Name: Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Öğrenin, membran proteinlerini lipidik kübik faz (LCP) kullanarak kristallendirme yöntemini. Bu teknik, β2-adrenerjik reseptör gibi zor proteinlerde yüksek kaliteli kristaller elde etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe GM073197 ve RR025336 parçalar halinde finanse edildi.

Mezo kristalizasyon deneyde bir tipik bir anahat, Şekil 1'de 1,2 gösterilmiştir . Ön kristalleşme LCP sıkı bağlamak deneyleri isteğe bağlıdır, ancak, önemli ölçüde, özellikle zor zarı proteinleri 3 durumda, ilk kristalizasyon koşulları için arama sürecini hızlandırabilir . 1. LCP içinde Protein Sulandırma <ol><li> Bir deterjan solüsyona ilgi bir membran proteini arındırmak ve konsantre ~ 10 protein / deterjan kompleksleri - 20 mg / ml, aşırı-konsantre deterjan 1,4 bakım alarak. </li><li> Transfer ~ 25 mg bir LCP ana lipid (genellikle monoolein) veya 40 1.5 ml plastik tüp ve inkübe bir lipid karışımı ° C'de birkaç dakika lipid eriyene kadar. </li><li> 100 mcL gaz sıkı şırınga için bir şırınga coupler takın. </li><li> Ayarlanabilir bir hacimde pipet kullanarak erimiş lipid şırınga yükleyin. Şırınga içinde lipid hacmi kaydedin. </li><li> Bir protein çözüm-lipid oranı 2 / 3 v / protein solüsyonu ile başka bir 100 mcL şırınga Yük v. </li><li> Birlikte her iki şırınga şırınga coupler üzerinden bağlayın. </li><li> Şırınga, lipid mesophase homojen hale gelinceye kadar, ileri ve geri Kuplörün iç iğne ile lipid ve protein hareket dönüşümlü olarak pistonları itin. LCP mekanik karıştırma üzerine kendiliğinden formları ve protein LCP, çift katlı lipid sulandırılmış olur. LCP oluşumu, küçük açılı X-ışını kırınımı 1 ile çapraz polarize ile donatılmış bir mikroskop altında bakıldığında, eğer mümkünse, saydam ve jel gibi bir tutarlılık ve birefringency yokluğunda tarafından doğrulanmış, ya da olabilir. </li></ol> 2. LCP-sıkı bağlamak Ön kristalleşme Tahliller LCP-sıkı bağlamak testlerin tarama koşulları 3 çeşitli LCP sulandırılmış membran proteinlerinin difüzyon özelliklerini ölçmek için tasarlanmıştır. LCP zarı proteinleri uzun menzilli difüzyon başarılı kristalizasyon için gerekli, ancak LCP mikro büyük proteinler veya oligomerik protein agrega difüzyon kısıtlar. Mezo kristalizasyon deneyi bir başarısızlığı için ortak bir nedeni difüzyon kaybına yol açan hızlı bir protein agregasyonu. Bir protein toplama davranışı özellikle protein yapı, ev sahibi lipid ve tarama çözümü 3 bileşimi bağlı olduğu görülmüştür. <ol><li> Etiket, proteinin floresan boya ile (Cy3 veya benzeri) bir protein / boya ~ 100 / 1 oranında girmemiş boya kaldırmak ve ~ 1 mg / ml protein konsantresi. Etiket ya serbest aminler veya ücretsiz tiyoller. Ücretsiz aminler etiketleme, ağırlıklı olarak serbest N-terminalindeki etiket, 7 ve 7.5 arasında pH kullanın. Amino etiketleme lipidler co-saflaştırılmış protein 2,3 ile etiket farkında olun. </li><li> Sulandırın 1. bölümde açıklandığı gibi LCP etiketli protein). </li><li> Tahlil plakalar yerine kristalizasyon ekranlarında 2 LCP-sıkı bağlamak tarama çözümleri kullanarak) 3. bölümünde açıklandığı gibi ayarlayın. </li><li> 20 plakalar inkübe ° C denge durumuna ulaşmak için en az 12 saat süreyle karanlıkta. </li><li> 10x objektif kullanarak ilk LCP sıkı bağlamak istasyonu ve odak