Nöronlar Aksonal Geliştirme Kontrol Mekanik Manipülasyon

Bu deneyin amacı, kuvvetleri hassas bir şekilde ölçerek bir aksonu uzatmaktır. Bu işlem, doğrudan kalibre edilmiş bir tel referans iğnesi hazırlanarak gerçekleştirilir; tel referans iğnesi kalibrasyonunun ardından istenen kuvvet aralığında kalibre edilmiş, ara ve çalışma iğneleri hazırlanır. Ardından, bir aksonu uzatmak amacıyla çalışma iğnesi ile büyüme konileri çekilir.

Ortaya çıkan aksonal uzama kaydedilir ve kalibre edilmiş iğnenin bükülmesine dayanarak kuvvetler ölçülür. Bu yöntem, akson uzamasının biyofiziği hakkındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu prosedüre, yaklaşık dört milimetre uzunluğunda konik uçlu iğneler üretmek için ayarlanabilir bir mikroiğne çekici ve cam kılcal tüpler kullanarak başlayın.

İğneleri kapaklı 160 mm'lik bir Petri kabında saklayın. Ardından, ucu kırılmış bir cam iğnenin içerisinden 0.001 inçlik bir kromal tel geçirerek bir kalibrasyon iğnesi hazırlayın. Teli uçtan 26 mm uzunluğunda dışarı çekin ve hızlı yapıştırıcı ile sabitleyin.

Telin distal bir milimetresini bükerek bir kanca oluşturun. Ardından, 0,003 inç kalınlığında sabit telden bir metre kullanılarak mikro ağırlıklar hazırlanır. Teli ölçmek için bir metre cetveline bantlayın.

Mümkün olduğunca düz hale getirmeye yardımcı olmak için. Bir metrelik teli tartın ve hassas bir şekilde bir santimetrelik parçalar halinde kesin. Telin birkaç parçasını vazo şeklinde bükün.

Tel iğnelerin kalibre edilmesi, ölçüm dikeyine ve bir mikro manipülatöre sahip bir diseksiyon mikroskobu gerektirir. Mikroskop, yan tarafına doğru 90 derece eğilir. Tel iğnenin aşağı doğru sapmasının gözlemlenebilmesi için evrensel bir bom standı kullanılır.

Tel iğneyi, mikroskobun optik eksenine dik olacak şekilde bir mikro manipülatör üzerindeki alet tutucuya yerleştirin. Tel iğnenin kancasını radyal bir işaretle hizalayın. Bir santimetrelik mikro ağırlığı kancaya asın ve sapmayı kaydedin.

Referans telinin bükülme sabiti, mikro ağırlığın kütlesinin gözlemlenen sapmaya bölünmesine eşittir. Kalibrasyondan sonra, ara cam iğneleri kalibre etmek için jiletle işaret noktasındaki kancayı keserek iğneyi bir sonraki adım için hazırlayın. Oküler redle sistemine sahip bir ters mikroskop gereklidir.

Mikroskop tablasının bir tarafında, tel iğneyi tutmak için kullanılan mekanik bir mikro manipülatör bulunur. Diğer tarafta ise ara cam iğneyi hareket ettirmek için kullanılan hidrolik bir mikro manipülatör yer alır; mikro manipülatörler kullanılarak kalibre edildikten sonra, 10x büyütmedeki optik alanın merkezinde, su içeren 160 milimetreye 30 milimetrelik bir Petri kabı içerisinde her iki iğneyi 45 derecelik bir açıyla bir araya getirin. Ardından, bu sapmaların her biri için bir dizi sapma işlemi gerçekleştirin.

Cam iğnenin serbest bırakılmadan önceki başlangıç sapma miktarıyla, serbest bırakıldıktan sonraki nihai sıfır yük konumunu kaydedin. Bu işlem 10 çift veri noktası oluşturur. 10 veri çiftini lineer regresyona hazırlamak için, başlangıç sapma miktarı kaydedilen çiftlerin ikinci sayısından çıkarılır.

Sıfır kuvvetindeki sıfır sapma noktasında lineer regresyonu sabitlemek için, 10 deneysel veri çiftine beş adet sıfır-sıfır kontrol çifti ekleyin. Bu 15 veri çifti ile lineer regresyonu hesaplayın.

