Kan Bazlı Makrofaj Taşıma Nanoformulated antiretroviral ilaçlar Geliştirme Yöntemleri

Bu prosedürün amacı, "nano art" olarak adlandırdığımız kristal antiretroviral nanopartiküller üretmek ve bunların hücresel alımını, salınımını ve antiretroviral özelliklerini test etmektir. Bu işlem, öncelikle antiretroviral ilaçların sonikasyon homojenizasyonu veya yaş öğütme ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, primer monositlerin karşı akımlı santrifüjasyon ile izole edilmesinin ardından nano art partiküllerinin fiziksel özelliklerini karakterize etmektir.

Bunlar, monosit kaynaklı makrofajlara farklılaşmalarını tetikleyen makrofaj kolonisi uyarıcı faktör veya MCSF içeren DMEM içerisinde yedi gün boyunca kültüre edilirler. Üçüncü adım, nano art'ın insan monosit kaynaklı makrofajlardaki alımını, tutulmasını ve salınımını test etmektir. Prosedürün son adımı, nano art'ın monosit kaynaklı makrofajlardaki in vitro antiretroviral etkinliğini test etmektir.

Nihayetinde, nano sanatın hücreler tarafından kolaylaştırılmış alımını, hücrelerden yavaş salınımını ve güçlü antiretroviral etkinliği gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bunlar, yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC ile ilaç seviyelerinin ölçümleriyle ve enfekte kültür süpernatant materyallerinin ters transkriptaz aktivitesi ölçümüyle test edilmesiyle belirlenir. Merhaba, ben Hanta Aldi ve Nebraska Tıp Merkezi'nde Dr. Howard Gelman'ın laboratuvarında doktora sonrası araştırma görevlisiyim.

Sunduğumuz yöntemler, hücre tabanlı ilaç iletim sistemlerinin translasyonel araştırma faaliyetlerini geliştirmek için nasıl kullanılabileceği dahil olmak üzere nanotıptaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu, uzatılmış yarı ömre sahip nano formüle edilmiş antiretroviral terapi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Çalışmalarımız, nano art'ın klinik kullanım potansiyelini desteklemektedir.

Merhaba, benim adım Ari Noche; Carol Schwartz Gelişen Nörobilim Laboratuvarı'nda çalışan bir MD PhD öğrencisiyim. Dr. Gendelman'ın rehberliğinde, burada size gösterdiğimiz tekniklerin kapsamı antiretroviral tedaviye kadar uzanmaktadır; çünkü nano formüle edilmiş bileşikler, ilaçla ilgili yan etkileri azaltırken aynı zamanda biyoyararlanımı ve farmakokinetiği eş zamanlı olarak iyileştirebilir. Klinik olarak mevcut antiretroviral ilaçları alıp onları nanoparçacıklar şeklinde yeniden paketleyerek, uyumu artırabilir ve hastalık sonuçlarını olumlu yönde etkileyebiliriz.

Merhaba, ben Dr. Howard Gendelman. Klinik bilim insanıyım; Nebraska Tıp Merkezi'nde Farmakoloji ve Deneysel Nörobilim Bölümü'nde profesör ve bölüm başkanıyım. Genel amacımız, antiretroviral ilaçları basitleştirerek onları kolayca erişilebilir hale getirmek, biyodağılımlarını ve farmakokinetiklerini iyileştirmektir.

Şimdi sizi, araştırma laboratuvarına götürüp bu nanoparçacıkların üretiminin ve geliştirilmesinin nasıl yapıldığını gösterecek olan Ari ve Sean'a bırakıyorum. Nebraska Tıp Merkezi Üniversitesindeki klinik fayda ve geliştirme çalışmaları kapsamında, yaş öğütme yoluyla nano art üretmek için; öncelikle nano formülasyonları hazırlamak için kullanılacak ilaç kristallerini ve çeşitli sürfaktanları tartın ve bunları T 18 ultra Turrax karıştırıcı kullanarak tamamen dağılana kadar 10 mM HEPES tamponu (pH 7.8) ile karıştırın. Sürekli öğütme işlemi için formülasyondaki ilaç yüzdesi %1 ile %2 arasında olmalıdır.

Soğutucunun ve kompresörün açık olduğundan ve çıkış basıncının yaklaşık 100 PSI olduğundan emin olun; ardından öğütme ortamının tanka yüklenebileceği şekilde düzenleme yapın ve öğütme haznesine 50 milliliters boncuk ekleyin. Mekanik sızdırmazlık elemanında sızıntıları önlemek için bir huni kullanarak dişlerde veya öğütme haznesinin dışında herhangi bir boncuk kalmadığından emin olun. Şimdi, O-ringanın değirmen haznesinde yerinde olduğundan emin olun.

