral medyumu uzaklaştırın ve taze virüsle değiştirin, hücreleri virüssüz medya kültüründe 10 gün boyunca büyütün; hücreleri enfeksiyondan sonraki 10 gün boyunca hayatta tutmak için gün aşırı veya gerektiğinde medyumun yarısını değiştirin. 96 kuyucuklu plakaya yerleştirilen her kuyucuktan 10 µL medyum toplayın ve ters transkriptaz analizi yapılana kadar -80 °C'de saklayın. Müteakiben HIV-1 p24 tespitleri de gerçekleştirilebilir.

Burada, nano sanat uygulamasından bir gün sonra 0,01 multiplikasyon enfeksiyonu ile virüse maruz bırakılan hücrelerin morfolojisini kolayca görebiliriz. Bu monosit türevli makrofajlarda viral enfeksiyona dair herhangi bir kanıt yoktur ve nanopartiküller hücre sitoplazması içinde rahatlıkla görülmektedir. Burada hücreler, nano sanat uygulamasından 10 gün sonra virüse maruz bırakılmıştır.

Bu hücrelerin bazılarında P 24 boyaması ve çok çekirdekli dev hücre oluşumu ile belirtildiği üzere enfeksiyon görülmüştür, ancak tedavi edilmemiş hücrelerle karşılaştırıldığında hala belirgin bir koruma söz konusudur. B'deki hücrelerin sitoplazması içinde nanoparçacıkların hala görünür olduğu, ancak a'da görüldüğü kadar yoğun olmadığına dikkat edin; bu yapılar nano art ile tedavi edilmeyen hücrelerde mevcut değildir. Bu canlı hücre konfokal videolarında, yeşil ile işaretlenmiş makrofajlar ve kırmızı ile işaretlenmiş nano art görülmektedir.

Burada hücrelerin çok az sayıda nanoparçacık biriktirdiğini görebiliriz. Burada ise, artan kırmızı floresans ile belirtildiği üzere, parçacıklar hızla birikmektedir. Bu farklılıklar, HPLC kullanarak ilaç alımı analiz edildiğinde görülen bulgularla paralellik göstermektedir; ayrıca, hücrelerin parçacıkları aktif olarak aldığını görebiliyoruz.

Hücresel nano sanat birikim hızları arasındaki fark; boyut, şekil ve yük gibi fiziksel özelliklerin, makrofajların nano sanatı alma ve tutma yetenekleri üzerindeki etkilerini yansıtmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, ıslak öğütme homojenizasyonu ve sonikasyon tekniklerini kullanarak nano sanatın nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bunlar, antiretroviral nanoparçacıklar üretmek için etkili yöntemlerdir.

Islak öğütme ve homojenizasyon, daha büyük ilaç kristal partiküllerini lipid sürfaktanlar içinde daha küçük nanopartiküllere ayırmaya yararken, sonikasyon tekniği bir polimer içinde nano boyutlu bireysel ilaç damlacıkları üretir. Burada ayrıca, nano sanat taşınımını değerlendirmek için bir test platformu olarak insan monosit türevli makrofajların nasıl kullanılacağını da gösterdik. Test yöntemimiz, bir partikülün hücreler tarafından alınma, tutulma ve salınma yeteneğinin yanı sıra viral replikasyonu inhibe etme kapasitesinin çok basit bir şekilde taranmasına olanak tanır.

Bu durum, araştırmacının in vivo ortamda ve nihayetinde enfekte insanlarda kullanımda başarı şansı en yüksek olan nano sanatı tanımlamasına olanak tanır. Bu deneylerin tam sonuçları Online Nano makalemizde yayınlanmıştır. Makale, Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010'da "Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics" başlığıyla yer almaktadır.

Çok teşekkür ederim.