Kan Bazlı Makrofaj Taşıma Nanoformulated antiretroviral ilaçlar Geliştirme Yöntemleri

Bu prosedürün amacı, nano art olarak adlandırdığımız kristal antiretroviral nanopartiküllerin üretilmesi ve bunların hücresel alımını, salınımını ve antiretroviral özelliklerinin test edilmesidir. Bu işlem, öncelikle antiretroviral ilaçların sonikasyon homojenizasyonu veya yaş öğütme yoluyla işlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, primer monositlerin karşı akımlı santrifügasyonla izole edilmesinin ardından nano art partiküllerinin fiziksel özelliklerinin karakterize edilmesidir.

Bunlar, monosit türevli makrofajlara farklılaşmalarını tetikleyen makrofaj kolonisi uyarıcı faktör (MCSF) içeren DMEM içinde yedi gün boyunca kültüre edilir. Üçüncü adım, nano ART'nin insan monosit türevli makrofajlar tarafından alınmasını, tutulmasını ve salınmasını test etmektir. Prosedürün son adımı, nano ART'nin monosit türevli makrofajlardaki in vitro antiretroviral etkinliğini test etmektir.

Nihayetinde, nano sanatın hücreler tarafından kolaylaştırılmış alımını, hücrelerden yavaş salınımını ve güçlü antiretroviral etkinliğini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bunlar, yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC ile ilaç seviyelerinin ölçülmesiyle ve enfekte kültür süpernatan materyallerinin ters transkriptaz aktivitesinin ölçülmesiyle test edilerek belirlenir. Merhaba, ben Hanta Aldi; Nebraska Tıp Merkezi'nde Dr. Howard Gelman'ın laboratuvarında doktora sonrası araştırma görevlisiyim.

Sunduğumuz yöntemler, hücre tabanlı ilaç iletim sistemlerinin translasyonel araştırma faaliyetlerini geliştirmek için nasıl kullanılabileceği de dahil olmak üzere nanotıptaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu, uzatılmış yarı ömürlere sahip nano formüle edilmiş antiretroviral tedavi kullanılarak başarılabilir. Çalışmalarımız, nano art'ın klinik kullanım potansiyelini desteklemektedir.

Merhaba, benim adım Ari Noche; Carol Schwartz Emerging Neuroscience Laboratuvarı'nda çalışan bir MD PhD öğrencisiyim. Dr. Gendelman'ın rehberliğinde, burada size gösterdiğimiz tekniklerin kapsamı antiretroviral tedaviye kadar uzanmaktadır; çünkü nano formüle edilmiş bileşikler, ilaçla ilişkili yan etkileri azaltırken aynı zamanda biyoyararlanımı ve farmakokinetiği eş zamanlı olarak iyileştirebilir. Klinik olarak mevcut antiretroviral ilaçları alıp bunları nanoparçacıklar şeklinde yeniden paketleyerek, tedaviye uyumu artırabilir ve hastalık sonuçlarını olumlu yönde etkileyebiliriz.

Merhaba, ben Dr. Howard Gendelman. Klinik bilim insanıyım ve burada, Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Farmakoloji ve Deneysel Nörobilim Bölümü'nün profesörü ve başkanıyım. Genel amacımız, antiretroviral ilaçları kolayca erişilebilir hale getirmek için basitleştirmek ve biyodağılımlarını ve farmakokinetiklerini iyileştirmektir.

Şimdi, sizi araştırma laboratuvarına götürecek olan ve bu nanopartiküllerin üretiminin ve geliştirilmesinin nasıl yapıldığını gösterecek olan Ari ve Sean'a sözü bırakıyorum. Nebraska Tıp Merkezi'ndeki klinik fayda ve geliştirme çalışmaları kapsamında, ıslak öğütme yoluyla nano art üretimi gerçekleştirilecektir. İlk olarak, nano formülasyonları hazırlamak için kullanılacak ilaç kristalleri ve çeşitli sürfaktanları tartın ve bunları, T 18 ultra Turx karıştırıcı kullanarak tamamen dağılana kadar 10 millimolar heis tamponu pH 7.8 ile karıştırın; sürekli öğütme işlemi için formülasyondaki ilaç yüzdesi %1 ile %2 arasında olmalıdır.

Soğutucunun ve kompresörün açık olduğundan ve çıkış basıncının yaklaşık 100 PSI olduğundan emin olun; ardından öğütme ortamının tanka yüklenebileceği şekilde kurulumu yapın ve öğütme haznesine 50 mililitre boncuk ekleyin. Mekanik sızdırmazlık elemanında sızıntı oluşmasını önlemek için bir huni kullanarak dişlerde veya öğütme haznesinin dışındaki herhangi bir yerde boncuk kalmadığından emin olun. Şimdi, O-ringanın öğütme haznesinde yerinde olduğundan emin olun.

