Name: Kan Bazlı Makrofaj Taşıma Nanoformulated antiretroviral ilaçlar Geliştirme Yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 46 s
Description: Öğrenin nanoART üretimini ve makrofajlarda hücresel alım, salım ve antiretroviral etkinlik testlerini. Islak öğütme, homojenizasyon ve ultrasonikasyon teknikleriyle HIV tedavisinde geliştirilmiş ilaç taşıma sistemleri geliştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe 1P01DA028555-01A1, 2R01 NS034239 2R37 NS36126, P01 NS31492, P20RR 15635, P01MH64570 ve P01 NS43985 (HEG) tarafından da desteklenmiştir. Yazarlar eleştirel okuma yazması ve üstün grafik ve edebi destek için teşekkür ederim Bayan Robin Taş. Biz onun ıslak freze uzmanlık Steve Grzelak teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca tarama ve transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri sağlamak için, Nebraska-Lincoln elektron mikroskobu çekirdek tesisin Üniversitesi Dr Han Chen teşekkür etmek istiyorum. Son olarak, canlı konfokal mikroskobi kullanarak onun uzmanlık için Megan Marquart teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+and+propagation+of+human+immunodeficiency+virus+on+recombinant+colony-stimulating+factor+1-treated+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes.</a> J Exp Med. 167 (4), 1428-1441 (1988).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+macrophage-based+nanoparticle+platform+for+antiretroviral+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery.</a> Blood. 108 (8), 2827-2835 (2006).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+investigations+for+the+morphologic%2C+pharmacokinetic%2C+and+anti-retroviral+properties+of+indinavir+nanoparticles+in+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages.</a> Virology. 358, 148-158 (2007).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+delivery+of+nanoformulated+antiretroviral+drug+to+the+brain+in+a+murine+model+of+neuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS.</a> J Immunol. 183 (1), 661-669 (2009).</li>
<li>Nowacek, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoformulated+Antiretroviral+Drug+Combinations+Extend+Drug+Release+and+Antiretroviral+Responses+in+HIV-1-Infected+Macrophages%3A+Implications+for+NeuroAIDS+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics.</a> J Neuroimmune Pharmacol. , (2010).</li>
<li>Nowacek, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoART+synthesis%2C+characterization%2C+uptake%2C+release+and+toxicology+for+human+monocyte-macrophage+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomed%22%5BJournal%5D)">NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery.</a> Nanomed. 4 (8), 903-917 (2009).</li>
<li>Kalter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+HIV+replication+in+macrophage+colony-stimulating+factor-treated+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes.</a> J Immunol. 146 (1), 298-306 (1991).</li>
</ol>

