Endojen Wild-tip BRCA1 Express hücreler kullanarak Homolog Rekombinasyon BRCA1 Mutasyonlar Etkileri belirlenmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vitro bir homolog rekombinasyon testi kullanarak BRCA1 proteinindeki spesifik varyantları test etmektir. Bu işlem, hem BRCA1'e özgü kısa müdahale eden RNA'nın (siRNA) hem de test edilen BRCA1 varyant proteinlerini hücrelerde yeniden eksprese etmek için kullanılan plazmidin transfeksiyona tabi tutulmasıyla, endojen vahşi tip BRCA1 proteininin test edilen varyantla yer değiştirilmesi yoluyla gerçekleştirilir; ikinci bir adım olarak, mutant BRCA1 ekspresyonu için kullanılan plazmid ve kısa müdahale eden RNA'ya ek olarak, test hücresinin DNA genomunda spesifik bir bölgede DNA hasarına neden olan ICN1 proteinini eksprese eden bir plazmid uygulanır. Ardından, DNA hasarının ve onarımın gerçekleşmesine izin vermek için hücreler iki ila üç gün boyunca inkübe edilir; GFP eksprese eden hücrelerin akış sitometrisi analizi temelinde, BRCA1 proteininin spesifik protein varyantlarının homolog rekombinasyon yoluyla DNA onarımında işlev görüp görmediğini gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu teknik, homolog rekombinasyon yoluyla DNA hasarının onarımındaki spesifik protein varyantlarını analiz etmek için çok yönlü bir sistem oluşturmak amacıyla yerleşik iki yöntemi birleştirir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, daha önce geliştirilen yöntemlerin BRCA1 genetik nakavtuna sahip hücre hatlarına dayanmasıdır. Biz, endojen proteinin RNA interferansı ile BRCA1 azaltılmasını ve test proteininin bu hücrelere geri eklenmesini sağlayan, HELOC hücrelerinden türetilmiş daha yönetilebilir bir hücre hattı kullanıyoruz.

Şimdi, homolog rekombinasyonu test edebilmek için bir varyant BRC1 proteini eksprese ediyoruz. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, prosedür sırasındaki aşırı hücre ölümü nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Sitotoksisiteyi sınırlarken rekombinasyon reaksiyonunun etkisini maksimize eden bir transfeksiyon koşulunun dikkatle ayarlanması önemlidir.

Bu protokole başlanmadan önce, HeLa hücrelerinin P-D-R-G-F-P ile transfekte edilmesiyle HeLa DR 13 hücre hattı oluşturulmuştur. Hücre hattını, stabil olarak transfekte edilmiş hücrelerin seçimi için purmycin içeren 10 santimetrelik Petri kaplarında sürdürün. P-D-R-G-F-P plazmidindeki ve stabil transformantlardaki rekombinasyon substratı, GFP'nin iki inaktif alelini içerir. Alellerden biri, I-SceI için 18 baz çiftlik restriksiyon enzimi tanıma bölgesinin bulunması nedeniyle inaktiftir.

Kodlama dizisinde, bu hücrelerde ISCE one ekspresyonu, inaktif GFP'nin ikinci aleli üzerinde çift zincirli bir DNA kırığı veya DSB oluşturur. Dizisinin ilk aleldeki I SCE E one bölgesiyle ilişkili olan kısmı vahşi tiptir. Bu ikinci GFP aleli, DSB'nin homolog rekombinasyon onarımı için bir dizi donörü olarak işlev görebilir ve ilk transfeksiyondan bir gün önce akış sitometrisi ile kolayca tespit edilebilen aktif bir GFP aleli ile sonuçlanır.

En az %90 konfluens düzeyine ulaşmış 10 santimetrelik bir HeLa DR 13 hücre kabı temin edin. Hücreleri bir mililitre tripsin ile iki ila üç dakika boyunca inkübe edin. Reaksiyonu dokuz mililitre DMEM-FBS ekleyerek durdurun ve hücre süspansiyonunu pipetleme yoluyla iyice karıştırın. 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna, 0.5 mililitre DMEM-FBS içerisinde 40 mikrolitre tripsinizize hücre ekleyin. Hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit altında gece boyunca inkübe edin.

Birinci günde, hücrelerin konfluens oranı %40 ile %50 arasında olmalıdır. Endojen b RCA one'i tüketmek için kullanılan irna ile B RCA one mutant ekspresyon plazmidini optimum medyada karıştırarak transfeksiyona başlayın. Ardından, nükleik asitleri optimum medyadaki lip ile birleştirin.

Transfeksiyon sonrası, lipektomi transfeksiyonuna üretici talimatlarına uygun olarak devam edin. Hücreleri inkübasyona geri döndürün. Dört ila altı saat sonra medyayı, antibiyotik içermeyen bir medya ile değiştirin.

