Plazmid DNA Qiagen Miniprep Kit kullanarak Bakteri kolonileri Arındırıcı

Ben Mike Halen'in laboratuvarından, California Üniversitesi, Irvine'deki Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'ndenim. Bugün size bakterilerden DNA saflaştırmak için collagen mini fabricate kullanımını göstereceğim. Bunu, bir bölgeye özgü mutagenez deneyinin bir adımı olarak gerçekleştiriyorum.

Plazmidi elde ettikten sonra, seçilen klonların istenen mutasyonları içerdiğini doğrulamak için eklenen parçayı dizileyeceğim. Mini preparasyona geçmeden önce, dün yaptıklarımızı kısaca özetleyelim. Bakterileri büyütmek için öncelikle ayrı tüplere beş mililitre LB agar inoküle etmem gerekiyor.

Ve gördüğünüz gibi, tüpe bakterileri eklemeden önce besiyeri berraktır. Ardından, bir agar plakadan tek koloni ekmek için pipet kullanıyorum ve kontaminasyon olmaması için her seferinde ucu değiştiriyorum. Sonra tüpleri çalkalayıcıya yerleştiriyorum ve en az sekiz saat boyunca büyütmek için 300 RPM hızını kullanıyorum; normalde bunu gece boyunca yapabiliyoruz.

Kolajen mini hazırlama kitinde üç önemli tampon çözelti bulunmaktadır. Bunlar P one, P two ve N three'tür. RNA içerdiği için P one'ı normalde dört derecede saklarız; P two'yu oda sıcaklığında bırakırız ve N three'ü deneyden sekiz saat önce önceden hazırlarız.

Gördüğünüz gibi, bakteriler içeride büyüdüğü için ortam şu an bulanık; bu nedenle ortamdan 5 µL alıp başka bir plak üzerine ekeceğim. Böylece klonları doğruladıktan sonra doğrudan bakterilere geri dönebilirim ve tekrar transformasyon yapmama gerek kalmaz. Ortamı santrifüj ettikten sonra, tüpün dibinde belirgin bir bakteri peletinin oluştuğunu görebilirsiniz; ortamın kontamine olmaması için süpernatantı çamaşır suyuna aktaracağız ve pelet orada kalmaya devam edecek.

Şimdi bakteri pelletine P1 tamponu ekliyorum. P1, bakterileri yeniden süspanse etmek için kullanılan yeniden süspansiyon tamponudur. Şimdi, bakterileri tamponla karıştırmak için çözeltiyi pipetle yukarı ve aşağı çekeceğim.

Bu aşamada, çözeltide herhangi bir bakteri kümesi görmemelisiniz. Şimdi, yeniden süspande edilen bakterileri yeni bir Eppendorf tüpüne aktaracağım. Tüplerimi her zaman etiketlerim; böylece onları ayırt edebilir ve hangi çözeltinin hangi klondan geldiğini bilebilirim.

Şimdi her tüpe tampon P2 ekledim; tampon P2, bakterileri liz etmek için kullanılan bir lizis tamponudur. Tampon P2'yi ekledikten sonra, çözeltinin hala berrak olmadığını görebilirsiniz. Şimdi, çözeltinin iyi karışması için tüm tüpleri birkaç kez altüst ediyorum.

Ve şimdi çözeltinin berraklaştığını görebilirsiniz. Şimdi tüplerin her birine nötralizasyon tamponu olan tampon N3'ü ekliyorum. Tampon N3'ü eklediğim anda protein çökelmesini hemen görüyorum, ancak çözeltiyi iyice karıştırmak için tüpleri birkaç kez ters çevirmeye devam edeceğim.

Çözeltiyi iyice karıştırdıktan sonra, tampon çözelti ve üçü eklediğimde görünüm bu şekilde olmalıdır. Şimdi, protein çökelmesini santrifüjle çöktürmek için sge cihazını 10 dakika boyunca döndüreceğim; bir Cal VAC altı s düzeneği kurdum.

Tüm parçaları sırasıyla birleştirdim ve ardından bunları bir vakum sistemine bağladım. Şimdi, kalibrasyon hazırlama yardımcısını, kayışı manifolda ekliyorum. Bugün sadece bir tane yapacağımız için diğer yuvaları kapatıyorum.

Böylece iyi bir vakuma sahip olduk. Gördüğünüz üzere, şeridi tüplerime göre etiketledim ve vakumu açtığımda iyi bir vakum elde ettim. Tamam, tüpü santrifüj ettikten sonra, protein pelletinin dipte olduğunu görebilirsiniz ve DNA'nın halen süpernatant içinde çözünmüş olması gerekir.

Şimdi, DNA içeren süpernatantı inek hazırlık şeritlerine aktarıyoruz; belirtmeliyim ki, çapraz kontaminasyonu önlemek için her zaman uçları değiştirmemiz gerekir. Şimdi vakumu açıyorum. Şimdi vakumu kapatıyorum ve filtrede şu an DNA bulunan şeridi yıkamak için PB tamponu ekliyorum.

Şimdi, şeridi yıkamak için PB çözeltisini ekliyorum ve filtredeki DNA hala şeritlerde bulunuyor. Şeride temas etmediğim sürece bu sefer uçları değiştirmeme gerek yok. Şimdi, tampon pb için yaptığımın aynısını yaparak p tamponunu şeride ekliyorum.

Vakumu açtıktan sonra bu işlemi iki kez gerçekleştireceğim. Gördüğünüz üzere, P çözeltisi şu an şeritten geçiyor ve filtrenin tamamen kuruduğundan emin olmak için vakumu beş dakika daha açık bırakacağız. Beş dakikalık vakum işleminden sonra, şeridi kutudan çıkarın ve ardından Kimwipe ile sarın. Kalan P tamponunu temizlemek için şeridi masaya hafifçe vurun.

Şu anda P tamponunun sadece birkaç damla kaldığını görebilirsiniz ve DNA hala filtrede olmalıdır. İşte toplama mikrotüpleri. Bunları şeride göre etiketledim.

Şimdi araç vakumunu açıyorum ve toplama mikro tüpleriyle birlikte yeniden birleştiriyorum; kayışların mikro tüplerle eşleştiğinden emin oluyorum. Manifold şu an bu şekilde görünmelidir. İşte şeritlerden mikro tüplere DNA elüsyonu yapmak için hazırlanmış vakum manifoldunun görünümü.

Şerit üstte ve tüp hemen altında yer alır ve aynı şekilde etiketlenir. Şimdi vakum uygulamadan şeride steril su ekleyin ve bir dakika bekletin. Vakum süresi uzun olduğunda, görebileceğiniz üzere, su şeritten geçerek toplama mikrotüplerine girer.

Su, DNA'yı içermektedir. Tüm suyun toplandığından emin olmak için vakumu bir süre daha açık bırakıyorum. İşte işlemin ardından DNA çözeltisinin bulunduğu toplama mikrotüpleri.

Merhaba, size bakterilerden DNA saflaştırmak için kalsiyum mini prep kitinin nasıl kullanılacağını gösterdim. Şimdi, doğru klonları doğrulamak için ek parçayı diziledim ve bu yöntemi kullandığımı belirtmeliyim. DNA miktarı genellikle mikrogram düzeyindedir.

Deneylerinizde başarılar dileriz. İzlediğiniz için teşekkürler.