Endojen Wild-tip BRCA1 Express hücreler kullanarak Homolog Rekombinasyon BRCA1 Mutasyonlar Etkileri belirlenmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir in vitro homolog rekombinasyon testi kullanarak BRCA bir proteinindeki spesifik varyantları test etmektir. Bu, endojen vahşi tip BRCA bir proteinin, BRCA bir varyant proteinini hücrelere yeniden eksprese etmek için BRCA bir varyant proteinine özgü hem kısa enterferans yapan RNA'nın hem de BRCA bir varyant proteininin hücrelere yeniden eksprese edilmesi için plazmidin transfeksiyonu yoluyla test edilen varyant ile değiştirilmesiyle elde edilir, kısa enterferans yapan RNA ve mutant BRCA birini eksprese etmek için plazmit, ISCE bir proteini eksprese etmek için bir plazmide ek olarak RET rezeke edilir, test hücresinin DNA genomundaki belirli bir bölgede DNA hasarına neden olur. Daha sonra, DNA hasarının ve onarımının meydana gelmesine izin vermek için hücreler iki ila üç gün inkübe edilir ve GFP eksprese eden hücrelerin akış sitometrisi analizine dayalı olarak BRCA'nın bir proteininin spesifik protein varyantlarının DNA onarımında işlev görüp görmediğini gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu teknik, homolog rekombinasyon ile DNA hasarının onarımında spesifik protein varyantlarını analiz etmek için çok yönlü bir sistem oluşturmak için iki yerleşik yöntemi birleştirir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, daha önce kurulmuş yöntemlerin, BRCA'nın genetik olarak nakavt edildiği hücre dizilerine dayanmasıdır. HELOC hücrelerinden türetilen daha yönetilebilir bir hücre hattı kullanıyoruz, bu da endojen proteinin RNA girişimi ile BRC'nin bir tükenmesini ve bu hücrelerde test proteininin geri eklenmesini sağlıyor.

Şimdi bir varyant olan BRC bir proteini ifade ederek homolog rekombinasyonu test edebiliriz. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, işlem sırasında aşırı hücre ölümü nedeniyle mücadele edeceklerdir. Sitotoksisiteyi sınırlarken rekombinasyon reaksiyonunun etkisini en üst düzeye çıkarmak için dikkatli bir şekilde ayarlanmış bir transeksiyon durumuna sahip olmak önemlidir.

Bu protokolün başlamasından önce, hela DR 13 dokuz hücre hattı, hela hücrelerinin P-D-R-G-F-P ile kesilmesiyle kuruldu. P-D-R-G-F-P plazmidindeki ve kararlı transformatörlerdeki rekombinasyon substratı, GFP'nin iki aktif olmayan alelini içerir. Bir alel, ISCE için 18 baz çifti kısıtlama enzimi tanıma bölgesinin dahil edilmesi nedeniyle aktif değildir.

ISCE'nin kodlama dizisi ekspresyonunda, bu hücrelerdeki bir, aktif olmayan GFP'nin ikinci aleli üzerinde çift sarmallı bir DNA kırılması veya DSB oluşturur. Dizisinin I SCE E ile ilişkili kısmı, ilk alel üzerindeki bir bölge vahşi tiptir. Bu ikinci GFP aleli, DSP'nin homolog rekombinasyon onarımı için bir dizi donörü olarak işlev görebilir ve ilk transfeksiyondan bir gün önce akış sitometrisi ile kolayca tespit edilen aktif bir GFP aleli ile sonuçlanabilir.

En az% 90 birleşik tripsin olan 10 santimetrelik bir hela DR 13 dokuz hücreli bir tabak elde edin, hücreleri iki ila üç dakika boyunca bir mililitrede gözler. Dokuz mililitre D-M-E-M-F-B-S ekleyerek reaksiyonu durdurun ve hücre süspansiyonunu pipetleyerek iyice karıştırın. 0.5 mililitre D-M-E-M-F-B-S'de 24 oyuklu bir plakanın oyuğuna 40 mikrolitre trips inized hücre ekleyin, hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Birinci gün, hücreler %40 ila %50 arasında birleşmiş olmalıdır. Optimum ortamda plazmidi eksprese eden endojen b RCA birini ve B RCA bir mutantı tüketmek için irna'yı karıştırarak transfeksiyona başlayın. Daha sonra nükleik asitleri optimum ortamda dudak ile birleştirin.

Transfeksiyonu takiben üreticinin talimatlarına göre lipektomi transfeksiyonuna devam edin. Hücreleri inkübe etmek için geri koyun. Ortamı dört ila altı saat sonra antibiyotik içermeyen bir ortamla değiştirin.