NanoART HIV-1 terapötikler geliştirmek için tasarlanmıştır. Biz klinik kullanım için bu teknolojiler geliştirmek için bir ilk adım olarak nanoformulated ilaç geliştirme için bir laboratuvar test sistemi olarak monosit-makrofaj bazlı bir ilaç dağıtım sistemi önerdi. Bizim geçmiş çalışmaları sistemi böyle bir uygulama 5,6 için geçerli olduğunu göstermiştir. Cari rapor, HIV-1 yaygın olarak kullanılan ilaçlar (ritonovir RTV; efavirenz, EFV ve atazanavir, ATV indinavir IDV) NP sentezleme yöntemleri gösterilmektedir. Bu ıslak öğütme, homojenizasyon ve ultrasonik sağlandı. Önemlisi, bizim yaklaşımımız nanoART fiziksel özellikleri, boyut, şekil ve şarj 5,6 gibi değişiklikler için izin verir . Yüzey dikkatli seçimi, bir nötr son derece olumlu, son derece olumsuz bir parçacığın şarj kontrol edebilirsiniz. Işlem süresi ve yoğunluğu değiştirerek, bir boyutu kontrolü ve ≥ 3 mm olarak ≤ 200 nm gibi küçük veya büyük parçacıklar hale. Parçacık şekli de diğer fiziksel özelliklerine göre daha az bir ölçüde kontrol altına alınabilir. Örneğin, küresel parçacıklar çok taraflı geometrik şekiller, ıslak öğütme ve homojenizasyon ile imal edilebilir polimerler ile sonication yoluyla yapılabilir. Islak öğütme ve homojenizasyon farklı şekilli parçacıklar üretmek, ancak bu sürecin fraksiyonasyon yöntemi bağımlı ve doğrudan kontrol edilemez. Bu özellikler üretim yöntemleri, araştırmalar tam tasarım özellikleri kolayca nanoART üretmek etkinleştirebilirsiniz. NanoART fizikokimyasal özellikleri, istikrar, gerek üzerinde güçlü bir etkisi var ve nasıl hücrelerle etkileşime beri Bu hayati önem taşımaktadır. Örneğin, biz nanoART, yaklaşık 1 mikron boyutunda olan güçlü bir pozitif yüke sahip bir multisided geometrik şekil makrofajlar tarafından bir kez hücrelerin içinde daha istikrarlı daha hızlı bir şekilde ele alınması ve daha uzun bir süre boyunca yayımlanan göstermiştir süresi 6. Test nanoART için bir yöntem, alınacak parçacıklar yeteneği basit bir tarama için izin veren gelişmiş muhafaza ve viral replikasyon inhibe etme kapasitesine ek olarak, makrofajlar, HIV-1 ilkesini hedef hücreleri tarafından yayımlanan oldu. Bu kolaylıkla performansa dayalı nanoART farklılaştırmak ve beşeri nanoART gelişmekte verimlilik ve hız hem de artan, bu nedenle, in vivo modelde başarılı en iyi şans olduğunu tespit için sağlar. NanoART ile ex vivo fare kemik iliği makrofajlar yüklenir ve adoptively humanize HIV-1 enfekte olmuş fareler, merkezi sinir sistemi de dahil olmak üzere, aktif enfeksiyon sitelerine seyahat ve serbest ilaçlar için 2 hafta içinde intravenöz enjeksiyon yoluyla transfer olduğu kanıtlanmıştır 2-4 viral replikasyon inhibe etmek. Buna ek olarak, bu nanoART yüklü hücreler de etkili plazma virüs bulaşmış hücrelerin sayısını azaltmak mümkün, hem de CD4 + hücreler 2 korumak gibi lenf düğümleri, dalak, karaciğer ve akciğer. Bu çalışmalar, ön rağmen, hücre-aracılı nanoART dağıtım sistemi, kan ve enfekte dokuların hem de klinik olarak anlamlı miktarda ilaç dağıtabilirsiniz göstermektedir. Çünkü HIV-1 enfekte fare çalışmalardan cesaret ön sonuçlar, şu anda, klinik kullanım için nanoART potansiyelini daha test etmek için bir maymun immün yetmezlik virüsünün enfekte makak modeli geliştiriyoruz.

Tabloda kullanılan kısaltmalar: IDV: İndinavir; RTV: ritonavir, ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS sodyum dodesil sülfat; P188: poloxamer 188 (aynı zamanda Pluronic F68 olarak adlandırılır), MPEG-2000-DSPE: metil-poli (etilen-glikol) 1,2-distearoyl fosfatidil-etanolamin; DOTAP: (1-oleoyl-2-[6 - [(7-nitro-21 ,3-benzoxadiazol-4-il) amino] hexanoyl] - 3-trimethylammonium propan); PLGA: poli (laktik-ko-glikolik asit); CTAB: cetyltrimethyl amonyum bromür; DMEM: Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartalı Orta; MCSF: Makrofaj Koloni-Uyarıcı Faktör; HPLC: Yüksek basınçlı sıvı kromatografi; HIV-1 : Human Immunodeficiency Virus-1

kan bazlı makrofaj taşıma nanoformulated antiretroviral ilaçlar geliştirme yöntemleri