yerleştirin plakalar. </li><li> Ilk ön-ağartılmış durumunu yakalamak için 5 floresan görüntüler elde. </li><li> Lazer tetikler. Ağartılmış spot ortasında etiketli protein% 70 - çamaşır suyu ~ 30 bakliyat lazer gücü ve sayısı ayarlanabilir olmalıdır. </li><li> Lazer tetikleme hemen sonra, mümkün olan en hızlı hızı ~ 200 resimler hızlı bir post-beyazlatma dizisi kaydetmeye başlamak. </li><li> Protein difüzyon hızı bağlı olarak 1-20 sn gibi görüntüler arasında gecikme seçerek ~ 50 resimler, yavaş bir post-çamaşır suyu dizisi kaydı ile izleyin. </li><li> Tüm çerçeveler içinde çamaşır suyu nokta yoğunluğu içinde entegre ve lazer ağartılmış alanının dışında bir referans nokta ortalama yoğunluğu, ağartılmış nokta içinde yoğunluğu bölerek satın alma sırasında yoğunluk dalgalanmaları ağartma ve ışık için doğru. </li><li> 1'e eşit önceden ağartılmış yoğunluğu ve ilk ağartılmış yoğunluğu 0'a eşit yapmak için düzeltilmiş yoğunluk Normale. </li><li> Aşağıdaki denklem 5 kullanılarak normalize yoğunluğu vs zaman, F (t) eğrisi Fit: F (t) = M x exp (-2T / t) x (I 0 (2T / t) + 1 (2T / t)), (Eq.1) M difüzyon moleküllerin cep fraksiyonu, T karakteristik difüzyon süresi mi, 0 kaydedilen her karenin gerçek zamanlı ve ben 1 0. ve 1. sırası Modifiye Bessel fonksiyonları. </li><li> Difüzyon katsayısı, D gibi hesaplayın: D = R 2 / 4T (Eq.2) R ağartılmış spot yarıçapı. </li><li> T Taşıo 2.13) yanında iyi ve adımları tekrarlayın 2.5). </li><li> Farklı tarama koşulları için elde edilen mobil kesirler ve difüzyon katsayıları karşılaştırın. Tasarım yeni kristalizasyon protein difüzyon ve protein difüzyon görülmedi hangi hariç koşulları kolaylaştırılmış bileşenleri dayalı ekranlar. Protein ekranlı durumlardan herhangi diffüz olmadıysa, tarama alanı genişletilmesi veya yeni bir protein inşa çalışıyor düşünün. </li></ol> 3. LCP Kristalizasyon Denemeler Ayarlama <ol><li> LCP içinde sulandırın protein gibi) 1 bölümünde açıklanan. </li><li> Protein yüklü LCP tekrarlayan bir şırınga dağıtıcı bağlı bir gaz sızdırmaz 10 mcL şırınga içine aktarın. </li><li> 10 mcL şırınga, kısa bir çıkarılabilir iğne (gösterge 26, 10 mm uzunluk) takın. </li><li> 2x2 bir kare oluşturan bitişik dört kuyu yüzeyinde LCP 200 nL bolus koyun. </li><li> 1 mcL ilgili kristalizasyon ekran çözümü ile her LCP bolus Overlay. </li><li> Cap dört bir 18 mm kare cam lamel yüklü kuyu. Kuyu mühür lamel üzerine nazik bir basınç uygulayın. </li><li> 4 kuyu sonraki bütün plaka dolana kadar) 3.4) -3,6 adımları tekrarlayın. </li><li> Kristal oluşumu ve büyümesi için periyodik olarak kontrol, tabak sabit bir sıcaklıkta inkübe edin. </li></ol> 4. LCP gelen Kristaller Hasat <ol><li> Doğrusal bir döner polarize ve analiz ile donatılmış bir stereo mikroskop altında değişken zoom ile protein kristalleri ile bir tabak koyun. </li><li> Bütün iyi görüş alanı içinde yer almakta olup, böylece düşük güç zoom kullanırken ilgi iyi odaklanın. </li><li> Keskin bir köşe, seramik kılcal kesme taş kullanılarak iyi sınırları içinde bir kare dört vuruş lamel cam Puan. </li><li> Lamel cam kalınlığı boyunca çizikler yaymak için güçlü keskin nokta cımbız ile gol çevresinde basın. </li><li> Punch iki küçük delik attı kare ters köşe. </li><li> Yağışlı çözüm birkaç mcL sonraki adımları sırasında dehidrasyon azaltmak için