Name: Endojen Wild-tip BRCA1 Express hücreler kullanarak Homolog Rekombinasyon BRCA1 Mutasyonlar Etkileri belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Öğrenin, BRCA1 varyantlarını homolog rekombinasyon deneyiyle değerlendirmek için endojen proteinin siRNA ile deplesyonunu ve mutant plazmid ekspresyonunu kullanarak DNA tamir fonksiyonlarını analiz etme yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu iş için fon sağlamak için Ohio State Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi&#39;nde minnettarız.

1. Entegre Rekombinasyon Yüzey Hücre Hattı <ol><li> HeLa hücreleri PDR-GFP (M. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi'nden plazmid hediye 7) ile stabil bir şekilde dönüştürülmüş ve transformants seçimi için puromycin muhafaza edildi. </li><li> Hücreler% 10 fetal sığır serumu, 2 mM GlutaMAX, 1 mM sodyum piruvat, penisilin / streptomisin (100 U / mL/0.1 mg / ml), ve 1.5 ug / ml puromycin içeren DMEM / FBS geçişli. </li></ol> Plazmid ve istikrarlı transformants PDR-GFP rekombinasyon substrat, GFP iki inaktif allel (Şekil 1) içerir. Bir allel I-SCEI 18 bp restriksiyon enzimi tanıma sitesi kodlama sırayla dahil edilmesi nedeniyle devre dışı. Bu hücrelerin I-SCEI İfade çift iplikli DNA sonu (DSB) oluşturur. Bu DNA'nın inaktif GFP ikinci bir allel var, ama ilk allel I-SCEI site ile ilişkili, dizisi kısmını vahşi türüdür. Bu ikinci GFP allel DSB homolog rekombinasyon tamiri için bir dizi donör olarak işlev görebilir ve flow sitometri ile kolayca tespit aktif bir GFP allel neden olacaktır. Alternatif olarak, DSB nonhomologous I-SCEI kısıtlama yok ve GFP-negatif hücreler neden olur, sonunda katılmayı tarafından tamir edilebilir. Bir hücre homolog rekombinasyon GFP pozitif hücrelerin yüzdesi sayarak belirlenir. Bu hücre hattı, pHeLa-DR13-9, sıfır arka plan GFP sinyal ve plazmid, pCBASce ifade I-SCEI transfeksiyon üzerine GFP pozitif hücrelerin nispeten yüksek bir yüzdesi tüm klonlar arasında seçildi. (PCBASce ve vektör kontrol, pCAGGS, M. Jasin Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi tarafından sağlandı.) HeLa-DR13-9 hücre hattı talebi üzerine yazarları mevcuttur. 2. Transfeksiyon Endojen BRCA1 İncelten ve Geri Mutant BRCA1 ekle. <ol><li> , Ilk transfeksiyon önce (genellikle Salı) günü: 10 cm çanak HeLa-DR13-9 hücreleri en az% 90 konfluent başlayın. </li><li> 1 mL Trypsinize ve 9 mL DMEM / FBS ekleyerek reaksiyonu durdurmak, pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> 40 mcL başına iyi bir 24 plaka 0.5 mL DME / FBS tripsinize hücreleri ekleyin. </li><li> Gün 1 transfections (Çarşamba): daha az baştan başlamak hücreleri, ~% 40-50 birleşmiş olmalıdır. Transfect karıştırılarak: 5 pmol siRNA + 12.5 mcL Opti-MEM 0.3 ug plazmid DNA ifade BRCA1-mutant ve 12.5 mcL Opti-MEM 0.5 mcL Lipofectamine 2000. Lipofectamine protokolü (Invitrogen) göre transfeksiyon ile devam edin. </li><li> Medya 4-6 saat sonra değiştirin. BRCA1 tüketmek için kullandığınız siRNA belirterek BRCA1 3'-UTR dizileri 80.780 - 80.798 (katılım sayısı AY273801) dizisi GCUCCUCUCACUCUUCAGU dayanmaktadır. </li><li> 2. Gün: 6 plaka, 24 plaka trypsinizing hücrelere aktarın. </li><li> 3. Gün transfections: 25 pmol siRNA + 0.75 ug plazmid DNA ifade BRCA1 mutant 62.5 mcL Opti-MEM ve 62.5 mcL Opti-MEM 2.5 mcL Lipofectamine 2000 + 0.75 ug pCBASce (veya pCAGGS vektör kontrolü). Medya 4-6 saat sonra değiştirin. </li></ol> 3. Transfektanları, analizi. <ol><li> 6 gün, her bir kuyudan hücreleri trypsinize ve 1 ml DMEM / FBS durdurmak. GFP ifade hücreleri incelendiğinde, 5 veya 7 gün yapılabilir, ama biz 6 eserleri o günün en iyi bulmak olabilir. </li><li> Flow sitometri ile ortalama 10.000 hücre analiz edin. Ohio State Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi Analitik Sitometri paylaşılan kaynak Becton Dickinson FACSCalibur enstrüman kullanın. Tek, canlı hücreleri ileri ve yan dağılım parametreleri kullanarak kapılı. GFP pozitif hücrelerin GFP floresan dedektör (FL1) kullanılarak tespit edilir ve sonuçları bir histogram (Şekil 2, alt) olarak sunulmuştur. </li><li> Sol içinde hücreler, istenirse floresan mikroskobu fotoğrafçılığı için replated olabilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: BRCA1 homolog rekombinasyon 6,11 çift zincirli DNA kırıkları tamir için