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Antiretroviral (ART) ilaçlar için ilaç toksisiteleri azaltmak için de hizmet verirken Nanoformulated ilaçların farmakodinamik ve biyoyararlanımını artırabilir. Bu amaçla, bizim laboratuar ART rejimleri basitleştirmek için nanotıp, ilkeleri uygulanır ve uyum ve ilaç farmakokinetiği artırırken gibi toksisiteleri azaltmak. Üretim nanoformulated ART (nanoART) için basit ve güvenilir bir yöntem gösterilmiştir. Saf ilaç parçacıkları surfaktan lipid kaplama ince bir tabaka ile sarmalanır ve ıslak öğütme veya yüksek basınçlı homojenizasyon küçük olanları içine büyük ilaç kristalleri fraksiyonasyon tarafından üretilmektedir. Alternatif bir yöntem serbest ilacın bir polimer bir damlacık askıya alınır. Burada, ilaç bireysel nano boyuttaki damlacıkları oluşana kadar sonra ultrasonik çalkalanırken bir polimer içinde çözülür. Dinamik ışık saçılımı ve mikroskobik muayene parçacıklar (partikül boyutu, şarj ve şekli) fiziksel özelliklerini karakterize eder. Onların biyolojik özellikleri (hücre alımı ve tutma, sitotoksisite ve antiretroviral etkinliği) insan monosit kökenli makrofajlar (MDM) ile belirlenir. MDM, arıtma için santrifüj Yıkayarak tasviye kullanarak leukopacks izole edilmiş insan periferik kan monositler türetilmiştir. Bu tür kan kaynaklı makrofajlar nanoART dağıtım insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfekte organların hücresel taşıyıcılar olarak kullanılıyor olabilir. Biz bağ, klinik kullanıma antiretroviral ilaçları, HIV-1 tedaviler için nanopartiküller içine ambalajladığını uyumu geliştirmek ve hastalık sonuçları olumlu etkileyebilir.

Indinavir, ritonavir, efavirenz ve atazanavir Nanopartiküller ıslak öğütme, homojenizasyon ve ultrasonik kullanılarak imal edildi. Bu nanoformulations, toplu nanoformulated makrofaj tabanlı ilaç dağıtım değerlendirildi antiretroviral tedavi (nanoART) olarak adlandırılır. Monosit türevi makrofaj nanoART alımı, saklama ve sürekli salım belirlendi. Bu ön çalışmalar, klinik kullanım için nanoART potansiyel öneririz.

Kan Bazlı Makrofaj Taşıma Nanoformulated antiretroviral ilaçlar Geliştirme Yöntemleri

Nanoformüle edilmiş ilaçlar, antiretroviral (ART) ilaçlar için ilaç toksisitesini azaltmaya hizmet ederken aynı zamanda farmakodinamiği ve biyoyararlanımı da iyileştirebilir. ... için

