Yüksek Verimli Ekran Metagenomic Kütüphaneler selülaz Aktivitesi Biomining

Bu prosedürün genel amacı, bir metagenomik kütüphaneden selülaz eksprese eden klonları tanımlamaktır. Bu, ilk olarak, çoğaltılan kütüphanenin 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilmesinin ardından bir robot kullanılarak daha önce yapılmış bir metagenomik kütüphanenin çoğaltılmasıyla gerçekleştirilir. E coli klonlarının büyümesi ölçülür, lizis, tampon ve substrat daha sonra çoğaltılan kütüphaneye eklenir.

Sonuç olarak, bir plaka okuyucu kullanılarak kolometrik absorbans ölçümleri yoluyla selülaz aktivitesini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Steven Hallam'ın laboratuvarından Keith. Bugün size metagenomik kütüphanelerin yüksek verimli fonksiyonel taraması için bir prosedür göstereceğiz.

Laboratuvarımızda bu prosedürü metagenomik kütüphanelerden biyomin selülaz aktivitesini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu protokole başlamadan önce, 384 kuyulu plaka formatında saklanan bir metagenomik kütüphane hazırlayın.

Bu çalışmada, kütüphane konakçısı olarak Farge T bir dirençli TRANSFECT max EPI 300 T bir dirençli e coli hücresi ile kombinasyon halinde PCC bir kopya kontrol SMID vektörü kullanıldı, bu prosedürü başlatmak için kütüphaneyi içeren plakaları eksi 80 santigrat dereceden çıkarın ve 37 santigrat derecede yaklaşık 20 dakika boyunca çözdürün. Bu arada, robotu 15 dakika sterilize etmek için QIX two'daki UV ışığı sterilizasyon özelliğini kullanın. Steril boru programı aracılığıyla manifolda bağlı medya şişesi ile Q doldurma üçünü üreticinin talimatlarına göre ayarlayın.

Q, uygun miktarda ortam için üçünü doldurur ve 45 mikrolitrelik bir hacmi dolduracak şekilde ayarlar. Her birinde, ortam görünene kadar robotun temizleme özelliğini kullanarak borudan ve manifolddan havayı iyice boşaltın. Manifoldun her bir piminde, Q doldurma üçünü kullanarak istenen sayıda plakayı LB ortamıyla doldurun.

Her plakanın dolması yaklaşık 20 saniye sürer. Ardından, kitaplık plakalarını ve yeni plakaları Q penalarının uygun alanlarına yükleyin. Robota temizlemek için banyoları uygun reaktiflerle doldurun.

Arka banyoda %2 mikro 90, orta banyoda otoklav damıtılmış su ve ön banyoda %80 etanol. Qix two'nun çoğaltma programını kullanarak, uygun kafanın yanı sıra hem kaynak hem de hedef plakaların sayısını ve türlerini seçin. Ayrıca, çoğaltmalar arasında temizlemek için başlığı ayarlayın.

Genellikle her banyoda altı döngü yeterlidir. Makinenin kapasitesi bir seferde 10 plakadır. Makineyi çalışacak şekilde ayarlayın.

Çoğaltmak yaklaşık 15 dakika sürecektir. 384 pinli kafa ile tam kapasite. Plakalar çoğaltıldıktan sonra, plakaları bir nem kutusunda 24 saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün.

Uzun inkübasyon süresi gereklidir, çünkü arabinoz ilavesiyle yüksek sayıda smid indüklenmektedir. Bu arada, Q doldurma üç robotunu yazılı protokolde açıklandığı gibi temizleyin. İnkübasyonun ardından, plakaları 37 santigrat derece inkübatörden çıkarın.

Kapakları bir kenara koyun ve plakaları hızlı istifleme ile sağlanan magazin yükleme platformuna yerleştirin. Yazılım yapmadığı için plakaların sırasını takip ettiğinizden emin olun. Yığının altındaki plakalar okunacaktır.

İlk olarak, hızlı yığından bir dergi çıkarın. Boş olduğundan emin olun ve okunacak plaka yığınının üzerine itin. Şarjörü tutamağından tutun ve plaka şarjöre yüklenmelidir.

Magazini doğru yönde hızlı yığına yükleyin. Bağlı bilgisayarda taramayı yeniden programını açın. Yeni oturumu seçin ve uygun şekilde adlandırın.

Plaka olarak düz tabanlı 384 Kuyulu plakayı aramayı seçin. Plaka yerleşim alanına yazın. Sihirbaz düğmesini seçin ve plakaya 384 bilinmeyen eklemek için seçin.

Protokol alanında, kuyu döngüsü seçeneğini seçin ve 384 kuyu için girin. Ekranın sol tarafındaki akış ağacında bir kuyu döngüsü simgesi görünecektir. Simgeyi seçin ve fotometrik ölçüm eklemek için tıklayın.

600 nanometrede okuyacak şekilde ayarlayın. Protokolü benzersiz bir adla kaydedin ve yeniden programını tarayın. Ardından polara RS programını açın.