Ardından uygun bir elek gözenek boyutu seçin ve somunları sıkarak kapakları sabitleyin. Elek gözenek boyutu, boncuk boyutunun en az yarısı kadar olmalıdır. Sürekli öğütme sırasında ürünün filtreyi tıkamasını önlemek için geniş bir elek gözenek boyutu kullanın.

Öğütme haznesi indirildikten sonra, farklı miktarlarda sürfaktan içeren ilaç süspansiyonunu ürün girişine ekleyin. Süspansiyonun minimum hacmi 100 milliliters olmalıdır. Bu, öğütme haznesinin aşırı ısınmasını önleyecek ve ayrıca parçaların daha az aşınması sayesinde boncuk kontaminasyonunu engelleyecektir.

Ardından pompayı çalıştırın. Formülasyonunuz için kontrol ünitesini kullanarak akış hızını değiştirmek gerekir. Daha sonra karıştırıcıyı açın ve kontrol ünitesinden hızı ayarlayın.

Hız, dakikada 600 devirden dakikada 4.320 devire kadar artırılabilir. Bir mikro sur üzerinde, aşırı ısınma olmadığından emin olmak için öğütme haznesinin üst kısmına takılı olan sıcaklık göstergesini kullanarak sıcaklığı izleyin. Şimdi numuneyi çeşitli hızlarda ve akış hızlarında öğütün ve boyut ile yük ölçümleri için bir difraksiyon ışık saçılım malvern zeta sizer kullanarak formülasyondan yaklaşık bir mililitrelik küçük alikotlar alın.

İstenen boyut elde edildikten sonra, kontrol ünitesini kullanarak öğütmeyi durdurun ve pompa hala açıkken, ilacın tamamen süzülmesini sağlayarak örneği bir erlene toplayın. İşlem tamamlandığında pompayı kapatmayı, boncukları çıkarmayı ve temizlemeyi unutmayın. Şimdi öğütme süspansiyonunu 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve santrifüjü 30 dakika boyunca dakikada 10.000 devir hızına ayarlayın.

Santrifüj döngüsü tamamlandığında, süpernatant miktarını ölçün ve aynı miktarda taze sürfaktan çözeltisi ile değiştirin. Resüspansiyon işlemi tamamlandığında, süspansiyonu öğütme haznesine aktarın ve 10 dakika boyunca öğütün. Yaklaşık bir mililitrelik bir alikot alın ve Zeta sizer kullanarak örneğin boyutunu ve yükünü tekrar ölçün.

Son olarak, homojenizasyon yoluyla nano sanat üretmek için nano sanat formülasyonlarının konsantrasyonunu HPLC kullanarak ölçün. Avastin Emulex C five kullanarak, ilaç kristallerini ve çeşitli yüzey aktif maddeleri daha önce açıklandığı şekilde hazırlayın, ardından süspansiyonu homojenizasyon kabına aktarın ve resirkülasyonu başlatın. Örneği homojenize etmeye başlamadan önce soğutucunun açık olduğundan emin olun.

Basıncı, ölçer 20,000 ± 2000 PSI değerini gösterene kadar kademeli olarak artırın ve hedef partikül boyutu elde edilene kadar homojenizasyona devam edin. Bu işlem genellikle 45 ila 60 dakika sürer. Periyodik olarak yaklaşık bir mililitre alikot alın ve önceden açıklanan şekilde, homojenize edilmiş süspansiyonun boyutunu ve yükünü bir zeta sizer santrifüj kullanarak ölçün.

Ardından, Resus süspansiyonundan sonra, süspansiyonu C beş homojenizatörüne aktarın. Sirkülasyonu yeniden başlatın, homojenizasyon basıncını 20, 000 ± 2000 PSI değerine geri getirin ve soğuk Palmer ultrasonik işlemciyi kullanarak sonikasyon yoluyla üretim için 30 dakika boyunca homojenize edin. Klorometan PLGA ve ilaç çözeltisini %1'lik PVA sürfaktan çözeltisine dökün ve ultrasonik cihaz içindeki bir buz banyosuna yerleştirin.

Sonikasyonu %50 amplitude ile başlatın; ancak daha küçük numune grupları için sonikasyon amplitude değeri yaklaşık %30 amplitude değerine düşürülebilir, numuneyi 10 dakika boyunca sonike edin. Partikül boyutu analizi için küçük bir alikot alın. Eğer partikül boyutu 1,5 mikrondan büyükse, numuneleri toplamda maksimum 16 dakikaya kadar ikişer dakikalık aralıklarla sonike edin.

