C2C12 Myoblast Hücreler kullanarak Bioenerjetik bilgileri Deney

Aşağıdaki deneyin genel amacı, XF 96 hücre dışı akış analizörünü kullanarak oksidatif metabolizmanın birden fazla parametresini ölçmek yoluyla canlı hücrelerdeki ve izole mitokondrilerdeki mitokondriyal fonksiyonel durumu test etmektir. Bu parametreler bazal respirasyon, ATP döngüsü, proton sızıntısı ve maksimal respirasyon veya yedek solunum kapasitesidir. Bu işlem, C2C12 miyoblast hücrelerine mitokondriyal respirasyonun spesifik modülatörlerinin ardışık olarak eklenmesi ve respirasyonun bir göstergesi olan oksijen tüketim hızındaki (OCR) değişimin yanı sıra, glikoliz yoluyla ATP üreten glukozun laktata dönüşümünün ölçülmesiyle gerçekleştirilir.

Hücrelerdeki diğer ana enerji yolu da ECAR veya hücre dışı asidifikasyon hızı olarak ölçülür. Hücrelerin yaşam süresinin belirlenmesinde mitokondriyal fonksiyonun oynadığı merkezi role dair içgörü sağlayan mitokondriyal profilleme sonuçları elde edilebilir. Merhaba, ben David Nichols.

Kariyerim boyunca mitokondri üzerine çalışan bir araştırmacı oldum ve çalışmalarımda kullandığım en önemli ekipman oksijen elektrodu oldu. İzole edilmiş mitokondrilerle farklı koşullar altında oksijen tüketim hızını ölçebilirseniz, çok önemli ve geniş kapsamlı bilgiler elde edersiniz. Çok kuyucuklu plakalarda veya lamel üzerinde kültüre edilen hücrelere, özellikle de hücre düzeyine geçtiğinizde, klasik yöntemler işe yaramaz.

Bu, birkaç yıl önce hücre solunumunun çok kuyucuklu plaka formatında paralel olarak incelenmesine olanak tanıyan çok kuyucuklu plaka analizinin geliştirilmesiyle aşılmış önemli bir sorundur. Bugün göreceğiniz deney, kültürlenmiş hücrelerde temel mitokondriyal biyenerjetik fonksiyonu izlemek amacıyla tasarladığımız, oldukça basit ancak bilgi açısından zengin bir deneydir. Başlamak için, hücreleri XF 96 hücre kültürü plakalarına, kuyucuk başına 100 µL büyüme ortamında 10.000 hücre olacak şekilde ekin ve %10 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.

Hücreler, ekimden 24 saat sonra XF 96 cihazında analiz edilebilir. Assay Wizard, aşağıdaki grup düzenine sahip bir şablon oluşturur. Birinci sütundan on ikinci sütuna kadar olan tüm sütunlar 10,000 C two C 12 hücresi içerir.

Mavi ile belirtilen birinci grup kontrol hücreleri olarak kullanılır. Kırmızı ile belirtilen ikinci gruba oligo Mycin, FCCP ve roone ilaçları uygulanacaktır. Ardından, protokolün yazılı kısmında açıklandığı şekilde bileşikleri X-F-D-M-E-M assay ortamında hazırlayın.

Oligomycin, FCCP ve rotenon. Bu bileşikler XF hücre MIT stres testi kitinde önceden dispense edilmiştir. XF hazırlama istasyonunu kullanarak, büyüme ortamını DMEM çalışma ortamı ile değiştirin.

Son olarak, hücrelerin enjekte edilecek bileşikler sensör kartuşuna eklenmeden önce analiz ortamıyla ön dengeye gelmelerini sağlamak için hücreleri, karbondioksit içermeyen 37 °C'lik bir inkübatörde 60 dakika boyunca inkübe edin. Ardından bileşikleri 37 °C'ye ısıtın. Daha sonra bunları şu şekilde enjektör portlarına yükleyin: Bir ile dört arasındaki kolonlar için, A, B ve C portlarına sırasıyla 16, 18 ve 20 µL XF analiz ortamı veya DMEM yükleyin.

Beşinci ile on ikinci sütunlar için, A portuna 16 µL oligomycin, B portuna 18 µL FCCP ve C portuna 20 µL rotenon yükleyin. Ardından, protokol komutlarını şu şekilde tanımlayın: döngü sayısını üç kez, karıştırma süresini üç dakika ve ölçüm süresini üç dakika olarak ayarlayın. Son olarak, başlat düğmesine tıklayın.

Kalibrasyon tamamlandığında kullanıcıya kartuşun ne zaman yükleneceğini belirtecek olan ekrandaki talimatları izleyin. Kullanıcı istemlerini takip edin ve deney için hücre plakasını ekleyin. Ardından devam butonuna tıklayın ve analizin çalışmasına izin verin.

Deney sona erdiğinde plakayı çıkarın. Bu Analiz, mitokondriyal fonksiyonu profillemek için kullanılan klasik deneyden türetilmiştir ve çeşitli bileşiklerin hücre metabolizması, mitokondriyal fonksiyon ve genel biyoenerjetik aktiviteler üzerindeki etkilerini anlamayı amaçlayan daha karmaşık deneyler oluşturmak için bir çerçeve görevi görür. Burada, hücreler her bir bileşik dizisiylele tedavi edilirken oksijen tüketim hızında beklenen yanıtı gözlemledik.

Ligamycin uygulaması sonucunda, mitokondriyal kompleks beşle ATP sentezinin engellenmesi nedeniyle ATP seviyesi azalmıştır. Hücreler, ligamycin tedavisinden sonra oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP sentezleyemedikleri için, ATP ihtiyaçlarını karşılamak adına glikolize geri dönmüşlerdir. Bu nedenle, daha önce gösterildiği üzere, glikolizin bir göstergesi olan ekstraselüler asidifikasyon hızı (ECAR) değerinde bir artış gözlemledik. FCCP, bir etkisizleştirici (uncoupling agent) olarak hareket eder ve protonların geri girişindeki kısıtlamayı kaldırır.

Solunum hızlanır ve artık elektron taşınımı ile sınırlanır. Son olarak, rotenon mitokondriyal kompleks bir'i inhibe eder; bu durum, elektron taşıma zincirindeki elektron akışının durmasına yol açar ve böylece oksijen tüketimi önemli ölçüde azalır. Burada, hücrelerin bazal solunumu, oksijen tüketiminin ATP üretimine ayrılan yüzdesinin yanı sıra proton sızıntısı nedeniyle proton gradyanını korumaya ayrılan miktar hakkında bilgi elde edilir.

Ayrıca, bazen yedek solunum kapasitesi olarak adlandırılan, ayrık solunum koşulları altında maksimal solunum hızını elde edebiliriz. Ve son olarak, mitokondriyal süreçlerden kaynaklanmayan oksijen tüketim miktarını belirleyebiliriz. Bunları az önce seahorse ile gördünüz.

XF 96, hücredeki mitokondrilerin BIE enerjetiği hakkında muazzam miktarda bilgi sağlayan bir dizi deneydir. Çok önemli olan temel deneye, yani birinci deneye, bazal respirasyon, ATP döngüsü, mitokondriyal proton sızıntısı ve yedek solunum kapasitesi hakkında bilgi veren deney diyoruz. Bu parametreler, hücredeki mitokondrilerin biyoenerjetik durumu hakkında bu temel bilgileri sağlar.