yolu düzenler. Homolog rekombinasyon onarım geçiren bu hücrelerin kolayca floresan mikroskobu (Şekil 2, üst) tarafından tespit edilir. BRCA1 sonuçları tespit GFP pozitif hücreler (Şekil 2, sağ) bir azalma tükenmesi. FACSCalibur çıktı, X ekseni ve Y ekseni (Şekil 2, alt) hücrelerinin sayısı, hücre başına GFP yoğunluğu ile bir histogram. Tipik bir tek bir deney sonuçları seti, hücrelerin% 15.5 I-SCEI ifade ve kontrol RNAi tükenmesi (Şekil 3) sonra GFP pozitif. Buna karşılık, BRCA1 ve vektör tükenmesi% 0.7 geri GFP-dönüşüm azalır ekleyin. Add-back yabani tip BRCA 1 veya BRCA 1 (I21V) tamamen restore homolog rekombinasyon,% 15-16 oranında, GFP-pozitif hücrelerin elde algılandı. BRCA1 (M1 add-back8T) mutant (Şekil 3, şerit 5), vektör kontrol add-back olarak benzer bir etkisi vardı. Bu varyant 9 endojen protein olarak benzer seviyelerde ifade beri, biz böylece BRCA1 (M18T) varyant homolog rekombinasyon fonksiyonel olmayan yorumlamak. Biz genellikle I-SCEI ifade plazmid transfecting sonra GFP pozitif dönüştürmek hücrelerin% 10-20 var. BRCA1, tükenmesi tekrarlanabilir, yaklaşık 8-10 kat GFP pozitif hücrelerin dönüşüm azaltır. GFP pozitif hücreler gerçek yüzdeleri, bir deney içinde kontrol tükenmesi göre BRCA1 tükenmesi deney deney, GFP pozitif hücrelerin oranı değişebilir rağmen oldukça tutarlıdır. Biz sınır tanımayan dönüşüm oranı% 100 ve yüzde olarak BRCA1 tükenişleri ve eklenti sırtlarını ifade sonuçları ayarlayarak sonuçları normalleştirmek. Bu şekilde, birden fazla deneyler birleştirmek ve deneysel bir varyasyon yüksek değildir. Şimdiye kadar sağlam sonuçlar vermiştir BRCA1 mutantlar geri ekleyin: her varyant BRCA1 ya tam homolog rekombinasyon aktivite geri ya da herhangi bir etkisi olmuştur. Bu sonuçların elde edilmesinde önemli bir göz transfeksiyon koşulları tedavi edilmezse hücrelerinde endojen protein konsantrasyonu yaklaşık eşit BRCA1 protein seviyeleri üretmek. BRCA1 bile kusurlu bir mutant bir aşırı ekspresyonu çok yüksek bazı olumlu homolog rekombinasyon aktivite neden olabilir. Üstesinden gelmek için gerekli bir sorun transfeksiyon toksisitesi oldu. BRCA1 kendisi tükenmesi yavaş hücre büyümesi ve çanak hücrelerinin sayısına göre Lipofectamine-2000 ve plazmid DNA dengesi, tutarlı bir düzeyde tutulmalıdır. Çok fazla Lipofectamine veya plazmid DNA, hücre sayısını azaltmak ve hücrelerin sayısı, güvenilir flow sitometri sonuçları elde etmek için yetersiz olacaktır. Transfekte hücrelerinin sayısı karşısında plazmid ve Lipofectamine reaktiflerin denge hücreleri canlılığını korumak için oldukça önemlidir. <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 rekombinasyon substrat. M. Jasin 7,12 grubu tarafından geliştirilen strateji tasvir edilmiştir. PDR-GFP plazmid I-SCEI kısıtlama endonükleaz site içermektedir biri GFP iki hatalı allel içerir. Bir HeLa kaynaklı hücre hattı, bu DNA, tek bir genom 9 yerinde entegre substrat ve aktif onarım, GFP-pozitif bir allel dönüşüm homolog rekombinasyon sonuçları I-SCEI yerinde çift iplikli DNA sonu içerir. <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 floresan mikroskopi GFP pozitif hücrelerin tespiti. Hücreler bu protokol uyarınca, test ve kontrol tükenmiş hücreleri GFP ifade (solda) ile hücreler gibi yüksek bir oranda tespit, homolog rekombinasyon aktif. GFP pozitif hücreler (sağda) sayısında keskin bir düşüş RNAi sonuçlarına göre BRCA1 tükenmesi. <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 BRCA1 missense mutantlar bir add-back Sonuçları. Bu histogramda tek bir deney sonuçları gösterilmiştir. Plazmid ifade transfekte I-SCEI yokluğu (şeritli 1) tespit hiçbir GFP pozitif hücreler vardır. Plazmid ifade I-SCEI 3. gününde transfekte edildiği hücrelerde şerit 2-6 sonuçlar alınmıştır. Ilgisiz bir gen (lusiferaz) tükenmiş ve vektör add-back, hücrelerin% 15.5 (şeritli 2), GFP pozitif hücreler. BRCA1 ve vektör tükenmesi add-back homolog rekombinasyon BRCA1 kaybı etkisi (şeritli 3) ortaya koymaktadır. BRCA1 tükenmesi ve yabani tip BRCA1 (şerit 4), BRCA1 (M18T) (şeritli 5), BRCA1 (I21V) (şeritli 6) add-back etkileri gösterilmiştir. Bu sonuçlar, tek bir deney, homolog rekombinasyon, belirli bir mutant BRCA1 protein tarafından desteklenen bir önlem alabilmek için en az iki veya daha fazla tekrar deneyleri ile birlikte olacaktır.

