Name: Nöronlar Aksonal Geliştirme Kontrol Mekanik Manipülasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Keşfedin nöronlarda aksonal gelişimi mekanik manipülasyon ve kalibre cam iğnelerle mikrodin kuvvet ölçümü kullanarak. Bu yöntem büyüme konilerini çekerek akson uzamasını ve biyofiziksel dinamikleri araştırmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu metodolojinin geliştirilmesi Dr. Robert E. Buxbaum önemli katkılar minnetle kabul etmiş sayılırsınız.

<ol><li>Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+growth+cone+adhesion+to+culture+surfaces+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation.</a> J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).</li>
<li>Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+neurite+outgrowth+from+chick+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons.</a> J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeidemann%2C+SR+%22The+Neuron+in+Tissue+Culture%22">The Neuron in Tissue Culture</a>. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).</li>
<li>Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+is+required+for+growth+cone+function+but+not+neurite+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac is required for growth cone function but not neurite assembly.</a> J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+mechanical+behaviors+of+the+cytoskeleton+in+living+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts.</a> J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).</li>
<li>Yoneda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Exerted+by+a+Single+Cilium+of+Mytilus-Edulis+.1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1.</a> Journal of Experimental Biology. 37, (1960).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Tension+Produced+by+Nerve-Cells+in+Tissue-Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture.</a> Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Fass, J. N., Odde, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+force-dependent+neurite+elicitation+via+anti-beta1+integrin+antibody-coated+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads.</a> Biophys J. 85, 623-636 (2003).</li>
<li>Yang, S., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Force+Sensors+and+Their+Applications+in+the+Study+of+Cell+Mechanical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mech%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response.</a> Exp Mech. 49, 135-151 (2009).</li>
<li>Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag+Force+as+a+Tool+to+Test+the+Active+Mechanical+Response+of+PC12+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites.</a> Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+growth+cones+pull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that growth cones pull.</a> Nature. 340, 159-162 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+and+production+of+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior and production of traction force.</a> J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-dish+incubator+for+live+cell+imaging+with+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope.</a> Biotechniques. 35, 708-708 (2003).</li>
</ol>

Hücresel güçleri uygulamak ve ölçmek için Teknikleri, uzun bir geçmişi 9 var . Bizim yöntemi başlangıçta motorlu hidrolik cihaz 10 ile sabit bir oranda &#39;çekici&#39; nöron bizimkine benzer cam iğneler kullanılır Dennis Bray, çalışmalarını motive oldu. Step motorlar 11, manyetik boncuk 12, microfabricated kirişler 13 ve akışkanlar 14: dahil hücreleri kuvvetleri uygulayarak birçok alternatif imkan vardır. Hücresel prob sonuçta bilinen sertlik bending bea...