bir delik aracılığıyla enjekte edilir. </li><li> Açılı keskin bir iğne probu kullanarak cut-out kare serbest bırakmak için bir ya da iki tarafı boyunca cam kırmak. </li><li> Kübik faz bolus cam kare izlenme dikkatlice yukarı doğru kaldırın. Bolus lamel sıkışmış ise, o kuyunun altındaki kare yer ve cam üzerine çevirin. </li><li> Yağışlı bir çözüm ekstra birkaç mcL ile desteklenmiş bir cryo-Koruyucu, gerekirse, kuyu maruz küp faz bolus üstüne. </li><li> Mikroskop büyütme artırın ve bir kristal odaklanmak. </li><li> Hasat döngüsü görmek için yeterli ışık tutarken, birefringent kristal ve arka plan arasındaki kontrastı arttırmak için polarize ve analizör arasındaki açıyı ayarlayın. </li><li> MiTeGen MicroMount kristal boyutu ile eşleşen bir çapa sahip bir seçin ve sonra MicroMount içine scooping LCP doğrudan kristal hasat. </li><li> Flash sıvı azot hasat kristal MicroMount dondurma, ve, X-ışını veri toplama 6 için sinkrotron kaynağı beamline gemi . </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Bir mühendislik insan beta-2 adrenerjik G protein kenetli reseptör (β 2 AR-T4L) bakülovirüs sf9 böcek hücreleri enfekte dodecylmaltoside (DDM) / 7 carazolol kısmi bir ters agonisti bağlı kolesteril hemisuccinate (CHS) deterjan solüsyonu saflaştırılmış ifade edildi. Protein Cy3 NHS ester ile etiketlenir ve LCP-sıkı bağlamak kristalleşme öncesi testleri (Şekil 2) kullanılmıştır. LCP-sıkı bağlamak testlerinin sonuçları seçilen çeşitli koşullar dayalı Kaba ızgara ekranları ilk kristal gibi vurur (Şekil 3). Yağışlı koşullarının daha fazla optimizasyon kırınım kalite kristalleri (Şekil 4) vermiştir. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 tipik bir LCP kristalizasyon deneyi Akış şeması. Gri kutular Adımlar mevcut protokoller açıklanan değildir. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 monoolein tabanlı LCP β 2 AR-T4L/carazolol LCP-sıkı bağlamak tahlil. A) LCP-sıkı bağlamak testinin sonuçları, 96 plaka her örnek sırayla ağartılmış ve 30 dakika inkübasyondan sonra floresan kurtarma ölçüldüğü, yüksek verimli otomatik modda. Her bir numune mobil bölümünü temsil edilen floresan kurtarma, 96 numuneler için çizilir. Tarama çözümleri iki farklı konsantrasyonda az 48 farklı tuzları ile birlikte 0,1 M Tris pH: 8,% 30 v / v PEG 400 içerir. B) birkaç temsilcisi Floresan kurtarma profilleriresentative koşulları. Düz çizgi eğrileri Denklem tarafından uyuyor temsil eder. 1. cep kesirler ve difüzyon katsayıları Denklem kullanılarak belirlenir. 1 ve 2. ,% 10 daha az Na klorür içeren örnek hızlı iyileşme co-saflaştırılmış protein ile floresan etiketli lipidler nedeniyle. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 β 2 AR-T4L/carazolol ilk kristal hit LCP-sıkı bağlamak tarafından belirlenen en umut verici koşulları etrafında, sülfat Na içeren bir kaba ızgara tarama ile elde edilen (panel) ve Na biçimleri (panel). Protein Cy3 NHS ester ile etiketlenir ve 605 nm eksitasyon ve 543 nm dalga boyunda emisyon kullanarak floresan görüntüler alınır. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. β 2 AR-T4L/carazolol Optimize edilmiş kristalleri. (Paneller A ve B), Na sülfat varlığı yetiştirilen kristalleri ve K biçimleri (panel C ve D) görüntüleri aydınlık modu (paneller A ve C) ve çapraz-polarize (paneller B ve D).