<ol><li>Carvalho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cancer+risk+associated+with+germ+line+BRCA1+missense+variants+by+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis.</a> Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).</li>
<li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+epidemiology+of+BRCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Genetic epidemiology of BRCA1.</a> Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).</li>
<li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+functional+effects+of+unclassified+genetic+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Assessment of functional effects of unclassified genetic variants.</a> Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).</li>
<li>Tomlinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+breast+cancer+cell+line+derived+from+a+germ-line+BRCA1+mutation+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier.</a> Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).</li>
<li>Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-predisposing+mutations+within+the+RING+domain+of+BRCA1%3A+loss+of+ubiquitin+protein+ligase+activity+and+protection+from+radiation+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).</li>
<li>Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brca1+controls+homology-directed+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Brca1 controls homology-directed DNA repair.</a> Mol Cell. 4, 511-518 (1999).</li>
<li>Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fanconi+anemia+monoubiquitination+pathway+promotes+homologous+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).</li>
<li>Pierce, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+breaks+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand breaks and tumorigenesis.</a> Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).</li>
<li>Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+tumor+mutations+in+BRCA1+that+abolish+its+function+in+homologous+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination.</a> Cancer Res. 70, 988-995 (2010).</li>
<li>Easton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genetic+assessment+of+1%2C433+sequence+variants+of+unknown+clinical+significance+in+the+BRCA1+and+BRCA2+breast+cancer-predisposition+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes.</a> Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).</li>
<li>Snouwaert, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+deficient+embryonic+stem+cells+display+a+decreased+homologous+recombination+frequency+and+an+increased+frequency+of+non-homologous+recombination+that+is+corrected+by+expression+of+a+brca1+transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene.</a> Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).</li>
<li>Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku+DNA+end-binding+protein+modulates+homologous+repair+of+double-strand+breaks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells.</a> Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).</li>
<li>Spearman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+applicable+models+to+characterize+BRCA1+and+BRCA2+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance.</a> J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).</li>
<li>Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+BRCA1+ring+finger+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance.</a> Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).</li>
</ol>