Hücreleri ikinci gün gece boyunca inkübe etmek için geri koyun. Tripsin, 37 santigrat derecede kısa bir inkübasyondan sonra her bir oyuğa 0.3 mililitre tripsin reaktifi ekleyerek hücrelerdir, hücreleri tripsin reaktifi içinde yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri gevşetin. Tripsin bir kez yapıldıktan sonra, tripsin aktivitesini durdurmak için hücreleri 24 oyuklu plakadan iki mililitre D-M-E-M-F-B-S içeren altı oyuklu bir plakaya aktarın.

Altı oyuklu plakanın, ilk transfeksiyondan iki gün sonra olduğu gibi aynı koşullar altında gece boyunca inkübe edilmesine izin verin. SIR A'yı, plazma DNA'sını eksprese eden BRCA bir mutantı ve 62.5 mikrolitre Optum'da plazmidi eksprese eden ISCE'yi hazırlayın. Bu solüsyonu 2,5 mikrolitre LIPECTOMY 2060 2,5 mikrolitre Optum ile karıştırın.

Dört ila altı saatlik bir inkübasyondan sonra hücreleri transfekte etmeye devam edin. Ortamı D-M-E-M-F-P-S eksik antibiyotik ile değiştirin. Hücreleri altıncı günde inkübatöre geri koyun.

Tripsin, 0.5 mililitre tripsin tripsin reaktifi eklenerek her bir oyuktaki hücrelerdir. İki mililitre D-M-E-M-F-B-S ekleyerek reaksiyonu durdurun, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleyerek toplayın. Hücreleri bir mililitre taze D-M-E-M-F-B-S'de yeniden süspanse edin, GFP ekspresyonu için kuyu başına 10.000 hücreyi analiz edin.

Akış sitometrisi ile, tek canlı hücreler, ileri ve boyut dağınık parametreler kullanılarak kapılanır. GFP pozitif hücreler, GFP floresan dedektörü kullanılarak yönlendirilir ve sonuçlar bir histogram olarak sunulur. Kalan hücreler, floresan ile fotoğraf çekmek için yeniden kaplanabilir.

İstenen BRCA mikroskobu, homolog rekombinasyon ile çift sarmallı DNA kırılmalarının onarımı için yolu düzenler. Homolog rekombinasyon ile onarım geçiren hücreler, floresan mikroskobu ile kolayca tespit edilir. BRCA'nın RNAi tarafından tükenmesi, tespit edilen GFP pozitif hücrelerde keskin bir azalmaya neden olur.

FCA'nın çıktısı, x eksenindeki hücre başına GFP yoğunluğuna ve Y eksenindeki hücre sayısına sahip bir histogramdır. Transfekte yokluğunda, plazmidi eksprese eden birini SCE ederim. Tespit edilen GFP pozitif hücre yok.

İki ila altı arasındaki sütunlardaki sonuçların tümü, ISC'nin bir plazmidi eksprese ettiği hücrelerden üçüncü günde transfekte edildi. Tek bir deneyden elde edilen tipik bir sonuç setinde, hücrelerin %15.5'i SCE bir ekspresyondan sonra GFP pozitiftir ve ilgisiz bir gen için RNAi tükenmesini BRCA bir tükenmesini karşılaştırarak ve boş bir plazmit vektörünün geri eklenmesiyle kontrol eder. GFP dönüşümünü %0,7'ye düşürün% 15 ila 16 GFP pozitif hücreler elde edilerek tespit edildiği gibi tamamen restore edilmiş bir homolog rekombinasyon olan eksojen vahşi tip BRCA ilavesi.

Benzer şekilde, önemi bilinmeyen başka bir varyantın ifadesi. BRCA one I 21 B mutasyonu tamamen restore edildi. BRCA'nın bir bağımlı homolog rekombinasyon fonksiyonu, BRCA'nın bir M 18 T mutantının geri eklenmesi, vektör kontrolü ile benzer bir etkiye sahipti.

Bu varyant endojen protein ile benzer seviyelerde eksprese edildiğinden, BRCA bir M 18 T varyantının homolog rekombinasyonda fonksiyonel olmadığını düşündürmektedir. Bu prosedürü denerken, hücrelerin büyümesini izlemeyi, hücrelerin yavaş ve düşük conf fluens'ta büyüdüğünü ve kullanılan transfeksiyon karışımı miktarının azaltılması gerektiğini unutmamak önemlidir. Transfeksiyon ortamının zamanında çıkarılması da önemlidir.

Transfeksiyonu takip eden günlerde, ortama antibiyotikler dahil edilirse yüksek miktarda sitotoksisite olduğunu görüyoruz. Bu nedenle, birinci günden sonraki tüm ortamlar antibiyotiklerden yoksundur Gelişiminden sonra. Bu teknik, meme kanseri araştırmaları alanındaki araştırmacıların, kanser kliniklerinde klinik önemi bilinmeyen BRC one varyantlarının genetiğini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu çalışmada geliştirilen fonksiyonel BRC one testinin, BRC one varyantlarının kansere yatkınlık üzerindeki etkilerinin daha iyi tahmin edilmesini sağlayacağını umuyoruz.