Numuneleri mikroskop altında 20 kat büyütmede gözlemleyin ve gözlemleri belgeleyin. Süspansiyon için yeterli vorteks oluşturmak amacıyla bir manyetik karıştırıcı kullanın ve oda sıcaklığında gece boyunca karıştırmaya devam edin. Süspansiyonu 24 saat sonra toplayın ve 50 milliliter santrifüj tüplerine aktarın.

Numuneleri 5 °C'de, dakikada 8.000 devir hızla 20 dakika boyunca santrifüjleyin; süpernatantı dekante edin ve numunenin yarısını 75 mL filtrelenmiş ters ozmos suyunda, diğer yarısını ise 75 mL %0,5 CTAB trimetil amonyum bromür sürfaktanında yeniden süspande edin. Numuneleri 5 °C'de, dakikada 8.000 devir hızla 20 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin ve her bir peleti toplam 20 mL mannitol çözeltisi ile yeniden süspande edin. Son olarak, gerek homojenizasyon gerekse sonikasyon yoluyla üretilen partiküller için, partikül boyutunu zeta sizer kullanarak ölçün ve numune konsantrasyonunu HPLC ile belirleyin.

Mikroskopi ile görüntülemeye hazırlık için, hazırlanan nano sanat süspansiyonlarını alın ve 10 saniye boyunca sonikasyona tabi tutun. Sonikasyon probu ile %20 genlikte, bir mikroskop lamı kapatma camı alın ve bunu ters mikroskoba yerleştirin. Kapatma camının üzerine.

15 µL nano art süspansiyonunu 100 µL fosfat tamponlu salin ile karıştırın ve pipetle birkaç kez aşağı yukarı çekerek harmanlayın. Ardından, morfolojiyi gözlemlemek için nano partikülleri 20x objektif kullanarak görüntüleyin. Örnekler, taramalı elektron mikroskobu ile görüntüleme için de hazırlanabilir.

Burada, kan yoluyla taşınan monositlerin santrifüj ile izolasyonunun ardından, mililitre başına 10⁶ hücre konsantrasyonunda saflaştırılmış monositlerin aşağıdaki katkı maddeleri ile desteklenmiş DMEM ortamına eklenmesi sonrası A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F düşük voltajlı alan emisyonlu taramalı elektron mikroskobundan elde edilen görüntüleri görüyoruz. Ardından, monositlerin makrofajlara farklılaşmasını sağlamak, hücre alımını analiz etmek ve toplamak amacıyla, hücreleri altı kuyucuklu plakaların her kuyucuğuna 2×10⁶ hücre olacak şekilde yerleştirin ve %5 karbon dioksit ile desteklenmiş nemli bir atmosferde yedi gün boyunca kültüre edin. Nano art'ı kültür medyası ile nihai konsantrasyonu 100 µM olacak şekilde karıştırın ve istenen zaman noktasında veya hücreler nano art ile tamamen yüklendiğinde her kuyucuğa 1 mL işlem medyumu ekleyin.

Hücreler tarafından alınmamış partikülleri uzaklaştırmak için tüm tedavi ortamını kaldırın ve hücreleri üç kez 1 mL PBS ile yıkayın. Yapışan hücreleri kuyucuğun altından bir hücre kaldırıcı kullanarak ayırın ve bunları 1,7 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Ardından hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 1000 RCF'de santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri liz etmek için 200 µL %100 Metanol ekleyin ve nano art'ı, peleti bir sonik prob ile %20 genlikte iki ila beş saniye boyunca kısaca sonike ederek çözün. Örnekleri, ilaç içeriği analizi yapılana kadar -80 °C'de saklayın. Nano art'ın hücre içi tutulumu, burada görüldüğü gibi mikrotom ile kesitler hazırlandıktan sonra transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak da görselleştirilebilir.

Nano ark salınımını analiz etmek için, hücrelerin daha önce hücre alımı ve toplanması analizi için tanımlandığı şekilde işlenmesine ilişkin ayrıntılar için bu makaleye eşlik eden metne bakınız. Ancak, yıkama sonrası hücreleri toplamak yerine, belirtilen günlerde veya ortamın sarıya dönmesiyle belirtildiği üzere, PBS'yi MCSF ve nano ark içermeyen iki mililitre hücre kültür ortamı ile değiştiriniz; istenen günde ortamın yarısını yenileyiniz. Replikate hücrelerle birlikte bir mililitre hücre ortamını toplayınız ve ilaç analizi için işleyiniz.

Nano art bifokal mikroskopisi ile gerçek zamanlı alımı görüntülemek için, öncelikle Vibrant gibi bir DRE alın ve bunu ortama ekleyin. Üretici talimatlarını izleyerek, boya içeren ortamı olgun monosit türevli makrofajlara ekleyin ve ardından fazla boyayı uzaklaştırmak için hücreleri bir mililitre kültür ortamı kullanarak üç kez durulayın. Şimdi, floresan işaretli nano art kullanarak nano art'ı kültür ortamı ile karıştırın ve işaretli nano art içeren uygulama ortamını ekleyin. Konfokal mikroskop ile görüntülemeden hemen önce, 60x objektif kullanarak dört saat boyunca her 30 saniyede bir görüntü yakalayın.