Bu yöntemin avantajı, yabani tip endojen ifade BRCA1 hücreleri kullanılarak homolog rekombinasyon DNA onarımı düzenleyen BRCA1 protein fonksiyonu çalışma. Biz iki ayrı kurulmuş yöntemleri homolog rekombinasyon sürecinin eğitim ve DNA tamir fonksiyonu için BRCA1 varyantları test etmek için yeni bir yöntem elde etmek için RNAi-aracılı tükenmesi kullanan kabul ettiler. Bu yöntemin başarısı için anahtar GFP dönüşüm çok yüksek düzeyde elde böyle genom rekombinasyon substrat gibi HeLa gibi kolay transfectable bir hücre hattı kurmak oldu. Saptanabilir arka plan GFP sinyali elde etmek için birden fazla klonlar orijinal dönüşüm elenmiş, ama plazmid I-SCEI ifade transfeksiyon üzerine GFP dönüşüm çok yüksek bir düzeyi vardı. Bu yöntem ile, şimdi homolog rekombinasyon fonksiyonu için diğer özel BRCA1 amino asit kalıntıları araştırıyoruz. Bu çalışma, biyolojik anlayışlar ile birlikte, bu sonuçlara klinik kanser genetiği uygulanabilir. BRCA1 missense mutasyon yüzdesi yüksek, çok nadir varyantları vardır beri bilinmeyen klinik önemi vardır ve bu çok genetik segregasyon analizi 3,10,13,14 kanseri ilişkiyi belirlemek için yeterli bilgi yoktur . Bu yöntemi kullanarak, BRCA1 homolog rekombinasyon düzenleyen biyolojik işlevi belirli bir varyant sonuçlarını kendi genomunda bu varyantlarının bir taşıyan kadınları bilgilendirmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>9871-5200</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-GR312</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr></tbody></table>

endojen wild-tip brca1 express hücreler kullanarak homolog rekombinasyon brca1 mutasyonlar etkileri belirlenmesi