Ardından uygun bir elek gözenek boyutu seçin ve somunları sıkarak kapakları sabitleyin. Elek gözenek boyutu, boncukların boyutunun en az yarısı kadar olmalıdır. Sürekli öğütme sırasında ürünün filtreyi tıkamasını önlemek için geniş bir elek gözenek boyutu kullanın.

Öğütme haznesini indirdikten sonra, ürün girişine çeşitli miktarlarda sürfaktan içeren ilaç süspansiyonunu ekleyin. Süspansiyonun minimum hacmi 100 mililitre olmalıdır. Bu, öğütme haznesinin aşırı ısınmasını önleyecek ve ayrıca parçalardaki aşınmayı azaltarak boncuk kontaminasyonunun önüne geçecektir.

Ardından, pompayı çalıştırın. Formülasyonunuz için kontrol ünitesini kullanarak akış hızını değiştirmek gerekir. Sonra karıştırıcıyı açın ve hızını kontrol ünitesi üzerinden ayarlayın.

Hız, dakikada 600 devirden 4.320 devire kadar artırılabilir. Bir mikro sür üzerinde, aşırı ısınma olmadığından emin olmak için öğütme haznesinin üst kısmına takılı olan sıcaklık göstergesini kullanarak sıcaklığı izleyin. Şimdi numuneyi çeşitli hızlarda ve akış hızlarında öğütün ve diffraction light scattering malvern zeta sizer kullanarak boyut ve yük ölçümleri yapmak için formülasyondan yaklaşık bir mililitre hacminde küçük alikotlar alın.

İstenen boyut elde edildikten sonra, kontrol ünitesini kullanarak öğütme işlemini durdurun ve pompa hâlâ çalışırken, ilacın tamamen süzülmesini sağlayarak örneği bir balon jojeye toplayın. İşlem tamamlandığında pompayı kapatmayı, boncukları çıkarmayı ve temizlemeyi unutmayın. Şimdi öğütme süspansiyonunu 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve santrifüjü 30 dakika boyunca dakikada 10.000 devir hızına ayarlayın.

Santrifüj döngüsü tamamlandığında, süpernatant miktarını ölçün ve aynı miktarda taze sürfaktan çözeltisi ile değiştirin. Resüspansiyon işlemi tamamlandığında, süspansiyonu öğütme haznesine aktarın ve 10 dakika boyunca öğütün. Yaklaşık bir mililitrelik bir alikot alın ve Zeta sizer kullanarak numunenin boyutunu ve yükünü tekrar ölçün.

Son olarak, homojenizasyon yoluyla nano sanat üretmek için HPLC kullanarak nano sanat formülasyonlarının konsantrasyonunu ölçün. Avastin Emulex C beş kullanarak, ilaç kristallerini ve çeşitli sürfaktanları daha önce açıklanan şekilde hazırlayın, ardından süspansiyonu homojenizasyon haznesine aktarın ve yeniden dolaşımı başlatın. Numuneyi homojenize etmeye başlamadan önce soğutucunun açık olduğundan emin olun.

Basıncı, gösterge 20.000 ± 2000 PSI değerini okuyana kadar kademeli olarak artırın ve hedef partikül boyutu elde edilene kadar homojenizasyona devam edin. Bu işlem genellikle 45 ila 60 dakika sürer. Periyodik olarak yaklaşık bir mililitre Eloqua alın ve daha önce açıklanan homojenize süspansiyon yöntemiyle, bir zeta sizer santrifüj kullanarak numunenin boyutunu ve yükünü ölçün.

Ardından Resus süspansiyonundan sonra, süspansiyonu C five homojenizatörüne aktarın. Sirkülasyonu yeniden başlatın, homojenizasyon basıncını 20,000 ± 2000 PSI değerine getirin ve Cold Palmer ultrasonik işlemciyi kullanarak sonikasyon yoluyla üretim yapmak için 30 dakika boyunca homojenize edin. Klorometan PLGA ve ilaç çözeltisini %1 PVA sürfaktan çözeltisine dökün ve ultrasonik cihazla birlikte buz banyosuna yerleştirin.

Sonikasyonu %50 amplitude ile başlatın; ancak daha küçük numune grupları için amplitude yaklaşık %30'a düşürülebilir, numuneyi 10 dakika boyunca sonike edin. Partikül boyutu analizi için küçük bir alikot alın. Eğer partikül boyutu 1,5 mikronun üzerindeyse, toplamda maksimum 16 dakikaya kadar ikişer dakikalık aralıklarla numuneleri sonike etmeye devam edin.