Hücreleri ikinci günde gece boyunca inkübe etmek üzere geri yerleştirin. Her kuyucuğa 0,3 mililitre trip le tripsin reaktifi ekleyerek hücreleri tripsinizleyin; 37 °C'de kısa bir inkübasyonun ardından, hücreleri tripsin reaktifi içinde pipetle yukarı ve aşağı çekerek gevşetin. Tripsinizleme tamamlandığında, tripsin aktivitesini durdurmak için hücreleri 24 kuyucuklu plakadan, 2 mililitre D-M-E-M-F-B-S içeren altı kuyucuklu bir plakaya aktarın.

Altı kuyucuklu plakayı, ilk transfeksiyondan iki gün öncekiyle aynı koşullar altında gece boyunca inkübe edin. SIR A'yı, BRCA1 mutant eksprese eden plazmid DNA'yı ve ISCE1 eksprese eden plazmidi 62,5 µL Optum içinde hazırlayın. Bu çözeltiyi 2,5 µL LIPECTOMY 2060 ve 2,5 µL Optum ile karıştırın.

Dört ila altı saatlik inkübasyonun ardından hücrelerin transfeksiyonuna geçin. Besiyerini antibiyotik içermeyen D-M-E-M-F-P-S ile değiştirin. Altıncı günde hücreleri inkübatöre geri yerleştirin.

Her bir kuyuktaki hücrelere 0,5 mL tripsin reaktifi ekleyerek tripsinleme yapın. İki mL DMEM-FBS ekleyerek reaksiyonu durdurun; hücreleri oda sıcaklığında 1000 RPM'de beş dakika santrifüj ederek toplayın. Hücreleri bir mL taze DMEM-FBS içinde yeniden süspande edin; GFP ekspresyonu için kuyuk başına 10.000 hücreyi analiz edin.

Akış sitometrisi ile, ileriye saçılım ve boyut saçılım parametreleri kullanılarak tekli canlı hücreler kapılamaktadır. GFP pozitif hücreler GFP floresan dedektörü kullanılarak yönlendirilir ve sonuçlar bir histogram olarak sunulur. Geriye kalan hücreler, floresanla görüntüleme yapılmak üzere yeniden ekilebilir.

Arzulanan BRCA1 mikroskopisi, homolog rekombinasyon yoluyla çift zincirli DNA kırıklarının onarım yolağını düzenler. Homolog rekombinasyon ile onarıma uğramış hücreler, floresan mikroskobu ile kolayca tespit edilir. RNAi ile BRCA1'in azaltılması, tespit edilen GFP pozitif hücrelerin sayısında keskin bir düşüşe neden olur.

FCA'dan elde edilen çıktı, x ekseninde hücre başına GFP yoğunluğu ve Y ekseninde hücre sayısının yer aldığı bir histogramdır. Transfekte edilmemiş I SCE'de, ekspresyon plazmidi bulunmadığından, GFP pozitif hücre tespit edilmemiştir.

İkinci ile altıncı sütunlar arasındaki sonuçların tamamı, üçüncü günde ISC one eksprese eden plazmidin transfekte edildiği hücrelerden alınmıştır. Tek bir deneyden elde edilen tipik bir sonuç setinde, ISC one ekspresyonu ve ilgisiz bir gen için kontrol RNAi depleksyonu sonrası hücrelerin %15,5'i GFP pozitiftir; buna karşılık BRCA one depleksyonu ve boş bir plazmid vektörünün geri eklenmesi GFP dönüşümünü %0,7'ye düşürmüştür. Ekzojen yabani tip BRCA one eklenmesi, %15 ila %16 GFP pozitif hücre elde edilmesiyle tespit edildiği üzere, homolog rekombinasyonu tamamen geri kazandırmıştır.

Benzer şekilde, bilinmeyen öneme sahip başka bir varyantın ekspresyonu. BRCA1 21B mutasyonu, BRCA1 bağımlı homolog rekombinasyon fonksiyonunu tamamen geri kazandırmıştır. BRCA1 M18T mutantının geri eklenmesi, vektör kontrolü ile benzer bir etki göstermiştir.

Bu varyantın endojen proteinle benzer seviyelerde eksprese olması, BRCA1 M18T varyantının homolog rekombinasyonda işlevsiz olduğunu göstermektedir. Bu prosedür uygulanırken, hücrelerin büyümesinin izlenmesi, hücrelerin yavaş ve düşük konfluensle büyüdüğünün unutulmaması ve kullanılan transfeksiyon karışımı miktarının azaltılması önemlidir. Ayrıca, transfeksiyon ortamının zamanında uzaklaştırılması da önem arz etmektedir.

Transfeksiyonu takip eden günlerde, besiyerine antibiyotik eklendiğinde yüksek miktarda sitotoksisite olduğunu saptadık. Bu nedenle, birinci günden sonraki tüm besiyerleri geliştirme aşamasından sonra antibiyotik içermemektedir. Bu teknik, meme kanseri araştırmaları alanındaki araştırmacıların, kanser kliniklerinde klinik önemi bilinmeyen BRC 1 varyantlarının genetiğini incelemelerinin önünü açmıştır.

Bu çalışmada geliştirilen fonksiyonel BRC one analizinin, BRC one varyantlarının kanser yatkınlığı üzerindeki etkilerinin daha iyi öngörülmesine olanak sağlamasını umuyoruz.