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

Missense mutasyon, fonksiyonel analiz endojen protein hücre varlığı ile karmaşık olabilir. BRCA1 yapı-işlev analizleri, tam uzunlukta BRCA1 protein ve hypomorphic BRCA1 protein 1,2,3,4,5 ifade hücre hatları ile çalışan doğasında zorluklar için sağlam bir tahlil eksikliği ile komplike olmuştur . Biz bir hücreye endojen BRCA1 protein akut BRCA1 mRNA 3&#39;-UTR hedefleyen RNAi tükenmiş ve bir plazmid BRCA1 varyant ifade co-transfecting yerini sayede bir sistem geliştirdi. Bu prosedürün bir avantajı BRCA1 ve eş zamanlı yedek akut susturulması hücreleri BRCA1 fonksiyon kaybı telafi etmek için zaman içinde ortaya çıkabilecek ikincil mutasyonlar veya uyarlamalar olmadan büyümeye izin veren. Bu tükenmesi ve add-back işlemi kolayca homolog rekombinasyon aktivite için test HeLa kaynaklı hücre hattı yapıldı. Homolog rekombinasyon tahlil rekombinasyon substrat genom (Şekil 1) 6,7,8,9 entegre sayede daha önce yayınlanmış bir yöntem dayanmaktadır . Bu rekombinasyon substrat etkin olmayan bir GFP allel içinde nadir kesim I-SCEI restriksiyon enzimi sitesi ve aşağı ikinci bir inaktif GFP allel. Homolog rekombinasyon tarafından tamir edilebilir çift iplikli bir ara, I-SCEI sonuçları ifade ve homolog rekombinasyon ara tamir eğer kolayca GFP protein ekspresyonu için flow sitometri tarafından atılırsa aktif bir GFP allel oluşturur plazmid, Transfeksiyon . Endojen BRCA1 tükenmesi homolog rekombinasyon aktivite 8-10 kat azalma ve vahşi-tip plazmid tam homolog rekombinasyon fonksiyonu restore add-back. Belirli bir noktaya tam uzunlukta BRCA1 mutantlar co-transfekte plazmid ifade edildi, özel missense mutant etkisi atılır. Bir örnek olarak, BRCA1 (M18T) protein, bilinmeyen bir klinik önemi 10 varyant, ifade, bu hücrelerin de ifade edildi, homolog rekombinasyon BRCA1-bağımlı geri yüklemek için başarısız oldu . Bilinmeyen bir önemi de başka bir versiyonudur kontrast, ifade, BRCA1 (I21V) tam BRCA1 bağımlı homolog rekombinasyon fonksiyonu restore. BRCA1 missense mutasyon fonksiyon testleri Bu strateji centrosome fonksiyonu (Kais ve ark, yayınlanmamış gözlemler) assaying başka bir biyolojik sistemi tatbik edilmiştir. Genel olarak, bu yaklaşım, resesif analiz edilmelidir herhangi bir gen missense mutantların analizi için uygundur.

Biz RNAi kullanarak bir hücrenin endojen BRCA1 protein tüketen ve bir kodlama değişiklik içeren bir BRCA1 noktası mutant yerine homolog rekombinasyon DNA hasarı tamir için bir doku kültürü bazlı analiz BRCA1 varyantları test etmek için bir yöntem sağlar.

Endojen Wild-tip BRCA1 Express hücreler kullanarak Homolog Rekombinasyon BRCA1 Mutasyonlar Etkileri belirlenmesi