Bu prosedürün amacı, nano art olarak adlandırdığımız kristal antiretroviral nanopartiküllerin üretilmesi; bunların hücresel alım, salgılanma ve antiretroviral özelliklerinin test edilmesidir. Bu işlem, öncelikle antiretroviral ilaçların sonikasyon homojenizasyonu veya yaş öğütme yoluyla işlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, primer monositlerin karşı akımlı santrifügal ayırma ile izole edilmesinin ardından nano art partiküllerinin fiziksel özelliklerinin karakterize edilmesidir.Hücreler, monosit kaynaklı makrofajlara farklılaşmalarını uyaran makrofaj koloni uyarıcı faktör (MCSF) içeren DMEM'de yedi gün boyunca kültüre edilir. Üçüncü adım, nano art'ın insan monosit kaynaklı makrofajlar tarafından alımını, tutulumunu ve salınımını test etmektir. Prosedürün son adımı, nano art'ın monosit kaynaklı makrofajlardaki in vitro antiretroviral etkinliğini test etmektir.Nihayetinde, nano sanatın hücreler tarafından kolaylaştırılmış alımı, hücrelerden yavaş salınımı ve güçlü antiretroviral etkinliği gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bunlar; ilaç seviyelerinin yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC ile ölçülmesiyle ve enfekte kültür süpernatant materyallerinin ters transkriptaz aktivitesi ölçümüyle test edilmesiyle belirlenir. Merhaba, ben Hanta Aldi; Nebraska Tıp Merkezi'nde Dr. Howard Gelman'ın laboratuvarında doktora sonrası araştırma görevlisiyim.Sunduğumuz yöntemler, hücre tabanlı ilaç iletim sistemlerinin translasyonel araştırma faaliyetlerini geliştirmek için nasıl kullanılabileceği dahil olmak üzere nanotıptaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu, uzatılmış yarı ömürlere sahip nano formüle edilmiş antiretroviral terapi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Çalışmalarımız, nano art'ın klinik kullanım potansiyelini desteklemektedir.Merhaba, benim adım Ari Noche; Carol Schwartz Emerging Neuroscience Laboratuvarı'nda çalışan bir MD PhD öğrencisiyim. Dr. Gendelman'ın rehberliğinde, burada size gösterdiğimiz tekniklerin etkileri antiretroviral terapiye kadar uzanmaktadır; çünkü nano formülasyonlu bileşikler, ilaçla ilişkili yan etkileri azaltırken aynı zamanda biyoyararlanımı ve farmakokinetiği eş zamanlı olarak iyileştirebilir. Klinik olarak mevcut olan antiretroviral ilaçları alıp onları nanoparçacıklar halinde yeniden paketleyerek, uyumluluğu artırabilir ve hastalık sonuçlarını da olumlu yönde etkileyebiliriz.Merhaba, ben Dr. Howard Gendelman. Klinik bilim insanıyım; aynı zamanda University of Nebraska Medical Center'da Farmakoloji ve Deneysel Nörobilim Bölümü'nde profesör ve bölüm başkanıyım. Genel amacımız, antiretroviral ilaçları basitleştirerek onlara erişimi kolaylaştırmak, biyodağılımlarını ve farmakokinetiklerini iyileştirmektir.Şimdi sizi, araştırma laboratuvarına götürerek bu nanopartiküllerin üretiminin ve geliştirilmesinin nasıl yapıldığını gösterecek olan Ari ve Sean'a bırakıyorum. Nebraska Tıp Merkezi'ndeki klinik fayda ve geliştirme çalışmaları kapsamında, ıslak öğütme yoluyla nano art üretimi gerçekleştirilecektir. İlk olarak, nano formülasyonların hazırlanmasında kullanılacak ilaç kristalleri ve çeşitli sürfaktanlar tartılır ve T 18 ultra Turx karıştırıcı kullanılarak tamamen dağılana kadar 10 millimolar heis tamponu pH 7.8 ile karıştırılır; sürekli öğütme için formülasyondaki ilaç yüzdesi %1 ile %2 arasında olmalıdır.Soğutucunun ve kompresörün açık olduğundan ve çıkış basıncının şu anda yaklaşık 100 PSI olduğundan emin olun; ardından öğütme ortamının tanka yüklenebileceği şekilde düzenleme yapın ve öğütme haznesine 50 mililitre boncuk ekleyin. Mekanik sızdırmazlık elemanında sızıntı oluşmasını önlemek için bir huni kullanarak dişlerde veya öğütme haznesinin dışındaki herhangi bir yerde boncuk kalmadığından emin olun. Şimdi, O-ringin öğütme haznesindeki yerinde olduğundan emin olun.Ardından uygun bir elek gözenek boyutu seçin ve somunları sıkarak kapakları sabitleyin. Elek gözenek boyutu, boncuk boyutunun en az yarısı kadar olmalıdır. Sürekli öğütme sırasında ürünün filtreyi tıkamasını önlemek için büyük bir elek gözenek boyutu kullanın.