<ol><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LCP-FRAP+assay+for+pre-screening+membrane+proteins+for+in+meso+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cryst.+Growth+Design%22%5BJournal%5D)">LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization.</a> J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).</li>
<li>Misquitta, Y., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents+destabilize+the+cubic+phase+of+monoolein%3A+implications+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization.</a> Biophys. J. 79, 394-405 (2003).</li>
<li>Soumpasis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments.</a> Biophys. J. 41, 95-97 (1983).</li>
<li>Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centering+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+micrometer+size+X-ray+synchrotron+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam.</a> J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+inexpensive+nanoliter-volume+dispenser+for+highly+viscous+materials+used+in+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization.</a> J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+screens%3A+compatibility+with+the+lipidic+cubic+phase+for+in+meso+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins.</a> Biophys J. 81, 225-242 (2001).</li>
</ol>

Protokolleri mezo kristalizasyon deneyler yapılması dahil temel adımlar için bir temel görsel rehberlik sağlar. Derinliği olası tuzaklara vurgulayarak, bu protokoller ile ilgili detaylar daha fazlası, bazı eksiklikler veya başka alternatif güzergahlar 1,2 mevcuttur. İsteğe bağlı LCP-sıkı bağlamak testlerin en çok gelecek vaat eden bir protein yapısı, LCP ana lipid ve lipid katkı yanı sıra mümkün precipitants ve tampon koşulları 3 sınırlandırmayı seçmek için önceki aşamalarında yardımcı olabilir. Ilk kristalizasyon isabet sonra, daha kaliteli kristaller elde etmek için optimize edilmelidir. Mezo kristalizasyon koşullarının optimizasyonu LCP 1 bileşimi ile ilişkili ilave parametrelerin ilavesi ile çözünür proteinler için iyi duruma getirmek için temelde benzer. Lipidik mesophase yetiştirilen Membran protein kristalleri genellikle deterjan solüsyonu elde edilen kristaller daha küçüktür, ama daha modern bir sinkrotron kaynakları 6 mikro fokus kullanarak güçlü yararlanarak, böylece mevcut beamlines emretti. Kristalizasyon veya tahlil plakaları kurma LCP-sıkı bağlamak deneyleri yürüten ve kristaller tespit mezo kristalizasyon, ilgili prosedürlerin çoğu sağlayan, 1,2,8,9 yarı veya tam otomatik olan koşulları daha geniş bir yelpazede tarama protein ve lipid tüketen küçük miktarda. Öte yandan, LCP ve kristal hasat protein reconstitutions manuel ve sıkıcı işlemleri kalır ve böylece iyileştirilmesi için bir ihtiyaç var.

<table><tbody><tr><td>100 &amp;mu;L gaz sızdırmaz şırınga</td><td>Hamilton Co</td><td>7656-01</td><td>2 şırınga gereklidir</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L gaz sızdırmaz şırınga</td><td>Hamilton Co</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga bağlantı aparatı</td><td>Hamilton Co</td><td>7770-02 30902</td><td>Bağlantı aparatı, ref. 10'da açıklanan mevcut parçalar kullanılarak yapılabilir</td></tr><tr><td>Tekrarlı şırınga dağıtıcı</td><td>Hamilton Co</td><td>83700</td><td>Tekrarlı şırınga dağıtıcı, dağıtım hacmini yaklaşık 3 kat azaltacak şekilde modifiye edilebilir&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Kısa (0,375&amp;#8221;) düz uçlu çıkarılabilir iğne (uç stili 3, gauge 26)</td><td>Hamilton Co</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyucuklu cam sandviç plaka</td><td>Marienfeld</td><td>08 900 03</td><td>Manuel işlemler için, standart mikroskop cam lamları ve delikli çift taraflı bant kullanılarak cam sandviç plakanın monte edilmesi daha uygundur&lt;sup&gt;1,2,12&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Cam lamel</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63787-01</td><td></td></tr><tr><td>monoolein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7765</td><td></td></tr><tr><td>Kristalleşme tarama panelleri</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td><td></td><td>Mevcut ticari panellerin çoğu başlangıç taraması için kullanılabilir. LCP'yi sürekli olarak bozan koşullar, daha iyi uyumluluk için 2 kat seyreltilebilir&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Kılcal tüp kesme taşı</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-334</td><td></td></tr><tr><td>İnce uçlu cımbız</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>Açılı keskin prob</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13650</td><td></td></tr><tr><td>MicroMount'lar</td><td>MiTeGen</td><td>M1-Lxx-xx</td><td>Kristal boyutuna uygun MicroMount çapını seçiniz</td></tr></tbody></table>