<table><tbody><tr><td>R-6 kılcal tüp</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3111</td><td>R-6 cam dış çap 0.9mm, iç çap 0.6 mm, 8&quot;</td></tr><tr><td>BB-CH çekici (puller)</td><td>Mecanex S.A., Cenevre, İsviçre</td><td>BB-CH puller</td><td>CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 değerlerinde Mod 4 Alt kullanın</td></tr><tr><td>0.001&quot; Chromel tel</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCH-001-50</td><td>kılıfsız, termokupl teli, 50ft makara, şu an Chromega olarak adlandırılmaktadır</td></tr><tr><td>0.003&quot; Constantan tel</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCI-003-50</td><td>kılıfsız, termokupl teli, 50 ft makara</td></tr><tr><td>ince pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dumont Inox #5</td></tr><tr><td>üniversal mikroskop kol standı</td><td>Nikon Instruments</td><td>76135 veya 90430</td><td>çoğu marka veya tipteki kol standı bu kullanım için uygundur</td></tr><tr><td>mekanik mikromanipülatör</td><td>Narishige International</td><td>M-152</td><td>üç eksenli doğrudan tahrikli kaba mikromanipülatör</td></tr><tr><td>hidrolik mikromanipülatör</td><td>Narishige International</td><td>MO-203</td><td>şu an MMO-203 olarak mevcuttur, üç hareketli eksen tipi</td></tr><tr><td>iğne tutucu</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520145</td><td>3'lü set</td></tr><tr><td>tekli enstrüman tutucu</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520142</td><td></td></tr><tr><td>çiftli enstrüman tutucu</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520143</td><td></td></tr><tr><td>mekanik mikromanipülatör</td><td>Leica Microsystems</td><td>39430001</td><td>direk montajlı, 1 prob tutucu, RH Model 430001</td></tr><tr><td>joystick mekanik mikromanipülatör</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520137</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>evirtilmiş mikroskop</td></tr><tr><td>Vibraplane izolasyon masası</td><td>Kinetic Systems</td><td>1200 serisi</td><td>bizimki model 1201-02-12'dir</td></tr><tr><td>Ringcubator</td><td>Ev yapımı (bakınız referans 19)</td><td></td><td>referans 19, aşağıda listelenen güncellenmiş kontrol cihazını gerektirir</td></tr><tr><td>programlanabilir sıcaklık kontrol cihazı</td><td>Instrumart.com</td><td>Fuji Electric PXR3</td><td>emekli olan PXV3 sıcaklık kontrol cihazının yerine geçer</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>evirtilmiş mikroskop, yaklaşık 1980</td></tr><tr><td>Nikon SMZ-10 binoküler diseksiyon mikroskobu</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>diğer diseksiyon mikroskopları da uygun olacaktır</td></tr></tbody></table>

nöronlar aksonal geliştirme kontrol mekanik manipülasyon

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Nöron aksonları Hücre ve uzatma manipülasyonlar, mikro-fiberler 10-1000 μdyne aralığı 1,2 güçlerini ölçme ve uygulama yeteneğine sahip kalibre cam ile yapılabilir . Force ölçümler doğrudan ve deneysel yöntem 3 kalibre cam iğneler, bükme Hookean gözlem yoluyla elde edilir. Imalatı, kalibrasyon, tedavi, ve hücreler üzerinde iğneler kullanarak için donatım gereksinimleri ve prosedürleri tam olarak açıklanmıştır. Kuvvet, bu tekniklerin, metodoloji esneklik göstermek uygulanan ve gelecekteki çalışmalar için 4-6 örnek olarak verilmiştir hangi daha önce kullanılan ve farklı hücre tipleri rejimleri. Teknik avantajları manipülasyonlar tarafından üretilen güçlerin sürekli &#39;görselleştirme ve hücresel olayların çeşitli doğrudan müdahale etme yeteneği vardır. Dekolmanı ve yanı sıra, herhangi bir tür kültür hücre 8 mekanik ölçümler Bu doğrudan uyarılması ve aksonal büyüme ve retraksiyon 7 düzenlenmesi .

2000-1000 microdyne aralığında nöronların kuvvet uygulanması ve doğrudan ölçümler kalibre cam iğneler kullanılarak yüksek hassasiyet ile elde edilir. Bu metodoloji aksonal başlatılması, aksonal gerginlik, aksonal uzama hızı, ve kuvvet vektörleri aksonal geliştirme de dahil olmak üzere çeşitli yönleri, kontrol etmek ve ölçmek için kullanılabilir.

Nöronlar Aksonal Geliştirme Kontrol Mekanik Manipülasyon

Hücre manipülasyonları ve nöronal aksonların uzatılması, ...'daki kuvvetleri ölçebilen ve uygulayabilen kalibre edilmiş cam mikro-fiberlerle gerçekleştirilebilir.