Missense mutasyonların fonksiyonel analizi, hücrede endojen proteinin bulunması nedeniyle karmaşıklaşabilir. ...'nın yapı-fonksiyon analizleri...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vitro bir homolog rekombinasyon analizi kullanarak BRCA1 proteinindeki spesifik varyantları test etmektir. Bu, BRCA1'e özgü kısa müdahaleleyici RNA (siRNA) ve test edilen BRCA1 varyant proteinlerinin hücrelerde yeniden ekspresyonu için plazmidin transfeksiyonu yoluyla, endojen vahşi tip BRCA1 proteininin test edilen varyantla değiştirilmesiyle gerçekleştirilir; ikinci adımda, mutant BRCA1'i eksprese eden plazmid ve kısa müdahaleleyici RNA'ya ek olarak, test hücresinin DNA genomunda spesifik bir bölgede DNA hasarına neden olan I SCE1 proteinini eksprese eden bir plazmid eklenir. Ardından, DNA hasarının meydana gelmesi ve onarımın gerçekleşmesi için hücreler iki ila üç gün boyunca inkübe edilir; GFP eksprese eden hücrelerin akış sitometrisi analiziyle, BRCA1 proteininin spesifik protein varyantlarının homolog rekombinasyon yoluyla DNA onarımında işlev görüp görmediğini gösteren sonuçlar elde edilir.Bu teknik, homolog rekombinasyon yoluyla DNA hasarının onarımındaki spesifik protein varyantlarını analiz etmek için çok yönlü bir sistem oluşturmak amacıyla iki yerleşik yöntemi birleştirir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, önceki yöntemlerin BRCA1 genetik nakavtuna sahip hücre hatlarına dayanmasıdır. Biz, endojen proteinin RNA interferansı ile BRCA1 eksiltilmesine ve bu hücrelere test proteininin geri eklenmesine olanak tanıyan, HELOC hücrelerinden türetilmiş daha yönetilebilir bir hücre hattı kullanıyoruz.Artık bir varyant BRC1 proteini eksprese ederek homolog rekombinasyonu test edebiliriz. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, prosedür sırasındaki aşırı hücre ölümü nedeniyle zorluk yaşarlar. Sitotoksisiteyi sınırlarken rekombinasyon reaksiyonunun etkisini maksimize eden bir transfeksiyon koşulunun dikkatle ayarlanması önemlidir.Bu protokolün başlangıcından önce, hela hücrelerinin P-D-R-G-F-P ile transfekte edilmesiyle hela DR 13 dokuz hücre hattı oluşturulmuştur. Hücre hattını, stabil olarak transfekte edilmiş hücrelerin seçimi için purmycin içeren 10 santimetre çapında Petri kaplarında sürdürün. P-D-R-G-F-P plazmidindeki ve stabil transformantlardaki rekombinasyon substratı, GFP'nin iki inaktif alelini içerir. Alellerden biri, ISCE bir için 18 baz çiftlik restriksiyon enzim tanıma bölgesinin dahil edilmesi nedeniyle inaktiftir.Kodlama dizisinde, bu hücrelerdeki ISCE one ekspresyonu, inaktif GFP'nin ikinci aleli üzerinde çift zincirli bir DNA kırığı veya DSB oluşturur. Dizisinin ilk aleldeki I SCE E one bölgesiyle ilişkili olan kısmı yabanidir. Bu ikinci GFP aleli, DSB'nin homolog rekombinasyon onarımı için bir dizi donörü olarak işlev görebilir ve ilk transfeksiyondan bir gün önce akış sitometrisi ile kolayca tespit edilebilen aktif bir GFP aleli ile sonuçlanır.En az %90 konfluen durumdaki HeLa DR 13 hücrelerinin bulunduğu 10 santimetrelik bir kap temin edin; hücreleri bir mililitre tripsin ile iki ila üç dakika boyunca inkübe edin. Dokuz mililitre DMEM-FBS ekleyerek reaksiyonu durdurun ve hücre süspansiyonunu pipetleme yaparak iyice karıştırın. 24 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna, 0,5 mililitre DMEM-FBS içinde 40 mikrolitre tripsinizize edilmiş hücre ekleyin; hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin.Birinci günde, hücreler %40 ile %50 arasında konfluen olmalıdır. Endojen b RCA one'yi tüketmek için kullanılan siRNA ile B RCA one mutant eksprese eden plazmidi optimum medyada karıştırarak transfeksiyona başlayın. Ardından, nükleik asitleri optimum medyadaki lipozomlarla birleştirin.Transfeksiyon sonrası, üretici talimatlarına göre lipektomi transfeksiyonunu gerçekleştirin. Hücreleri inkübasyona geri bırakın. Dört ila altı saat sonra ortamı, antibiyotik içermeyen bir besiyeri ile değiştirin.Hücreleri ikinci günde gece boyunca inkübe edilmek üzere geri