Öğütme haznesini indirdikten sonra, çeşitli miktarlarda sürfaktan içeren ilaç süspansiyonunu ürün girişine ekleyin. Süspansiyonun minimum hacmi 100 milliliters olmalıdır. Bu, öğütme haznesinin aşırı ısınmasını önleyecek ve parçaların daha az aşınması sayesinde boncuk kontaminasyonunun önüne geçecektir.Ardından, pompayı çalıştırın. Formülasyonunuz için kontrol ünitesini kullanarak akış hızını değiştirmek gereklidir. Daha sonra karıştırıcıyı açın ve kontrol ünitesi üzerinden hızı ayarlayın.Hız, dakikada 600 devirden dakikada 4.320 devire kadar artırılabilir. Bir micro sur üzerinde, aşırı ısınma olmadığından emin olmak için öğütme haznesinin üst kısmında bulunan sıcaklık göstergesini kullanarak sıcaklığı izleyin. Şimdi numuneyi çeşitli hızlarda ve akış hızlarında öğütün ve difraksiyon ışık saçılımı malvern zeta sizer kullanarak boyut ve yük ölçümleri yapmak için formülasyondan yaklaşık bir mililitrelik küçük alikotlar alın.İstenen boyut elde edildikten sonra, kontrol ünitesini kullanarak öğütmeyi durdurun ve pompa hâlâ çalışırken, ilacın tamamen süzülmesini sağlayarak örneği bir erlene toplayın. İşlem bittiğinde pompayı kapatmayı ve boncukları çıkarıp temizlemeyi unutmayın. Şimdi değirmen süspansiyonunu 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve santrifüjü 30 dakika boyunca dakikada 10.000 devir olacak şekilde ayarlayın.Santrifüj döngüsü tamamlandığında, üst faz miktarını ölçün ve aynı miktarda taze sürfaktan çözeltisi ile değiştirin. Resüspansiyon işlemi tamamlandığında, süspansiyonu öğütme haznesine aktarın ve 10 dakika boyunca öğütün. Yaklaşık bir mililitrelik bir alikot alın ve Zeta sizer kullanarak örneğin boyutunu ve yükünü tekrar ölçün.Son olarak, homojenizasyon yoluyla nano sanat üretmek için nano sanat formülasyonlarının konsantrasyonunu HBLC kullanarak ölçün. Avastin Emulex C five kullanarak, ilaç kristallerini ve çeşitli sürfaktanları daha önce açıklandığı gibi hazırlayın, ardından süspansiyonu homojenizasyon kabına aktarın ve resirkülasyonu başlatın. Numuneyi homojenize etmeye başlamadan önce soğutucunun açık olduğundan emin olun.Basıncı, gösterge 20, 000 artı veya eksi 2000 PSI değerini okuyana kadar kademeli olarak artırın ve hedef partikül boyutu elde edilene kadar homojenizasyona devam edin. Bu işlem genellikle 45 ile 60 dakika arasında sürer. Periyodik olarak yaklaşık bir mililitre Eloqua alın ve daha önce açıklanan homojenize süspansiyon yöntemiyle, bir zeta sizer santrifüj kullanarak örneğin boyutunu ve yükünü ölçün.Ardından Resus süspansiyonundan sonra, süspansiyonu C five homojenizatörüne aktarın. Sirkülasyonu yeniden başlatın ve homojenizasyon basıncını 20.000 ± 2000 PSI değerine geri getirip 30 dakika boyunca homojenize edin; ardından soğuk Palmer ultrasonik işlemciyi kullanarak sonikasyon yoluyla üretim yapın. Klorometan PLGA ve ilaç çözeltisini %1'lik PVA sürfaktan çözeltisinin içine dökün ve ultrasonik cihaz içindeki buz banyosuna yerleştirin.Sonikasyonu %50 amplitude ile başlatın; ancak daha küçük numune grupları için amplitude yaklaşık %30'a düşürülebilir, numuneyi 10 dakika boyunca sonikate edin. Partikül boyutu analizi için küçük bir alikot alın. Partiküllerin boyutu 1.5 mikronun üzerindeyse, numuneleri toplamda maksimum 16 dakikaya kadar ikişer dakikalık aralıklarla sonikate edin.Numuneleri mikroskop altında 20 kat büyütmede gözlemleyin ve gözlemleri belgeleyin. Süspansiyon için yeterli bir vorteks oluşturmak amacıyla bir manyetik karıştırıcı kullanın ve oda sıcaklığında gece boyunca karıştırmaya devam edin. 24 saat sonra süspansiyonu toplayın ve 