Bu deneyin amacı, kuvvetleri hassas bir şekilde ölçerek bir aksonu uzatmaktır. Bu işlem, doğrudan kalibre edilmiş bir tel referans iğnesi hazırlanarak gerçekleştirilir; tel referans iğnesi kalibrasyonunun ardından istenen kuvvet aralığında kalibre edilmiş, ara ve çalışma iğneleri hazırlanır. Ardından, bir aksonu uzatmak amacıyla çalışma iğnesi ile büyüme konileri çekilir.Ortaya çıkan aksonal uzama kaydedilir ve kalibre edilmiş iğnenin bükülmesine dayanarak kuvvetler ölçülür. Bu yöntem, akson uzamasının biyofiziği hakkındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu prosedüre, yaklaşık dört milimetre uzunluğunda konik uçlu iğneler üretmek için ayarlanabilir bir mikroiğne çekici ve cam kılcal tüpler kullanarak başlayın.İğneleri kapaklı 160 mm'lik bir Petri kabında saklayın. Ardından, ucu kırılmış bir cam iğnenin içerisinden 0.001 inçlik bir kromal tel geçirerek bir kalibrasyon iğnesi hazırlayın. Teli uçtan 26 mm uzunluğunda dışarı çekin ve hızlı yapıştırıcı ile sabitleyin.Telin distal bir milimetresini bükerek bir kanca oluşturun. Ardından, 0,003 inç kalınlığında sabit telden bir metre kullanılarak mikro ağırlıklar hazırlanır. Teli ölçmek için bir metre cetveline bantlayın.Mümkün olduğunca düz hale getirmeye yardımcı olmak için. Bir metrelik teli tartın ve hassas bir şekilde bir santimetrelik parçalar halinde kesin. Telin birkaç parçasını vazo şeklinde bükün.Tel iğnelerin kalibre edilmesi, ölçüm dikeyine ve bir mikro manipülatöre sahip bir diseksiyon mikroskobu gerektirir. Mikroskop, yan tarafına doğru 90 derece eğilir. Tel iğnenin aşağı doğru sapmasının gözlemlenebilmesi için evrensel bir bom standı kullanılır.Tel iğneyi, mikroskobun optik eksenine dik olacak şekilde bir mikro manipülatör üzerindeki alet tutucuya yerleştirin. Tel iğnenin kancasını radyal bir işaretle hizalayın. Bir santimetrelik mikro ağırlığı kancaya asın ve sapmayı kaydedin.Referans telinin bükülme sabiti, mikro ağırlığın kütlesinin gözlemlenen sapmaya bölünmesine eşittir. Kalibrasyondan sonra, ara cam iğneleri kalibre etmek için jiletle işaret noktasındaki kancayı keserek iğneyi bir sonraki adım için hazırlayın. Oküler redle sistemine sahip bir ters mikroskop gereklidir.Mikroskop tablasının bir tarafında, tel iğneyi tutmak için kullanılan mekanik bir mikro manipülatör bulunur. Diğer tarafta ise ara cam iğneyi hareket ettirmek için kullanılan hidrolik bir mikro manipülatör yer alır; mikro manipülatörler kullanılarak kalibre edildikten sonra, 10x büyütmedeki optik alanın merkezinde, su içeren 160 milimetreye 30 milimetrelik bir Petri kabı içerisinde her iki iğneyi 45 derecelik bir açıyla bir araya getirin. Ardından, bu sapmaların her biri için bir dizi sapma işlemi gerçekleştirin.Cam iğnenin serbest bırakılmadan önceki başlangıç sapma miktarıyla, serbest bırakıldıktan sonraki nihai sıfır yük konumunu kaydedin. Bu işlem 10 çift veri noktası oluşturur. 