Ara cam iğnenin yay sabiti, tel iğnelerin bilinen bükülme sabitinin regresyon doğrusunun eğimine bölünmesine eşittir. Ardından, çalışma cam iğnelerini az önce açıklandığı gibi ara cam iğneye göre kalibre edin. Mikrometre başına iki mikrondan daha düşük olan cam iğneler, uygun bir sertlik aralığına getirmek için hafifçe kısaltılabilir.

Kaplama yapılacak iğneleri, 10 mililitrelik tutunma faktörü çözeltisi beheri üzerinde tutulan bir kil kütlesinin yan tarafına, sadece iğne ucunun sırayla çözeltiye gireceği şekilde bastırın. İğneleri 30 dakika boyunca %0,1 polilizin çözeltisine daldırın. Ardından, iğneler tutunma faktörleri ile işlenirken, iğneleri 30 dakika boyunca conval ve a içine daldırın.

İnkübatörü veya mikroskop tablası ısıtma sistemini açın. Böylece tabla termal dengeye ulaşacaktır. Titreşim izolasyon masası üzerindeki çekme iş istasyonu, çift alet tutucunun yerleştirildiği, karşı dengelenmiş özel bir uzantıyı tutan hidrolik bir manipülatörle donatılmış ters bir mikroskoptan oluşur.

Kalibre edilmemiş bir referans iğneyi, mümkün olduğunca uzun çıkacak şekilde bir iğne tutucuya yerleştirin. Bu düzeneği çiftli alet tutucunun sağ tarafına yerleştirin. Ardından, işlem görmüş çalışma iğnesini, referans iğnenin yarı yarıya kadar çıkacak şekilde bir iğne tutucuya yerleştirin ve bunu çiftli alet tutucunun sol tarafına koyun.

Hidrolik mikromanipülatörü, dikey kontrol tamamen yukarıda olacak şekilde önceden ayarlayın. Ardından, yanlara ayar vidasını kullanarak iki iğne ucunu birbirine yaklaştırın. İğneyi konumlandırın.

Uçların hizalanması için çifti yandan gözle inceleyin ve uçları aynı düzleme getirmek için sağ taraftaki yukarı-aşağı vidasını kullanın. Alet tutucuyu döndürün ve iğne uçlarını medyanın yüzeyinin üzerindeki ışık yoluna yerleştirin. Bunları dik bir açıyla aşağıya doğru yönlendirin.

Tabandaki mafsal vidasını sıkın. 10 x objektif ile bakarak, odağın altındaki hücrelerin üzerine, yukarıya odaklayın. İğne uçlarını mikroskobun görüş alanında bulmak için iğneleri medyumun içine indirin.

Kültür kabının çok derinlerine indirmeden önce, iğneyi yanlara doğru ileri veya geri hareket ettirerek gölgesini arayın. Bir iğne görüş alanına girdiğinde, hangi iğnenin bulunduğunu belirlemek için yan ayar vidasını çevirin.

Vida ile birlikte hareket ediyorsa, bu referans iğnedir. Hareket etmiyorsa, kalibre edilmiş iğnedir. Her iki iğne de belirlendiğinde, onları hizalamak için çift takımlı tutucunun ince ayar kontrollerini kullanın.

Amaç, iğne uçlarının yaklaşık 50 micrometers aralıkta veya monitörde yaklaşık bir inç mesafede olmasıdır. Referans, kültür kabının daha yukarısında olmalı ve bu nedenle odağın biraz dışında kalmalıdır. Çekme iğnesi kap üzerinde odaklandığında, bu nihai ayarlanmış konumun görüntüsünü kaydedin.

İğnelerin birbirinden ayrıldığı nokta, sıfır referans mesafesidir. İğneleri numune düzleminin üzerine kaldırın ve görüş alanının kenarına park edin. Yazılı protokoldeki kılavuzları kullanarak deneysel bir akson seçin.

İğneleri aksonun büyüme konisine yaklaştırın ve sıfır mesafesini tekrar kaydedin. Ardından, bir büyüme konisini iğne üzerine yerleştirmek için titreşim izolasyon masasını hava ile kaldırın. Çekme iğnesini büyüme konisinin yanına, altına gelecek şekilde yerleştirin ve ardından iğneyi kap tabanına doğru indirin.