lipidik mesophases membran proteinleri kristallendirilmesi

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Zar proteinleri, sinyal iletimi, ulaşım ve enerji dönüşümleri, gibi çok sayıda arıza ve hastalıkların karıştığı ile ilgili canlı hücreler kritik işlevleri yerine. Ancak, membran proteinlerinin yapısal ve işlevsel bir anlayış güçlü kırınım kaliteli kristaller çözünürleştirme ve üretim ile ilgili zorluklar nedeniyle, özellikle, kendi çözünür ortakları geride kalıyor. Lipidik mesophases Kristalizasyon (mezo ya da LCP kristalizasyon olarak da bilinir), mikrobiyal rhodopsins fotosentetik proteinler, dış membran beta varil ve G-protein-bağlı reseptörler yüksek çözünürlüklü yapılar elde etmek için başarıyla uygulanmıştır gelecek vaat eden bir tekniktir . Mezo olarak kristalizasyon anadili gibi bir membran çevre yararlanır ve genellikle düşük solvent içeriği ve deterjan geleneksel kristalizasyon ile karşılaştırıldığında daha iyi sipariş ile kristaller üretir. Bu yöntem zor değildir, ancak, viskoz mesophase malzeme taşıma lipid faz davranışları ve pratik bir anlayış gerektirir. Burada LCP yapma ve bir membran proteini kullanarak LCP, bir tahlil veya kristalizasyon plaka LCP nanoliter bölümlerini dağıtım, kristalleşme öncesi testlerin yürütülmesi ve kristaller hasat bir şırınga mikser, çift katlı lipid yeniden oluşturmak basit ve verimli bir şekilde göstermektedir LCP matris. Ancak, herhangi bir kristalizasyon deneyi, geniş tarama ve optimizasyon gibi gerekli ve başarılı bir sonuç mutlaka garanti değildir; Bu protokoller mezo kristalizasyon çalışmalarda yaklaşan için temel bir kılavuz sağlar.

Protokolleri LCP kristalizasyon denemeler ve hasat kristalleri kurma, LCP-sıkı bağlamak kristalleşme öncesi testlerin başlangıç ​​koşulları bulma lipidik kübik bir fazlı (LCP) protein, sulandırıldıktan itibaren bir membran proteini kırınım kaliteli kristaller elde etmek için gerekli adımları açıklar .

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membran proteinleri, canlı hücrelerde sinyal iletimi, taşıma ve enerji dönüşümleri ile ilgili kritik işlevler yürütür ve bu nedenle...