10 veri çiftini lineer regresyona hazırlamak için, başlangıç sapma miktarı kaydedilen çiftlerin ikinci sayısından çıkarılır.Sıfır kuvvetindeki sıfır sapma noktasında lineer regresyonu sabitlemek için, 10 deneysel veri çiftine beş adet sıfır-sıfır kontrol çifti ekleyin. Bu 15 veri çifti ile lineer regresyonu hesaplayın.Ara cam iğnenin yay sabiti, tel iğnelerin bilinen bükülme sabitinin regresyon doğrusunun eğimine bölünmesine eşittir. Ardından, çalışma cam iğnelerini az önce açıklandığı gibi ara cam iğneye göre kalibre edin. Mikrometre başına iki mikrondan daha düşük olan cam iğneler, uygun bir sertlik aralığına getirmek için hafifçe kısaltılabilir.Kaplama yapılacak iğneleri, 10 mililitrelik tutunma faktörü çözeltisi beheri üzerinde tutulan bir kil kütlesinin yan tarafına, sadece iğne ucunun sırayla çözeltiye gireceği şekilde bastırın. İğneleri 30 dakika boyunca %0,1 polilizin çözeltisine daldırın. Ardından, iğneler tutunma faktörleri ile işlenirken, iğneleri 30 dakika boyunca conval ve a içine daldırın.İnkübatörü veya mikroskop tablası ısıtma sistemini açın. Böylece tabla termal dengeye ulaşacaktır. Titreşim izolasyon masası üzerindeki çekme iş istasyonu, çift alet tutucunun yerleştirildiği, karşı dengelenmiş özel bir uzantıyı tutan hidrolik bir manipülatörle donatılmış ters bir mikroskoptan oluşur.Kalibre edilmemiş bir referans iğneyi, mümkün olduğunca uzun çıkacak şekilde bir iğne tutucuya yerleştirin. Bu düzeneği çiftli alet tutucunun sağ tarafına yerleştirin. Ardından, işlem görmüş çalışma iğnesini, referans iğnenin yarı yarıya kadar çıkacak şekilde bir iğne tutucuya yerleştirin ve bunu çiftli alet tutucunun sol tarafına koyun.Hidrolik mikromanipülatörü, dikey kontrol tamamen yukarıda olacak şekilde önceden ayarlayın. Ardından, yanlara ayar vidasını kullanarak iki iğne ucunu birbirine yaklaştırın. İğneyi konumlandırın.Uçların hizalanması için çifti yandan gözle inceleyin ve uçları aynı düzleme getirmek için sağ taraftaki yukarı-aşağı vidasını kullanın. Alet tutucuyu döndürün ve iğne uçlarını medyanın yüzeyinin üzerindeki ışık yoluna yerleştirin. Bunları dik bir açıyla aşağıya doğru yönlendirin.Tabandaki mafsal vidasını sıkın. 10 x objektif ile bakarak, odağın altındaki hücrelerin üzerine, yukarıya odaklayın. İğne uçlarını mikroskobun görüş alanında bulmak için iğneleri medyumun içine indirin.Kültür kabının çok derinlerine indirmeden önce, iğneyi yanlara doğru ileri veya geri hareket ettirerek gölgesini arayın. Bir iğne görüş alanına girdiğinde, hangi iğnenin bulunduğunu belirlemek için yan ayar vidasını çevirin.Vida ile birlikte hareket ediyorsa, bu referans iğnedir. Hareket etmiyorsa, kalibre edilmiş iğnedir. Her iki iğne de belirlendiğinde, onları hizalamak için çift takımlı tutucunun ince ayar kontrollerini kullanın.Amaç, iğne uçlarının yaklaşık 50 micrometers aralıkta veya monitörde yaklaşık bir inç mesafede olmasıdır. Referans, kültür kabının daha yukarısında olmalı ve bu nedenle odağın biraz dışında kalmalıdır. Çekme iğnesi kap üzerinde odaklandığında, bu nihai ayarlanmış konumun görüntüsünü kaydedin.İğnelerin birbirinden ayrıldığı nokta, sıfır referans mesafesidir. İğneleri numune düzleminin üzerine kaldırın ve görüş alanının kenarına park edin. Yazılı protokoldeki kılavuzları kullanarak deneysel bir akson seçin.