Bu işlem, iğnenin yukarı doğru sapmasına, bükülerek kap boyunca büyüme konisine doğru kaymasına ve ardından büyüme konisini yerinden çıkarıp yukarı doğru hareket ettirmesine neden olacaktır. İğneyi, büyüme konisi iğne ucuna takılacak kadar, ancak iğnenin üzerinden kayıp geriye doğru gitmeyeceği kadar kap tabanına bastırın. Tutunmanın gerçekleşmesi için 20 dakika bekleyin.

Büyüme konisi iğne üzerindeyken, iğneyi sağa doğru hareket ettirerek üzerine hafif bir gerginlik uygulayın ve iğneyi hafifçe kaldırırken, iğnenin aşağı yönlü hareketini iğneyi biraz ileri hareket ettirerek dengeleyin. Bağlı uzantı, iğneden dik bir şekilde ve kabın yüzeyinin üzerinde uzanana kadar iğneyi aşamalı olarak kaldırın. Çekme işlemi, iğnelerin hücre gövdesinden uzaklaştırılmasıyla gerçekleştirilir.

Gerginlik kademeli olarak artırılırken, kuvvetler iğneler arasında artan bir boşluk olarak gözlemlenir. Büyüme konisinin iğneden ayrıldığına dair herhangi bir belirti olup olmadığı dikkatle izlenir. Buharlaşmayı dengelemek için saat başı su ekleyerek kaptaki ortam seviyesi korunur.

Kabın kenarındaki bir işareti başlangıç derinliğini belirtmek için kullanarak, pipetinizle yavaşça suyu, deney sonunda iğnelerden uzak olacak şekilde kabın kenarından ekleyin. İğneleri kaptan çıkarmadan önce sıfır mesafesini tekrar kontrol edin. Ekrandaki yatay eksen boyunca iğnelerin konumlarını okuyun.

Ayrıca hücre gövdesinin konumunu ve iğnelerin ayrılma mesafesinden yüksüz sıfır mesafesinin çıkarılıp iğnenin eğilme sabitiyle çarpımının, uygulanan kuvvet mikronuna eşit olduğu zamanları kaydedin. Gösterilmiştir. Burada, aksonal gelişimi kontrol etmek için birkaç olası seçeneğin bulunduğu örnek bir hücre alanı yer almaktadır. Büyük bir büyüme konisine sahip yatay akson iyi bir seçimdir.

Hücre gövdesi ekranın kenarına yakın bir konuma yerleştirilir ve iğneler büyüme konisine yaklaştırılır. Yükleme yapılmamış iğne açıklığının bir görüntüsü alınır; bu mesafe sıfır noktası olarak kabul edilir. Deney başlamadan önce, spontan bir tutunma sağlanıp sağlanamadığını görmek için çekme iğnesi büyüme konisine yaslanır.

Ardından iğne, büyüme konisinin içine biraz daha itilir. İğnenin çanak tabanına doğru indirilmesiyle gerçekleştirilen yukarı itme manevrası, iğnenin bükülmesini ve büyüme konisinin içine kayarak onu yerinden çıkarmasını sağlar. Ayrıca küçük bir miktarda ileriye doğru gerilme eklenmiştir.

15 dakika sonra, aksonun iğnenin ileri hareketiyle birlikte uzadığı görülür. Ardından, çekme iğnesine daha fazla gerginlik uygulanır ve iğnenin kaldırılma işlemine başlanır. İğneler arasındaki artan mesafe ile gösterilen ek gerginlik uygulanır.

Bu noktada, akson belirgin bir şekilde uzamaktadır. Referans iğnesi ileriye doğru hareket etmemiştir ancak akson ona doğru büyüyerek gerginliği azaltmıştır. Ayrıca, iğneler hafifçe yukarı kaldırılmıştır.

Burada, çekme iğnesine daha fazla gerginlik eklenir. Bükülmüş çekme iğnesine uygulanan gerginliğe yanıt olarak belirgin bir büyüme gerçekleşmiştir. Deneyin sonunda, son bir sıfır kontrolü gerçekleştirilir.

Tüm süreç, bu hızlandırılmış çekim sekansında gösterilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra; iğnelerin nasıl kalibre edileceği, büyüme konisinin bir iğne üzerine nasıl manipüle edileceği ve bir akson uzatılırken kuvvetlerin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.