Son olarak, HIV-1 enfeksiyonu ve enfektivite analizleri gerçekleştirilebilir. Öncelikle hücreleri, art salınımının görselleştirilmesi için açıklanan şekilde işleme tabi tutun. Ardından istenilen günlerde tüm besiyerini uzaklaştırın ve bunu, hücre başına 0,01 viral partikül enfeksiyon multiplicitiesi (MOI) ile HIV-1 AA içeren MCSF'siz besiyeri ile değiştirip 24 saat boyunca inkübe edin.

Ardından viral besiyerini uzaklaştırın ve taze virüsle değiştirin, hücreleri 10 gün boyunca virüssüz besiyerinde kültüre edin; hücreleri enfeksiyondan sonraki 10 gün boyunca canlı tutmak için gün aşırı veya gerektiğinde besiyerinin yarısını yenileyin. Her kuyucuktan 10 µL besiyeri toplayarak 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın ve ters transkriptaz analizi yapılana kadar -80 °C'de saklayın. Sonrasında HIV-1 p24 tespitleri de gerçekleştirilebilir.

Burada, nano art uygulamasından 1 gün sonra 0.01 multiplikasyon enfeksiyon dozunda virüse maruz bırakılan hücrelerin morfolojisini net bir şekilde görebiliyoruz. Bu monosit kaynaklı makrofajlarda, viral enfeksiyona dair herhangi bir kanıt yoktur ve nanoparçacıklar hücre sitoplazması içerisinde kolayca görülebilmektedir. Bu örnekte hücreler, nano art uygulamasından 10 gün sonra virüse maruz bırakılmıştır.

Bu hücrelerin bir kısmı, P 24 boyaması ve çok çekirdekli dev hücre oluşumu ile belirtildiği üzere enfekte olmuştur, ancak tedavi edilmemiş hücrelerle karşılaştırıldığında hala önemli düzeyde koruma sağlanmıştır. B'deki hücrelerin sitoplazmasında nanoparçacıkların hala görünür olduğunu, ancak a'dakiler kadar çok olmadığını; nano art ile tedavi edilmeyen hücrelerde ise bu yapıların bulunmadığını not ediniz. Bu canlı hücre konfokal videolarında, yeşil ile işaretlenmiş makrofajları ve kırmızı ile işaretlenmiş nano art'ı görüyoruz.

Burada hücrelerin çok az nanoparçacık biriktirdiği görülmektedir. Burada ise artan kırmızı floresanla belirtildiği üzere parçacıklar hızla birikmektedir. Bu farklılıklar, HPLC kullanılarak yapılan ilaç alımı analizlerinde görülen bulgularla paralellik göstermektedir; ayrıca hücrelerin parçacıkları aktif olarak aldığını görebilmekteyiz.

Hücresel nano sanat birikim hızları arasındaki fark; boyut, şekil ve yük gibi fiziksel özelliklerin, makrofajların nano sanatı alma ve tutma yetenekleri üzerindeki etkilerini yansıtır. Bu videoyu izledikten sonra, ıslak öğütme homojenizasyonu ve sonikasyon tekniklerini kullanarak nano sanatın nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bunlar, antiretroviral nanoparçacıklar üretmek için etkili yöntemlerdir.

Yaş öğütme ve homojenizasyon, büyük ilaç kristal parçacıklarını lipid sürfaktanlar içerisinde daha küçük nanopartiküllere ayırmaya hizmet eder; sonikasyon tekniği ise bir polimer içerisinde bireysel nano boyutlu ilaç damlacıkları üretir. Burada ayrıca, nano ilaç taşınımını değerlendirmek için bir test platformu olarak insan monosit türevli makrofajların nasıl kullanılacağını da gösterdik. Test yöntemimiz, bir parçacığın hücreler tarafından alınma, tutulma ve salınma yeteneğinin yanı sıra viral replikasyonu inhibe etme kapasitesinin oldukça basit bir şekilde taranmasına olanak tanır.

Bu durum, araştırmacının in vivo ortamda başarılı olma ihtimali en yüksek olan ve nihayetinde enfekte insanlarda kullanılabilcek nano sanatı belirlemesine olanak tanır. Bu deneylerin tam sonuçları Online Nano makalemizde yayınlanmıştır. Makale, Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010'da yayınlanan "Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics" başlığını taşımaktadır.

Çok teşekkür ederim.