İğneleri aksonun büyüme konisine yaklaştırın ve sıfır mesafesini tekrar kaydedin. Ardından, bir büyüme konisini iğne üzerine yerleştirmek için titreşim izolasyon masasını hava ile kaldırın. Çekme iğnesini büyüme konisinin yanına, altına gelecek şekilde yerleştirin ve ardından iğneyi kap tabanına doğru indirin.Bu işlem, iğnenin yukarı doğru sapmasına, bükülerek kap boyunca büyüme konisine doğru kaymasına ve ardından büyüme konisini yerinden çıkarıp yukarı doğru hareket ettirmesine neden olacaktır. İğneyi, büyüme konisi iğne ucuna takılacak kadar, ancak iğnenin üzerinden kayıp geriye doğru gitmeyeceği kadar kap tabanına bastırın. Tutunmanın gerçekleşmesi için 20 dakika bekleyin.Büyüme konisi iğne üzerindeyken, iğneyi sağa doğru hareket ettirerek üzerine hafif bir gerginlik uygulayın ve iğneyi hafifçe kaldırırken, iğnenin aşağı yönlü hareketini iğneyi biraz ileri hareket ettirerek dengeleyin. Bağlı uzantı, iğneden dik bir şekilde ve kabın yüzeyinin üzerinde uzanana kadar iğneyi aşamalı olarak kaldırın. Çekme işlemi, iğnelerin hücre gövdesinden uzaklaştırılmasıyla gerçekleştirilir.Gerginlik kademeli olarak artırılırken, kuvvetler iğneler arasında artan bir boşluk olarak gözlemlenir. Büyüme konisinin iğneden ayrıldığına dair herhangi bir belirti olup olmadığı dikkatle izlenir. Buharlaşmayı dengelemek için saat başı su ekleyerek kaptaki ortam seviyesi korunur.Kabın kenarındaki bir işareti başlangıç derinliğini belirtmek için kullanarak, pipetinizle yavaşça suyu, deney sonunda iğnelerden uzak olacak şekilde kabın kenarından ekleyin. İğneleri kaptan çıkarmadan önce sıfır mesafesini tekrar kontrol edin. Ekrandaki yatay eksen boyunca iğnelerin konumlarını okuyun.Ayrıca hücre gövdesinin konumunu ve iğnelerin ayrılma mesafesinden yüksüz sıfır mesafesinin çıkarılıp iğnenin eğilme sabitiyle çarpımının, uygulanan kuvvet mikronuna eşit olduğu zamanları kaydedin. Gösterilmiştir. Burada, aksonal gelişimi kontrol etmek için birkaç olası seçeneğin bulunduğu örnek bir hücre alanı yer almaktadır. Büyük bir büyüme konisine sahip yatay akson iyi bir seçimdir.Hücre gövdesi ekranın kenarına yakın bir konuma yerleştirilir ve iğneler büyüme konisine yaklaştırılır. Yükleme yapılmamış iğne açıklığının bir görüntüsü alınır; bu mesafe sıfır noktası olarak kabul edilir. Deney başlamadan önce, spontan bir tutunma sağlanıp sağlanamadığını görmek için çekme iğnesi büyüme konisine yaslanır.Ardından iğne, büyüme konisinin içine biraz daha itilir. İğnenin çanak tabanına doğru indirilmesiyle gerçekleştirilen yukarı itme manevrası, iğnenin bükülmesini ve büyüme konisinin içine kayarak onu yerinden çıkarmasını sağlar. Ayrıca küçük bir miktarda ileriye doğru gerilme eklenmiştir.15 dakika sonra, aksonun iğnenin ileri hareketiyle birlikte uzadığı görülür. Ardından, çekme iğnesine daha fazla gerginlik uygulanır ve iğnenin kaldırılma işlemine başlanır. İğneler arasındaki artan mesafe ile gösterilen ek gerginlik uygulanır.Bu noktada, akson belirgin bir şekilde uzamaktadır. Referans iğnesi ileriye doğru hareket etmemiştir ancak akson ona doğru büyüyerek gerginliği azaltmıştır. Ayrıca, iğneler hafifçe yukarı kaldırılmıştır.Burada, çekme iğnesine daha fazla gerginlik eklenir. Bükülmüş çekme iğnesine uygulanan gerginliğe yanıt olarak belirgin bir büyüme gerçekleşmiştir. Deneyin sonunda, son bir sıfır kontrolü gerçekleştirilir.Tüm süreç, bu hızlandırılmış çekim sekansında gösterilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra; iğnelerin nasıl kalibre edileceği, büyüme konisinin bir iğne üzerine nasıl manipüle edileceği ve bir akson uzatılırken kuvvetlerin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