Ana sayfada VARI tarama başlığı altında hızlı yığın cihazına bağlı cihazları listeleyen bir tablo bulunmaktadır, oturumu çalıştır seçeneğine tıklayın. Tahlil penceresi daha sonra ortada bir akış şeması ile görünmelidir. Oturumu çalıştır öğesini seçin, ardından kaydedilen taramanın adını bulun.

Ekranın sağ tarafında görünen açılır menüde yeniden çalıştırılır. Protokol seçildikten sonra çalıştır'a tıklayın. Bu tahlil, kaynak olarak hangi derginin kullanılacağını ve hangi derginin boş olduğunu soran bir kutu açılacaktır.

Ekrandaki alt kutu, ön dergi zine'ye karşılık gelir. Hem hızlı yığının hem de Vario taramasının açık olduğundan emin olun ve başlat'a tıklayın. Hızlı istifleme, plakaları otomatik olarak plaka okuyucuya yükleyerek plakaların sürekli ölçümlerine olanak tanır.

Okunacak makinelerin doğru şekilde hizalandığından emin olmak için Vario taramasına yüklenen ilk plakayı gözlemleyin. 25 tabak yaklaşık 50 dakika sürer. Barrios taraması bittiğinde, dolu şarjörü çıkarın ve şarjör yükleme platformuna yerleştirin.

Platformun dış dikdörtgenini yukarı kaldırın ve magazin kaymalı ve plakaları ortada bir yığın halinde bırakmalıdır. Son olarak, çözelti bazlı bir ekran için plakalardaki kapakları değiştirin. Selüloz aktivitesi için önce tahlil karışımını önceden hazırlanmış 10 kez lizis stoğu kullanarak hazırlayın.

Yazılı protokolde tarif edildiği gibi pH 5.5'te 50 milimolar potasyum asetat tamponunda karıştırın. Daha sonra, DMSO'da mililitre başına 75 miligrama kadar, kromojenik DIPHENYL veya DNP hücre biyosit substratı stoğu hazırlayın ve substratın tamamen çözündüğünden emin olun. Test karışımına DNP hücre biyosit stok çözeltisini mililitre başına 0.1 miligramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin.

Her plakanın yaklaşık 20 mililitre çözelti kullandığını ve ölü hacme izin vermek için ek bir 50 mililitre gerektiğini unutmayın. Tahlil karışımında daha önce olduğu gibi Q dolgusunu üç kez ayarlayın, Q dolgusunu üç kullanarak her bir plakaya karıştırın. Her plakanın dolması yaklaşık 20 saniye sürer.

Tahlil karışımı eklendikten sonra, plakaları 37 santigrat derecede 12 ila 16 saat inkübe edin. Bir nem kutusunda, plakaları 37 santigrat derece inkübatörden çıkarın. Kapakları bir kenara koyun ve plakaları, daha önce olduğu gibi hızlı istifleme ile sağlanan magazin yükleme platformuna yerleştirin.

Yeniden tarama programını açın ve 400 nanometrede okumak üzere ayarlanması gereken fotometrik ölçüm dışında daha önce yapıldığı gibi ayarlayın. Ardından parametreleri POLARA RS programına girin. Daha önce gösterildiği gibi.

Vario taramasının plakaları okumasına izin verin. Çalıştırmanın ardından plakaları çıkarın ve atın. Absorbans okumalarını dışa aktarmak için açın, yeniden tarayın yazılım ve seçin.

Varolan bir dosyayı açın. Oturumun kaydedildiği dizini seçin ve listeyi genişletmek için artı simgesine basın. Başlık başlığının altında, bir konteynerden N konteynerine etiketlenmiş seçenekler olacaktır.Plaka sayısına bağlı olarak, sayfanın üst kısmındaki menü çubuğunda analiz edilecek ilk plakayı seçin, veri raporu dışa aktarmayı seçin.

Plaka düzeni ve fotometrik veriler gibi dışa aktarma seçeneklerini seçin. Raporu görüntüle'yi ve ardından dosya kaydet'i tıklayın. İstediğiniz dizini seçin.

Çıktı biçimi bir Microsoft Excel elektronik tablosudur. Burada, tek bir 384'ten absorbans okumaları. Gösterildiği gibi pozitif bir klon içeren kuyu plakası, pozitif klonlar, selülaz aktivitesini ifade etmeyen klonlara kıyasla absorbansta belirgin bir artış gösterir.

Tahlil süresi, kuyu, plaka üzerindeki konum veya DNP konsantrasyonundaki farklılıklar mutlak absorbans okumalarını etkileyebilir. Plaka ortalamasının veya kolon ortalamasının üzerindeki absorbans farkı gibi nispi absorbans okumaları, selülaz pozitif klonları tanımlamak için daha sağlam bir yöntemdir. Size metagenomik bir kütüphaneden selülaz pozitif klonları nasıl tanımlayacağınızı gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, DNP hücre biyo tarafınızı DMSO'da çözmeyi ve plakalarınızı bir nem odasında inkübe etmeyi unutmamak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.