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, X-ışını kristalografisi ile yapı tayini yapılabilmesi için bir membran proteininin yüksek kaliteli kristallerini elde etmektir. Bu, proteinin bir lipid kübik faz membranına yeniden konfigüre edilmesi ve geniş bir kristalleşme alanı ile kristalleşme deneylerinden gelen sınırlı geri bildirim sayesinde kristal çekirdeklenmesini ve büyümesini tetikleyen bir çöktürücü çözelti ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. En gelecek vaat eden kristalleşme koşullarını seçmek amacıyla, lipid kübik faz fotobeyazlatma sonrası floresans geri kazanımı veya LCP Frap Prec kristalleşme analizi geliştirilmiştir.Bu analiz, tarama miktarını azaltır ve ilk kristalleşme sonuçlarını elde etme şansını artırır. İlk sonuçlar bulunduğunda, kristal büyümesini geliştirmek amacıyla optimizasyon denemeleri kurulur. Son olarak, optimize edilmiş kristaller toplanır ve sinkrotron kaynağında veri toplama işlemi için sıvı azot içerisinde dondurulur.Sonuçlar, LCP'de BE iki iki adrenerjik reseptörünün ilk kristallerini elde etmek için LCP FRA analizinin etkili kullanımını göstermektedir ve bunların daha ileri optimizasyonu difraksiyon kalitesinde kristallere yol açmıştır. Bu teknik, tekrarlayan kübik faz tarafından sağlanan doğal benzeri bir membran ortamından yararlanır ve genellikle kristalleştirme ve deterjan çözeltilerine kıyasla düşük çözme içeriğine ve daha iyi düzene sahip kristallerle sonuçlanır. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, lipid kütle fazlarının yüksek viskozitesi ve hidratasyon özellikleri nedeniyle bu malzemeleri işlemede zorluk yaşayacaklardır.Ancak, doğru araçlar kullanıldığında ve teknikte uzmanlaşıldığında, bu prosedür diğer herhangi bir protein kristalizasyon tekniğinden daha zor değildir; ayrıca otomasyona ve yüksek verimliliğe uygundur. Öyleyse başlayalım. İlgilenilen membran proteinini bir deterjan çözeltisi içinde saflaştırın ve protein deterjan komplekslerini yaklaşık 10 ila 20 mg/mL konsantrasyona getirin.Yaklaşık 25 mg LCP konak lipidi veya bir lipid karışımını plastik bir tüpe aktarın ve lipid eriyene kadar 40 °C'de birkaç dakika inkübe edin. Ardından, 100 µL'lik gaz sızdırmaz bir şırıngaya bir şırınga bağlantı parçası takın. Ayarlanabilir hacimli bir pipet kullanarak şırıngayı eritilmiş lipid ile doldurun.Şırıngadaki lipid hacmini kaydedin ve protein çözeltisi ile lipid hacim oranının ikiye üç olması için yeterli miktarda protein çözeltisiyle başka bir 100 microliter şırıngayı doldurun. Her iki şırıngayı şırınga bağlayıcısı aracılığıyla birbirine bağlayın. Lipid mezo fazı homojen hale gelene kadar, lipid ve proteini bağlayıcının iç iğnesi üzerinden ileri geri hareket ettirmek için şırınga pistonlarını sırayla itin.LCP, mekanik karıştırma ile kendiliğinden oluşur ve protein LCP'nin lipid çift tabakasına yeniden yerleşir. LCP oluşumu, şeffaf ve jel benzeri kıvamından ve çapraz polarizörlerle donatılmış bir mikroskop altında incelendiğinde çift kırılmanın olmamasından veya mümkünse küçük açılı x-ışını kırınımı kullanılarak doğrulanabilir. LCP FRAP analizlerine başlamak için, yazılı protokolde açıklandığı gibi proteini, yaklaşık 100'e bir protein-boya oranında floresan bir boya ile işaretleyin.Reaksiyona girmeyen boyayı uzaklaştırın ve proteini yaklaşık bir miligram/mililitre olacak şekilde konsantre edin. Ardından, işaretlenmiş proteini LCP içinde, işaretlenmemiş protein için uygulanan yöntemle yeniden çözün. Analiz plaklarını hazırlayın.LCP kaplama tarama çözümleri kullanarak. Öncelikle protein yüklü LCP'yi, tekrarlayan bir şırınga dağıtıcıya bağlı 10 µL sızdırmaz bir şırıngaya aktarın, ardından 10 µL'lik şırıngaya kısa ve çıkarılabilir bir iğne takın. Yan yana dört kuyucuğun yüzeyine 200 nL LCP bolusları dağıtarak ikiye iki bir kare oluşturun; her bir LCP bolusunun üzerine 1 µL ilgili LCP FRA tarama çözeltisi ekleyin.Tarama solüsyonu dağıtıldıktan sonra, yüklü dört kuyucuğun üzerini 18 milimetrelik kare bir cam lamel ile kapatın. Kuyucukların sızdırmazlığını sağlamak için lamel üzerine hafifçe bastırın. Tüm plaka dolana kadar bu işlemi bir sonraki dörtlü kuyucuk seti için tekrarlayın.Doldurulduktan sonra, plakayı folyo ile kapatın. Plakaları 20 °C'de en az 12 saat boyunca inkübe edin. Denge durumuna ulaşmak için plakalardan birini LCP Frap istasyonuna yerleştirin ve 10x objektif kullanarak ilk kuyucuğa odaklanın.FRAP veri toplama işlemi, kullanıcının önce tüm toplama parametrelerini girdiği ve ardından başlat düğmesine bastığı bir görüntü işleme betiği kullanılarak otomatik olarak gerçekleştirilir. Tipik bir toplama dizisi, beş adet ağartma öncesi görüntünün kaydedilmesiyle başlar; ardından, mümkün olan en hızlı hızda yaklaşık 200 görüntüden oluşan hızlı bir geri kazanım dizisinin akışıyla senkronize şekilde ağartma lazeri tetiklenir ve bunu, protein difüzyon hızına bağlı olarak görüntüler arasında bir ila 20 saniyelik aralıklarla 50 görüntüden oluşan yavaş bir geri kazanım dizisinin alınması izler. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, tüm karelerde ağartma noktasının içindeki yoğunluğu ve referans olarak lazerle ağartılmış alanın dışına yerleştirilen noktaların yoğunluğunu entegre ederek düzeltme yapın.Veri toplama sırasında ışık dalgalanmaları ve beyazlama (bleaching) nedeniyle oluşan sapmalar için entegre yoğunluk eğrisi, düzeltilmiş yoğunluğu, beyazlama öncesi yoğunluğu bir ve başlangıçtaki beyazlama yoğunluğunu sıfır yapacak şekilde normalize eder; mobil fraksiyonu ve difüzyon katsayısını elde etmek için normalize edilmiş yoğunluğun zamana karşı eğrisi, yazılı protokolde açıklandığı şekilde uydurulur. Bu işlemi sonraki için tekrarlayın; ardından farklı tarama koşulları için elde edilen mobil fraksiyonları ve difüzyon katsayılarını karşılaştırın. LCP kristalleşme denemeleri kurmak için, protein difüzyonunu kolaylaştıran bileşenlere dayalı ve protein difüzyonunun gözlemlenmediği koşulları hariç tutan yeni kristalleşme taramaları tasarlayın.Proteini daha önce olduğu gibi LCP içinde yeniden yapılandırın, ardından LCP frap için yapıldığı gibi kristalizasyon plakalarını hazırlayın, ancak kristalizasyon tarama çözeltilerini kullanın. Alternatif olarak, kristalizasyon plakaları hazırlandıktan sonra kristalizasyon denemeleri robotik olarak kurulabilir; bunları sabit bir sıcaklıkta inkübe ederek periyodik olarak kristal oluşumunu ve büyümesini kontrol edin. Protein kristalleri büyüdüğünde, kristallerin bulunduğu plakayı lineer döner polarizatör ve analizör ile donatılmış değişken zoomlu bir stereo mikroskobun altına yerleştirin.Düşük güçte bir zoom kullanarak, tüm kuyucuğun görüş alanı içine yerleşmesini sağlayacak şekilde ilgili kuyucuğa odaklanın. Seramik bir kapiler kesme taşının keskin köşesini kullanarak, kuyucuk sınırları içerisinde bir kare oluşturacak şekilde lamel camını dört darbeyle çizin. Çizikleri lamelin kalınlığı boyunca yaymak için, çizilen çevre boyunca güçlü ve sivri uçlu cımbızlarla bastırın.Çizilmiş karenin karşılıklı köşelerine cam delgeç ile iki küçük delik açın. Sonraki adımlarda dehidrasyonu azaltmak için deliklerden birinden birkaç mikrolitre çöktürücü çözelti enjekte edin. Açılı, keskin bir iğne prob kullanarak, kesilmiş kareyi serbest bırakmak için camı bir veya iki kenarı boyunca kırın.Kübik faz bolusuna dikkat ederek cam kareyi dikkatlice kaldırın. Gerekiyorsa, kuyucuktaki açıkta kalan kübik faz bolusunun üzerine kriyoprotektan ile desteklenmiş birkaç mikrolitre ek çöktürücü çözelti ekleyin, mikroskobun büyütmesini artırın ve bir kristale odaklanın. Toplama loop'unu görecek kadar ışığı korurken, kristal ile arka plan arasındaki kontrastı artırmak için polarizatör ve analizör arasındaki açıyı ayarlayın.Ardından fazla lipidi uzaklaştırın ve kristali, kristal boyutuna uygun çapta seçilmiş bir mighty gen micro mount içerisine alarak doğrudan LCP'den toplayın. Hasat edilen kristalli micro mount'u sıvı azot ile dondurun ve x-ışını veri toplama işlemi için bir senkrotron kaynağı beamline'ına gönderin. Mühendislik ürünü beta iki adrenerjik reseptör, S SI üç NHS ester ile işaretlenmiş ve her bir 96 kuyucuklu plaka örneğinin sırayla beyazlatıldığı ve 30 dakikalık inkübasyon sonrası floresans geri kazanımının ölçüldüğü otomatik yüksek verimli moddaki LCP Frep prec kristalleşme deneylerinde kullanılmıştır. Her bir örnekteki mobil fraksiyonu temsil eden elde edilmiş floresans geri kazanımları, tüm 96 örnek için grafiğe dökülmüştür.Tarama çözeltileri, iki farklı konsantrasyonda 48 farklı tuz ile kombine edilmiş, 0.1 molar tris pH sekiz %30 hacimce hacim PEG 400 içerir. Birkaç temsili durum için floresan geri kazanım profilleri gösterilmiştir. Düz çizgi eğrileri, normalize edilmiş yoğunluğun zamana karşı uyumlarını temsil etmektedir; sodyum klorür içeren örnekteki %10'dan düşük hızlı geri kazanım, floresanla işaretlenmiş lipidlerden kaynaklanmaktadır.Protein ile birlikte saflaştırılan olol ile kompleks halindeki beta iki adrenerjik reseptörün ilk kristal bulguları, sodyum sülfat ve sodyum format içeren LCP Frap ile belirlenen en gelecek vadeden koşullar etrafında kaba ızgara taraması yapılarak elde edilmiştir. Çöktürücü koşullarının daha ileri optimizasyonu, difraksiyon kalitesinde kristaller sağlamıştır. Burada, sodyum sülfat ve potasyum format varlığında büyütülen kristallerin görüntüleri parlak alan modunda alınmıştır.Aynı kristaller çapraz polarize ediciler kullanılarak da görüntülenebilir. Proteinlerin lipid kübik fazlarda rekonstitüsyonu tekniği kavrandıktan sonra 10 ila 15 dakika içinde tamamlanabilir ve 96 kuyucuklu bir kristalizasyon plağının manuel kurulumu bir saat içinde gerçekleştirilebilir. Yüksek moddaki L three B wrap analizi, 96 kuyucuklu plaka başına yaklaşık iki saat sürerken, H kristali kuyucuk başına yaklaşık 10 ila 20 dakika alır. Bu videoda gösterilen prosedürler, müz kristalizasyon denemelerine yaklaşım için temel bir kılavuz sunmaktadır.Ancak, tüm kristalizasyon deneylerinde olduğu gibi, kapsamlı bir tarama ve optimizasyon gereklidir ve başarılı bir sonuç her zaman garanti edilemez.