mechanical-manipulation-of-neurons-to-control-axonal-development

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Akson streç büyüme yansıtan benzersiz bir doku mühendisliği yöntemiyle kültürünün çok sayıda sinir lifleri uzatmak için geliştirilmiştir; sinirleri büyütme vücudun büyüme ile birlikte uzatmak sayede sinir sistemi gelişimine bir form.

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

Nöronal morfogenezine ve göç doğru beyin gelişimi altında yatan çok önemli olaylardır. Burada, genetik olarak kültürlenmiş nöronlar ve serebellar granül morfolojisi ve nöronların göç özelliklerinin değerlendirilmesi için gelişmekte olan beyincik işlemek için yöntemleri tarif eder.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Lazer nanodissection bağlanmış iki foton görüntüleme, hücre içi çözünürlük ile merkezi sinir sisteminin dejeneratif ve rejeneratif işlemlerini incelemek için yararlı araçlardır. Bu protokol, etiket görüntü ve in vivo serebellar korteks bir tırmanma lifleri incelemek için gösterilmiştir.

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Işık mikroskobu teknikleri, biyokimyasal tahlillerle birleştiğinde, netrin bağımlı akson dallanmasında SNARE aracılı ekzositozun katılımını aydınlatmaktadır. Bu tekniklerin kombinasyonu, akson dallanmasını ve hücre şekli değişikliğini kontrol eden moleküler mekanizmaların tanımlanmasına izin verir.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

Bu protokol, sıçanlardan izole edilen dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının izolasyonunu ve akson hizalamasını geliştirmek için statik önceden gerilmiş bir hücre kültürü sistemi üzerinde DRG nöronlarının kültürünü ve ardından miyelinasyonu teşvik etmek için Schwann Hücrelerinin (SC'ler) ko-kültürünü tanımlar.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Bu el yazması, mikro-doku ile tasarlanmış sinir ağlarının imalatını ayrıntılarıyla anlatmaktadır: boru biçiminde bir hidrojel içine konan agrega nöronal popülasyon (lar) yı kapsayan uzunlamasına hizalanmış aksonal yollardan oluşan üç boyutlu mikron boyutlu yapılar. Bu canlı iskele, sinirsel devreleri yeniden yapılandırmak veya modüle etmek için fonksiyonel röleler veya gri-beyaz madde nöroanatomisini taklit eden biyofiziksel test yatakları olarak işlev görebilir.

Sinir Sistemi Yeniden Yapılanma, Modülasyon ve Modelleme için Anatomik olarak İlham Almış Üç Boyutlu Mikro-Dokulu Mühendisli Sinir Ağları

Bu prosedür, nevrit uzamasını yönlendiren mikropipetlere sabitlenmiş poli-D-lizin kaplı boncuklar kullanarak mikroakışkan odacıklar içerisinde düzenlenen nöritlerin hızla nasıl başlatılacağını, genişletileceğini ve bağlanacağını açıklamaktadır.

Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

Nörit büyüme testleri, rejeneratif nöronal süreçler hakkında nicel bir değer sağlar. Bu yarı otomatik yazılımın avantajı, bir maske oluşturarak hücre gövdelerini ve nöritleri ayrı ayrı bölümlere ayırması ve nörit uzunluğu, dal noktası sayısı, hücre-gövde küme alanı ve hücre kümesi sayısı gibi çeşitli parametreleri ölçmesidir.

Nörit büyüme ölçümü için yeni bir yarı otomatik yazılımın standardizasyonu 

Bu protokol, aksonal yaralanma sonrası nöronal metabolik dinamikleri modelleyen, görüntüleme, çoklu omik analiz ve içsel metabolik yeniden şekillenmenin mekanik çalışmalarını mümkün kılan bir mikroakışkan sistemi tanımlar.

Aksonal Yaralanma Modelleri Yapımı ve Çoklu Omik Analizin Etkinleştirilmesi için Mikroakışkan Çip

Keşfedin nöronlarda aksonal gelişimi mekanik manipülasyon ve kalibre cam iğnelerle mikrodin kuvvet ölçümü kullanarak. Bu yöntem büyüme konilerini çekerek akson uzamasını ve biyofiziksel dinamikleri araştırmanıza olanak tanır.

Nöronlar Aksonal Geliştirme Kontrol Mekanik Manipülasyon

Daha fazla video keşfet