döndürün. Her bir kuyucuğa 0,3 mililitre trip sin tripzin reaktifi ekleyerek hücreleri tripsinize edin; 37 °C'de kısa bir inkübasyonun ardından, hücreleri tripsin reaktifi içinde pipetle yukarı ve aşağı çekerek gevşetin. Tripsinizasyon tamamlandığında, tripsin aktivitesini durdurmak için hücreleri 24 kuyucuklu plakadan, iki mililitre D-M-E-M-F-B-S içeren altı kuyucuklu bir plakaya aktarın.Altı kuyucuklu plakayı, ilk transfeksiyondan iki gün önceki ile aynı koşullar altında gece boyunca inkübe edin. SIR A'yı, BRCA one mutant eksprese eden plazmid DNA'yı ve ISCE one eksprese eden plazmidi 62,5 µL Optum içinde hazırlayın. Bu çözeltiyi 2,5 µL LIPECTOMY 2060 ve 2,5 µL Optum ile karıştırın.Dört ila altı saatlik inkübasyonun ardından hücreleri transfekte etme işlemine geçin. Besiyerini antibiyotik içermeyen D-M-E-M-F-P-S ile değiştirin. Hücreleri altıncı günde inkübatöre geri koyun.Her kuyucuğa 0,5 mililitre tripsin reaktifi ekleyerek hücreleri tripsinize edin. İki mililitre D-M-E-M-F-B-S ekleyerek reaksiyonu durdurun. Hücreleri oda sıcaklığında, 1000 RPM'de beş dakika santrifüj ederek toplayın. Hücreleri bir mililitre taze D-M-E-M-F-B-S içinde yeniden süspande edin ve GFP ekspresyonu için kuyucuk başına 10.000 hücreyi analiz edin.Akış sitometrisi ile, canlı tekil hücreler ileri ve yan saçılma parametreleri kullanılarak seçilir. GFP pozitif hücreler GFP floresans dedektörü kullanılarak yönlendirilir ve sonuçlar bir histogram olarak sunulur. Geriye kalan hücreler, floresan görüntüleme için yeniden ekilebilir.İstenen BRCA1 mikroskopisi, homolog rekombinasyon yoluyla çift zincirli DNA kırıklarının onarım yolağını düzenler. Homolog rekombinasyonla onarım gerçekleşmiş olan hücreler, floresan mikroskopi ile kolayca tespit edilir. RNAi ile BRCA1'in tüketilmesi, tespit edilen GFP pozitif hücrelerin sayısında keskin bir azalmaya yol açar.FCA'dan elde edilen çıktı, x ekseninde hücre başına GFP yoğunluğu ve y ekseninde hücre sayısının yer aldığı bir histogramdır. Transfekte edilmemiş, ekspresyon plazmidi içermeyen SCE'lerin yokluğunda, GFP pozitif hücre tespit edilmemiştir.İkinci ile altıncı sütunlar arasındaki sonuçların tamamı, üçüncü günde ISC one ekspresyon plazmidinin transfekte edildiği hücrelerden alınmıştır. Tek bir deneyden elde edilen tipik sonuç setinde, I SCE one ekspresyonu ve ilgisiz bir gen için kontrol RNAi depleksyonu sonrası hücrelerin %15,5'i GFP pozitiftir; buna karşın BRCA one depleksyonu ve boş bir plazmid vektörünün geri eklenmesi, GFP konversiyonunu %0,7'ye düşürmüştür. Ekzojen wildtype BRCA one eklenmesi, %15 ile %16 arasında GFP pozitif hücre elde edilmesiyle tespit edildiği üzere, homolog rekombinasyonu tamamen geri kazandırmıştır.Benzer şekilde, önemi bilinmeyen başka bir varyantın ekspresyonu. BRCA1 21B mutasyonu, BRCA1 bağımlı homolog rekombinasyon fonksiyonunu tamamen geri kazandırmıştır. BRCA1 M18T mutantının geri eklenmesi, vektör kontrolü ile benzer bir etki göstermiştir.Bu varyantın endojen proteinle benzer seviyelerde eksprese edilmesi, BRCA1 M18T varyantının homolog rekombinasyonda işlevsiz olduğunu göstermektedir. Bu prosedür uygulanırken hücre büyümesinin izlenmesi gerektiğini, hücrelerin yavaş ve düşük konfluens düzeyinde büyüdüğünü ve kullanılan transfeksiyon karışımı miktarının azaltılması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Ayrıca, transfeksiyon ortamının zamanında uzaklaştırılması da önem taşımaktadır.Transfeksiyondan sonraki günlerde, besiyerine antibiyotikler eklendiğinde yüksek düzeyde sitotoksisite gözlemledik. Bu nedenle, birinci günden sonraki tüm besiyerleri geliştirme aşamasından itibaren antibiyotik içermemektedir. Bu teknik, meme kanseri araştırmaları alanındaki araştırmacıların, kanser kliniklerinde klinik önemi bilinmeyen BRC 1 varyantlarının genetiğini incelemelerine olanak sağlamıştır.Bu çalışmada geliştirilen fonksiyonel BRC one analizinin, BRC one varyantlarının kanser yatkınlığı üzerindeki etkilerinin daha iyi tahmin edilmesine olanak sağlayacağını umuyoruz.