crystallization-of-membrane-proteins-in-lipidic-mesophases

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Elektron kristalografisi sipariş membran protein dizileri oluşumu için iki boyutlu (2D) kristalizasyon çalışmalarda değerlendirilmesi son derece kritik ve zor bir iştir. 90kDa - Burada tarama ve 15 aralığında ağırlıklı olarak küçük membran proteinlerinin 2D kristalleri tespit yaklaşım tarif.

Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Bicelles, bir çift katlı lipid içinde membran proteinleri (MP) korumak değil, kristalizasyon, robotlar tarafından yüksek verimlilik tarama kolaylaştıran benzersiz faz davranışları lipid / amphiphile karışımları. Bu teknik hem prokaryotik ve ökaryotik kaynaklardan başarıyla yüksek çözünürlüklü yapıların bir dizi üretti. Bu video lipidik bicelle karışımı üretmek için orta crystallizations çalışmalar (manuel olarak robot gibi) ve hasat kristalleri kurma, bicelle karışımı içine milletvekilleri...

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik mesophases içinde zar proteinlerinin yüksek verimli kristalleşme için bir robot bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yöntemine ayrılmaz viskoz ve yapışkan protein yüklü Mezofaz taşıma kapasitesine sahip üç robotlar tanıtıldı.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik kübik ve sünger aşamalarında büyüdü hasat ve kriyo-serin membran proteini kristaller Yapısal ve İşlevsel Biyoloji Grup Caffrey Membran uygulanan prosedürler açıklanmıştır.

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

X-ışını serbest elektron lazerlerinde ve senkrotron kaynaklarında seri kristalografi için lipidik kübik fazda membran protein mikro kristallerinin hazırlanması ve verilmesi için prosedürleri açıklıyoruz. Bu protokoller aynı zamanda çözünür protein mikro kristallerinin dahil edilmesi ve verilmesi için de uygulanabilir, bu da sıvı enjeksiyona kıyasla numune tüketiminin önemli ölçüde azalmasına yol açar.

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Lipid monolayerler, on yıllardır yapısal çalışmalar için iki boyutlu (2D) protein kristalleri oluşturmak için bir temel olarak kullanılmaktadır. Hava-su arayüzünde stabildirler ve elektron görüntüleme için ince bir destekleyici malzeme olarak hizmet verebilirler. Burada lipid monolayerlerinin biyolojik çalışmalara hazırlanması konusunda kanıtlanmış adımları sunuyoruz.

Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama

Bu protokol, sterol taşıyıcı ABCG5/G8'in kristalizasyonu için bir kurulumu açıklar. ABCG5/G8, asılı damla kristalizasyonu için iki seliler halinde yeniden oluşturulur. Protokol, özel malzemeler veya substratlar gerektirmez, bu da X-ışını kristalografisi yoluyla protein yapısını belirlemek için herhangi bir laboratuvarda erişilebilir ve uyarlanmasını kolaylaştırır.

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

Biz tek hücreleri üzerinde floresan kullanarak yapı değişiklikleri siteye özgü analizi ile birlikte membran proteinlerinin iyon taşıma kinetiği ölçen bir yöntem anlatacağım. Bu teknik, iyon kanalları ve iyon pompaları uyarlanabilir ve protein altbirimden arasındaki mesafe sınırlamaları belirlemek için kullanılabilir.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Öğrenin, membran proteinlerini lipidik kübik faz (LCP) kullanarak kristallendirme yöntemini. Bu teknik, β2-adrenerjik reseptör gibi zor proteinlerde yüksek kaliteli kristaller elde etmeyi sağlar.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Daha fazla video keşfet