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın.Numuneleri 5 °C'de, dakikada 8.000 devir hızında 20 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı uzaklaştırın ve numunenin yarısını 75 mililitre filtrelenmiş ters ozmoz suyunda, diğer yarısını ise 75 mililitre %0,5 CTAB trimetil amonyum bromür sürfaktanında yeniden süspande edin. Numuneleri tekrar 5 °C'de, dakikada 8.000 devir hızında 20 dakika boyunca santrifüj edin ve her bir peleti toplam 20 mililitre mannitol çözeltisi ile yeniden süspande edin. Son olarak, homojenizasyon veya sonikasyon yoluyla üretilen partiküller için, partikül boyutunu zeta sizer kullanarak ölçün ve numunelerin konsantrasyonunu HPLC kullanarak belirleyin.Mikroskopi ile görüntülemeye hazırlık için, hazırlanan nano sanat süspansiyonlarını alın ve 10 saniye boyunca sonikasyona tabi tutun. Bir sonikasyon probu ile %20 amplitudda, bir mikroskop lam örtü camı alın ve bunu ters mikroskoba yerleştirin. Örtü camının üzerine.15 µL nano art süspansiyonunu 100 µL fosfat tamponlu salin ile karıştırın ve pipetle birkaç kez aşağı yukarı çekerek harmanlayın. Ardından, morfolojiyi gözlemlemek için nanopartikülleri 20x objektif kullanarak görselleştirin. Numuneler taramalı elektron mikroskobu ile görselleştirme için de hazırlanabilir.Burada, kan kaynaklı monositlerin santrifüjle izole edilmesinin ardından, 1 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonda aşağıdaki katkı maddeleriyle desteklenmiş DMEM'e saflaştırılmış monositlerin eklendiği A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F düşük voltajlı alan emisyonlu taramalı elektron mikroskobuyla elde edilen görüntüleri görüyoruz. Ardından, monositlerin makrofajlara farklılaşmasını sağlamak, hücre alımını ve toplanmasını analiz etmek amacıyla, %5 karbondioksit ile desteklenmiş nemli bir atmosferde, altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 2 × 10⁶ hücre ekleyerek yedi gün boyunca kültüre edin. Nano art'ı, kültür ortamı ile 100 µM final konsantrasyona gelecek şekilde karıştırın ve istenen zaman noktasında veya hücreler nano art ile tamamen yüklendiğinde her bir kuyucuğa 1 mL işlem ortamı ekleyin.Hücreler tarafından alınmamış tüm partikülleri uzaklaştırmak için tüm tedavi ortamını uzaklaştırın ve hücreleri üç kez 1 ml PBS ile yıkayın. Yapışık hücreleri kuyucuğun altından bir hücre kaldırıcı (cell lifter) kullanarak alın ve 1,7 ml'lik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Ardından hücreleri 4 °C'de, 1000 RCF'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri liz etmek için 200 µL %100 Metanol ekleyin; ardından nano art'ı çözmek için peleti bir sonik prob ile %20 amplitütta iki ila beş saniye boyunca kısaca sonikasyona tabi tutun. Örnekleri, ilaç içeriği analizine hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. Nano art'ın hücre içi tutulumu, burada görüldüğü gibi mikrotom ile kesitler hazırlandıktan sonra transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak da görselleştirilebilir.Hücre alımı ve toplama analizleri için daha önce açıklandığı gibi, nano arch salınım işlemine tabi tutulan hücrelerin analizine ilişkin detaylar için bu makalenin beraberindeki metne bakınız. Ancak, hücreleri yıkadıktan sonra toplamak yerine, belirtilen günlerde veya besiyerinin sarıya dönmesiyle belirtildiği üzere PBS'yi, MCSF ve nano art içermeyen iki mililitre hücre kültürü besiyeri ile değiştirin; istenen günde besiyerinin yarısını yenileyin. Tekrarlayan hücrelerle birlikte bir mililitre hücre besiyerini toplayın ve ilaç analizi için işleme alın.Nano art bifokal mikroskopisi ile gerçek zamanlı alımı görselleştirmek için, öncelikle vibrant gibi bir DRE alın ve bunu besiyerine ekleyin. Üretici talimatlarını takip ederek, boya içeren besiyerini olgun monosit türevli makrofajlara ekleyin ve ardından fazla boyayı uzaklaştırmak için hücreleri bir mililitre kültür besiyeri