identifying-effects-brca1-mutations-on-homologous-recombination-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

NGS dizilimi için gDNA zenginleştirme, yapısal mutasyonların incelenmesi için kolay ve güçlü bir araçtır. Bu makalede, DNA hasarının onarımında yer alan 11 genin tam dizisini basitçe analiz etme prosedürünü sunuyoruz.

Whole Sırasının NGS Analiz için bir transpozaz tabanlı Technology tarafından gDNA Zenginleştirme BRCA1 BRCA2 ve 9 Genler

siRNA ile gen susturma, kanser biyolojisini daha iyi anlamak için BRCA2'ye bağımlı biyolojik fonksiyonları anında çıkarımlarla analiz etmek için uygun bir deneysel stratejiyi temsil eder. BRCA2'yi verimli bir şekilde susturmak için bir yöntem, insan hücre hatlarında immünoblotlama yoluyla BRCA2 protein ekspresyonundaki değişiklikleri tespit etmek ve ölçmek için deneysel prosedür ile birlikte sunulmaktadır.

Susturulması<em&gt; BRCA2</em&gt; Kültür İnsan hücrelerinde Roman BRCA2 düzenlenmiş Biyolojik Fonksiyonları Belirlemek İçin

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

BRCA1 mutasyonu olan kişilerin kansere yakalanma riski daha yüksektir, bu da BRCA1 varyantlarının işlevinin doğru bir şekilde değerlendirilmesini garanti eder. Burada, brca1 varyantlarının canlı hücrelerde hedeflenen C:G ila T:A dönüşümünü sağlayan CRISPR aracılı sitozin baz editörleri kullanılarak işlevsel olarak değerlendirilmesi için bir protokol açıkladık.

CRISPR Aracılı Temel Editörler kullanılarak BRCA1 varyantlarının fonksiyonel değerlendirmesi

Mevcut protokolde, immünofluoresans bazlı bir yöntem kullanarak hücre döngüsünün S/G2 aşamasında DNA çift iplik ucu rezeksiyonunun nasıl görselleştirilerek görselleştirilmeyi gösteriyoruz.

BrdU-DNA Etiketlemesi Kullanılarak Küresel DNA Çift Telli Uç Rezeksiyonunun Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü Ayrımcılığı Görüntüleme ile birleştiğinde

Burada sunulan sgRNA / CAS9 endonükleaz ve CD4 promotörünün yakınındaki çift iplikçik kopması onarımı ile ilişkili mutasyonları tanımlamak için kullanılabilecek yeni nesil dizileme protokolüdür.

CD4 promotörünün yakınında CAS9 kaynaklı çift iplikçik kopmasının onarımıyla ilişkili mutasyonları tanımlamak için yeni nesil dizilemenin kullanılması

Bu protokol, HEK-293T hücrelerinde NHEJ ve HR'nin etkinliğini ölçmek için bir ekstrakromozomal homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) testi ve homolog rekombinasyon (HR) testini tanımlar.

HEK-293T Hücrelerinde Homolog Olmayan Uç Birleştirme ve Homolog Rekombinasyon Etkinliğinin GFP Tabanlı Raporlayıcı Sistemler Kullanılarak Analizi

Bu protokol, DNA replikasyonu sırasında meydana gelen DNA hasarının derecesini araştırmak için tasarlanmıştır. Nötr koşullar altında, DNA kırılmalarının indüksiyonu kısa bir zaman dilimi içinde kolayca değerlendirilebilir. Ek olarak, protokol diğer hücre tiplerine ve çeşitli replikasyon stres reaktiflerine uyarlanabilir.

Nötr Kuyruklu Yıldız Deneyi ile İnsan Hücrelerini Bölmede DNA Kırılmalarının Tespiti

Öğrenin, BRCA1 varyantlarını homolog rekombinasyon deneyiyle değerlendirmek için endojen proteinin siRNA ile deplesyonunu ve mutant plazmid ekspresyonunu kullanarak DNA tamir fonksiyonlarını analiz etme yöntemini.

Endojen Wild-tip BRCA1 Express hücreler kullanarak Homolog Rekombinasyon BRCA1 Mutasyonlar Etkileri belirlenmesi

Daha fazla video keşfet