Numuneleri mikroskop altında 20 kat büyütmede gözlemleyin ve bulguları belgeleyin. Süspansiyon için yeterli bir girdap oluşturmak amacıyla bir manyetik karıştırıcı kullanın ve oda sıcaklığında gece boyunca karıştırmaya devam edin. 24 saat sonra süspansiyonu toplayın ve 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın.

Numuneleri 5 °C'de 20 dakika boyunca dakikada 8.000 devir hızla santrifüjleyin. Süpernatanı dökün ve numunenin yarısını 75 ml filtrelenmiş ters osmoz suyunda, diğer yarısını ise 75 ml %0,5 CTAB trimetil amonyum bromür sürfaktanında yeniden süspande edin. Numuneleri tekrar 5 °C'de 20 dakika boyunca dakikada 8.000 devir hızla santrifüjleyin ve her bir peleti toplam 20 ml mannitol çözeltisi ile yeniden süspande edin. Son olarak, homojenizasyon veya sonikasyon yoluyla üretilen partiküller için, partikül boyutunu zeta sizer kullanarak ve numune konsantrasyonunu HPLC kullanarak ölçün.

Mikroskopi ile görselleştirme hazırlığı için, hazırlanmış nano sanat süspansiyonlarını alın ve 10 saniye boyunca sonikasyona tabi tutun. Bir sonikasyon probu ile %20 amplitudda, bir mikroskop lam kapatı alın ve bunu ters mikroskopa yerleştirin. Kapatının üzerine.

15 µL nano art süspansiyonunu 100 µL fosfat tamponlu salin ile karıştırın ve pipetle birkaç kez çekip bırakarak karıştırın. Ardından, morfolojiyi gözlemlemek için nanopartikülleri 20x objektif kullanarak görüntüleyin. Örnekler, taramalı elektron mikroskobu ile görüntüleme için de hazırlanabilir.

Burada, kan kaynaklı monositlerin santrifüjle izole edilmesinin ardından, 1x10⁶ hücre/mL konsantrasyondaki saflaştırılmış monositlerin aşağıdaki katkı maddeleriyle desteklenmiş DMEM'e eklenmesinden sonra A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F düşük voltajlı alan emisyonlu taramalı elektron mikroskobundan elde edilen görüntüleri görüyoruz. Ardından, monositlerin makrofajlara farklılaşmasını sağlamak amacıyla, hücreleri %5 karbondioksit ile desteklenmiş nemli bir atmosferde, altı kuyucuklu plakaların her kuyucuğuna 2x10⁶ hücre olacak şekilde ekleyin ve hücre alma ve toplama analizleri için yedi gün boyunca kültüre edin. Nano art'ı kültür medyumu ile 100 µM final konsantrasyona gelecek şekilde karıştırın ve istenen zaman noktasında veya hücreler nano art ile tamamen yüklendiğinde her kuyucuğa 1 mL işlem medyumu ekleyin.

Hücreler tarafından alınmamış parçacıkları uzaklaştırmak için tüm tedavi ortamını boşaltın ve hücreleri bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Yapışkan hücreleri kuyucuk tabanından bir hücre kaldırıcı (cell lifter) kullanarak çıkarın ve 1,7 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Ardından hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1000 RCF'de santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri liz etmek için 200 µL %100 Metanol ekleyin; ardından pelletle bir sonic probe kullanarak %20 genlikte iki ila beş saniye boyunca kısa süreli sonikasyon uygulayarak nano art'ı çözün. Numuneleri, ilaç içeriği analizi yapılana kadar -80 °C'de saklayın. Nano art'ın hücre içi tutulumu, burada görüldüğü gibi bir mikrotom ile kesitler hazırlandıktan sonra transmisyon elektron mikroskopisi kullanılarak da görselleştirilebilir.

Nano arch salınımını analiz etmek için, hücrelerin daha önce hücre alımı ve toplama analizleri için tanımlandığı şekilde işleme tabi tutulmasıyla ilgili ayrıntılar için bu makaleye eşlik eden metne bakınız. Ancak, yıkama işleminden sonra hücreleri toplamak yerine, belirtilen günlerde veya medyumun sararmasıyla belirtildiği üzere, PBS'yi MCSF ve nano art içermeyen iki mililitre hücre kültürü medyumu ile değiştirin; istenen günde medyumun yarısını değiştirin. Tekrarlayan hücrelerle birlikte bir mililitre hücre medyumunu toplayın ve ilaç analizi için işleyin.