kullanarak üç kez durulayın. Şimdi, floresanla işaretlenmiş nano art kullanılarak nano art'ı kültür besiyeri ile karıştırın ve işaretli nano art içeren tedavi besiyerini ekleyin. Konfokal mikroskop ile görüntüleme yapmadan hemen önce, 60x objektif kullanarak dört saat boyunca her 30 saniyede bir görüntü yakalayın.Son olarak, HIV-1 enfeksiyonu ve enfektivite analizleri gerçekleştirilebilir. Öncelikle hücrelere, art salınımının görüntülenmesi için açıklanan şekilde işlem uygulayın. Ardından istenen günlerde, tüm besiyerini uzaklaştırın ve yerine hücre başına 0,01 viral partikül enfeksiyon multiplicities (MOI) değerinde HIV-1 AA içeren MCSF'siz besiyeri ekleyerek 24 saat boyunca inkübe edin.Ardından viral medyumu uzaklaştırın ve taze virüsle değiştirin, hücreleri virüssüz medya kültüründe 10 gün boyunca büyütün; hücreleri enfeksiyondan sonraki 10 gün boyunca hayatta tutmak için gün aşırı veya gerektiğinde medyumun yarısını değiştirin. 96 kuyucuklu plakaya yerleştirilen her kuyucuktan 10 µL medyum toplayın ve ters transkriptaz analizi yapılana kadar -80 °C'de saklayın. Müteakiben HIV-1 p24 tespitleri de gerçekleştirilebilir.Burada, nano sanat uygulamasından bir gün sonra 0,01 multiplikasyon enfeksiyonu ile virüse maruz bırakılan hücrelerin morfolojisini kolayca görebiliriz. Bu monosit türevli makrofajlarda viral enfeksiyona dair herhangi bir kanıt yoktur ve nanopartiküller hücre sitoplazması içinde rahatlıkla görülmektedir. Burada hücreler, nano sanat uygulamasından 10 gün sonra virüse maruz bırakılmıştır.Bu hücrelerin bazılarında P 24 boyaması ve çok çekirdekli dev hücre oluşumu ile belirtildiği üzere enfeksiyon görülmüştür, ancak tedavi edilmemiş hücrelerle karşılaştırıldığında hala belirgin bir koruma söz konusudur. B'deki hücrelerin sitoplazması içinde nanoparçacıkların hala görünür olduğu, ancak a'da görüldüğü kadar yoğun olmadığına dikkat edin; bu yapılar nano art ile tedavi edilmeyen hücrelerde mevcut değildir. Bu canlı hücre konfokal videolarında, yeşil ile işaretlenmiş makrofajlar ve kırmızı ile işaretlenmiş nano art görülmektedir.Burada hücrelerin çok az sayıda nanoparçacık biriktirdiğini görebiliriz. Burada ise, artan kırmızı floresans ile belirtildiği üzere, parçacıklar hızla birikmektedir. Bu farklılıklar, HPLC kullanarak ilaç alımı analiz edildiğinde görülen bulgularla paralellik göstermektedir; ayrıca, hücrelerin parçacıkları aktif olarak aldığını görebiliyoruz.Hücresel nano sanat birikim hızları arasındaki fark; boyut, şekil ve yük gibi fiziksel özelliklerin, makrofajların nano sanatı alma ve tutma yetenekleri üzerindeki etkilerini yansıtmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, ıslak öğütme homojenizasyonu ve sonikasyon tekniklerini kullanarak nano sanatın nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bunlar, antiretroviral nanoparçacıklar üretmek için etkili yöntemlerdir.Islak öğütme ve homojenizasyon, daha büyük ilaç kristal partiküllerini lipid sürfaktanlar içinde daha küçük nanopartiküllere ayırmaya yararken, sonikasyon tekniği bir polimer içinde nano boyutlu bireysel ilaç damlacıkları üretir. Burada ayrıca, nano sanat taşınımını değerlendirmek için bir test platformu olarak insan monosit türevli makrofajların nasıl kullanılacağını da gösterdik. Test yöntemimiz, bir partikülün hücreler tarafından alınma, tutulma ve salınma yeteneğinin yanı sıra viral replikasyonu inhibe etme kapasitesinin çok basit bir şekilde taranmasına olanak tanır.Bu durum, araştırmacının in vivo ortamda ve nihayetinde enfekte insanlarda kullanımda başarı şansı en yüksek olan nano sanatı tanımlamasına olanak tanır. Bu deneylerin tam sonuçları Online Nano makalemizde yayınlanmıştır. Makale, Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010'da "Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics" başlığıyla yer almaktadır.Çok teşekkür ederim.