Nano art bifokal mikroskobisi ile gerçek zamanlı alımı görüntülemek için, öncelikle vibrant gibi bir DRE alın ve bunu besiyerine ekleyin. Üretici talimatlarını izleyerek, boya içeren besiyerini olgun monosit kaynaklı makrofajlara ekleyin ve ardından fazla boyayı uzaklaştırmak için hücreleri bir mililitre kültür besiyeri kullanarak üç kez durulayın. Şimdi, floresan işaretli nano art kullanarak nano artı kültür besiyeri ile karıştırın ve işaretli nano art içeren tedavi besiyerini ekleyin. Konfokal mikroskop ile görüntülemeden hemen önce, 60x objektif kullanarak dört saat boyunca her 30 saniyede bir görüntü yakalayın.

Son olarak, HIV-1 enfeksiyon ve enfektivite analizleri gerçekleştirilebilir. Öncelikle hücreleri, art salınımının görüntülenmesi için açıklanan şekilde işlemden geçirin. Ardından istenen günlerde tüm besiyerini uzaklaştırın ve yerine, hücre başına 0,01 viral partikül enfeksiyon çokluğuyla HIV-1 a A içeren MCSF'siz besiyeri ekleyip 24 saat boyunca inkübe edin.

Ardından viral medyumu uzaklaştırın ve taze virüs ile değiştirin, hücre kültürlerini 10 gün boyunca virüssüz medyada büyütün; hücreleri enfeksiyondan sonraki 10 gün boyunca canlı tutmak için gün aşırı veya gerektiğinde medyumun yarısını değiştirin. Her kuyucuktan 10 µL medyum toplayarak 96 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin ve ters transkriptaz analizi yapana kadar -80 °C'de saklayın. Sonrasında HIV-1 p24 tespitleri de gerçekleştirilebilir.

Burada, nano art işleminin üzerinden 0,01 multiplikasyon enfeksiyon düzeyiyle virüse maruz bırakılan hücrelerin morfolojisini kolayca görebiliriz. Bu monosit türevli makrofajlarda, viral enfeksiyonun hiçbir kanıtı yoktur ve nanopartiküller hücre sitoplazması içinde kolayca görülebilmektedir. Burada hücreler, nano art işleminden 10 gün sonra virüse maruz bırakılmıştır.

Bu hücrelerin bazılarında, P 24 boyaması ve çok çekirdekli dev hücre oluşumuyla belirtildiği üzere enfeksiyon gerçekleşmiştir; ancak, tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla hâlâ belirgin bir koruma söz konusudur. Nanopartiküllerin B'deki hücrelerin sitoplazması içinde hâlâ görünür olduğunu, ancak a'da görüldüğü kadar yoğun olmadığını; bu yapıların nano art ile tedavi edilmeyen hücrelerde mevcut olmadığını not edin. Bu canlı hücre konfokal videolarında, yeşil ile işaretlenmiş makrofajları ve kırmızı ile işaretlenmiş nano art'ı görmekteyiz.

Burada hücrelerin çok az sayıda nanopartikül biriktirdiğini görebiliyoruz. Burada ise artan kırmızı floresanla belirtildiği üzere partikülleri hızla biriktiriyorlar. Bu farklılıklar, HPLC kullanarak ilaç alımı analiz edildiğinde görülen bulgularla paralellik göstermektedir; ek olarak, hücrelerin partikülleri aktif olarak aldığını görebiliyoruz.

Hücresel nano sanat birikim hızları arasındaki fark; boyut, şekil ve yük gibi fiziksel özelliklerin, makrofajların nano sanatı alma ve tutma yetenekleri üzerindeki etkilerini yansıtmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, ıslak öğütme homojenizasyonu ve sonikasyon tekniklerini kullanarak nano sanatın nasıl üretileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız. Bunlar, antiretroviral nanopartiküller üretmek için etkili yöntemlerdir.

Islak öğütme ve homojenizasyon, daha büyük ilaç kristal partiküllerinin lipid sürfaktanlar içinde daha küçük nanopartiküllere ayrılmasını sağlarken, sonikasyon tekniği bir polimer içinde nano boyutlu bireysel ilaç damlacıkları üretir. Burada ayrıca, nano ilaç transportunu değerlendirmek için bir test platformu olarak insan monosit türevli makrofajların nasıl kullanılacağını da gösterdik. Test yöntemimiz, bir partikülün hücreler tarafından alınma, tutulma ve salınma yeteneğinin yanı verilen viral replikasyonu inhibe etme kapasitesinin oldukça basit bir şekilde taranmasına olanak tanır.

Bu, araştırmacının in vivo ortamda başarılı olma şansı en yüksek olan ve nihayetinde enfekte insanlarda kullanılabilecek nano sanatı belirlemesine olanak tanır. Bu deneylerin tüm sonuçları Online Nano makalemizde yayınlanmıştır. Makale, Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010'da yayınlanan "Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics" başlığını taşımaktadır.

Çok teşekkür ederim.