methods-development-for-blood-borne-macrophage-carriage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Nanoparçacıkların hücre biodistribution değerlendirmek için kullanılan bio-görüntüleme yöntemleri, nanoformulated bileşikler tedavi ve teşhis izleme için geçerlidir. Burada açıklanan yöntemler, histolojik coregistration tarafından değerlendirilir, hassas ve özeldir. Metodolojileri kemirgen insan uygulamaları bir translasyonel yol sağlar.

Teşhis ve Tedavi İzleme Nanomalzemelerin Kayıtlı bio

Nanomole afinite ile HIV 1BA-L gp120 karşı çeşitli 2'-Fluoro RNA aptamers bir RNA kütüphanesi ile izole edilmiştir.

Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme

Bu video, insan immün yetmezlik virüsü-1 (HIV-1) ile enfekte insanlaştırılmış fare modelinde oral kombine antiretroviral tedavinin (oral cART) etkinliğini değerlendirmek için bir testi göstermektedir. Nükleozid ters transkriptaz inhibitörleri ve integraz iplikçik transfer inhibitörleri dahil olmak üzere HIV-1'i hedef alan ilaçların bir kombinasyonu, bir besin takviyesi ve antibiyotiklerle birlikte uygulanır. Bu karışımın HIV-1 ile enfekte olmuş insanlaştırılmış fareler tarafından tüketilmesinin...

İnsanlaştırılmış Bir Fare Modelinde HIV-1 Enfeksiyonunu Tedavi Etmek için Oral Kombinasyonel Antiretroviral Tedavi

Bu protokol, HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre tabanlı tasarlanmış bağışıklığa sahip insanlaştırılmış bir kemik iliği/karaciğer/timus fare modeli oluşturma yöntemlerini açıklar.

Insanlaşmış Fare Modelinde HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre Tabanlı Engineered Bağışıklık

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) tip 1 ile veya bu virüs olmadan enfekte olmuş canlı hücrelerde hücre merkezine doğru hareket eden fagozomların hızını, floresan enfekte hücreleri tanımlamak için eğirme disk konfokal floresan mikroskobu ve fagozomları tespit etmek için parlak alan mikroskobu kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

HIV-1 ile infekte Canlı İlköğretim İnsan Makrofagların Ölçülen fagosom Göç ve Hız

Biz Bronkoalveoler Lavaj sıvısı işleme için bir yöntem tarif ve pulmoner HıV rezervuarları değerlendirmek için antiretroviral tedavi kronik HıV enfekte bireylerin periferik kan eşleşen. Bu yöntemler, son derece saf CD4 T hücrelerinin satın alınması ve daha sonra ultrason polimeraz zincir reaksiyonu ile immünofenotipleme ve HIV DNA/RNA ölçülerinde kullanılabilir alveoler makrofajlar sonuçlanır.

Alveoler Makrophaj ve CD4+ T-Cell Immünophenotyping ve HIV rezervuar değerlendirmesi Için Bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi

Burada sunulan izole etmek için optimize edilmiş bir protokoldür, culturing, transfecting, ve HIV enfekte bireyler ve sağlıklı kontroller insan birincil monositayırt.

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

Biz nesil ve insanlaşmış ve insan immün yetmezlik virüs enfekte NOG fare modeli kök hücre nakli, intravajinal insan immün yetmezlik virüsü maruz kalma ve damlacık dijital PCR RNA dayalı değerlendirilmesi için bir protokol geliştirdik Miktar.

Intravajinal HIV Maruziyeti ve HIV Enfeksiyonu Tedavisi için İnsanize NOG Fareler

Bu protokol, insanlaştırılmış farelerde HIV-1 RNA replikasyonunu başarılı bir şekilde baskılayan oral kombinasyonel antiretroviral ilaçlar vermek için yeni bir yöntemi açıklamaktadır.

HIV-1 Enfekte İnsanlaştırılmış Farelerde Oral Kombinasyonel Antiretroviral Tedavi

Periton dokusunda yerleşik makrofajlarda gen fonksiyonunun araştırılması için in vivo, lentiviral vektörler kullanılarak adım adım bir protokol gösteriyoruz.

Farelerde İn Vivo Periton Boşluğu Dokusunda Yerleşik Makrofajların Verimli Gen ve MikroRNA Modülasyonu için Lentiviral Vektör Hazırlığı

Bu çalışma, Numaralandırılmış Etravirin'i HIV için umut verici bir terapötik ajan olarak tanımlamak için in silico stratejiler kullanmıştır. Moleküler etkileşimler ve dinamikler hakkındaki bulgularımız, olası HIV tedavi alternatifleri olarak yeni NNRTI'lerin rasyonel tasarımını desteklemektedir.

Nükleotid Olmayan Ters Transkriptaz İnhibitörlerinin Kantitatif Yapı-Aktivite İlişkisi, Aktivite Tahmini ve Moleküler Dinamiği

Öğrenin nanoART üretimini ve makrofajlarda hücresel alım, salım ve antiretroviral etkinlik testlerini. Islak öğütme, homojenizasyon ve ultrasonikasyon teknikleriyle HIV tedavisinde geliştirilmiş ilaç taşıma sistemleri geliştirin.

Kan Bazlı Makrofaj Taşıma Nanoformulated antiretroviral ilaçlar Geliştirme Yöntemleri

Daha fazla video keşfet