C2C12 Myoblast Hücreler kullanarak Bioenerjetik bilgileri Deney

Aşağıdaki deneyin genel amacı, XF 96 hücre dışı akı analizörü kullanarak oksidatif metabolizmanın çoklu parametrelerini ölçerek canlı hücrelerde ve izole edilmiş mitokondride mitokondrinin fonksiyonel durumunu test etmektir. Bu parametreler bazal solunum, A TP cirosu, proton kaçağı ve maksimal solunum veya yedek solunum kapasitesidir. Bu, C iki C 12 miyoblast hücresine sıralı olarak mitokondriyal solunumun spesifik modülatörlerinin eklenmesi ve oksijen tüketim oranındaki değişimin veya solunumun bir göstergesi olan OAR'ın, glikozun laktata dönüştürülmesinin ölçülmesiyle gerçekleştirilir ve bu da glikoliz yoluyla bir TP oluşturur.

Hücrelerdeki diğer ana enerji yolu da ECAR veya hücre dışı asitleşme oranı olarak ölçülür. Mitokondriyal fonksiyonun hücrelerin ömrünü belirlemede oynadığı merkezi rol hakkında fikir veren mitokondriyal profil oluşturma sonuçları elde edilebilir. Merhaba, benim adım David Nichols.

Tüm kariyerim boyunca mitokondriyal bir sanatçı oldum ve çalışmalarımda kullandığım en önemli ekipman oksijen elektrodu oldu. İzole edilmiş mitokondri ile farklı koşullar altında oksijen alım oranını ölçebilirseniz, çok önemli bir bilgi elde edersiniz. Hücrelere, özellikle de çok kuyucuklu bir plakada veya bir örtü kızağında kültürlenmiş hücrelere geçtiğinizde, klasik yöntemler işe yaramaz.

Bu, birkaç yıl önce, hücrelerin solunumunu çok kuyulu bir plaka formatında paralel olarak incelememizi sağlayan çok kuyulu bir plaka testinin geliştirilmesiyle üstesinden gelinen büyük bir sorundur. Bugün göreceğiniz şey çok basit ama bilgi açısından zengin bir deney, kültürlenmiş hücrelerdeki temel mitokondriyal biyoenerjetik fonksiyonu izlemek için tasarladık. Tohum hücrelerine başlamak için. 100 mikrolitre büyümede kuyu başına 10.000 hücreli XF 96 hücre kültürü plakalarında,% 10 karbondioksit içeren 37 santigrat derece inkübatöre orta ve yerleştirin.

Hücreler, tahlil kullanılarak tohumlamadan 24 saat sonra XF 96'da test edilebilir. Sihirbaz, aşağıdaki grup düzenine sahip bir şablon oluşturur. Birden 12'ye kadar olan sütunların tümü 10.000 C, iki C 12 hücre içerir.

Mavi renkli birinci grup, kontrol hücreleri olarak kullanılır. Kırmızı renkli ikinci gruba oligo Mycin, FCCP ve roone ilaçları uygulanacaktır. Daha sonra, bileşikleri protokolün yazılı bölümünde açıklandığı gibi X-F-D-M-E-M tahlil ortamında hazırlayın.

Oligo Mycin, FCCP, çürük bilinen. Bu bileşikler, XF hücresi MIT stres test kitinde önceden dağıtılır. XF hazırlık istasyonunu kullanarak, büyüme ortamını DMEM çalışma ortamı ile değiştirin.

Son olarak, hücrelerin test ortamı ile önceden dengelenmesine izin vermek için hücreleri 60 dakika boyunca karbondioksit içermeyen 37 derecelik bir inkübatörde inkübe edin: Enjekte edilebilir bileşikleri sensör kartuşuna eklemeden önce, bileşikleri 37 santigrat dereceye kadar oluşturun. Ardından bunları aşağıdaki gibi enjektör portlarına yükleyin. Bir ila dört arasındaki sütunlar için, sırasıyla A, B ve C bağlantı noktalarına 16, 18 ve 20 mikrolitre XF test ortamı veya DMEM yükleyin.

Beşinci ila 12 arasındaki sütunlar için, 16 mikrolitre tüm liga misinini A bağlantı noktasına, 18 mikrolitre FCCP'yi B bağlantı noktasına ve 20 mikrolitre çürümeyi Bağlantı Noktası C'ye yükleyin. Üç dakikaya kadar karıştırın ve üç dakikaya kadar ölçün. Ardından, başlat'a tıklayın.

Kalibrasyon tamamlandığında kullanıcıya kartuşu ne zaman yüklemesi gerektiğini bildiren ekrandaki talimatları izleyin. Kullanıcı istemlerini izleyin ve deney için hücre plakasını ekleyin. Ardından devam et'e tıklayın ve testin çalışmasına izin verin.

Deney sona erdiğinde plakayı çıkarın. Bu Test, mitokondriyal fonksiyonun profilini çıkarmak için klasik deneyden türetilmiştir ve hücre metabolizması, mitokondriyal fonksiyon ve genel biyoenerjetik aktiviteler üzerindeki çeşitli bileşik etkileri anlamayı amaçlayan daha karmaşık deneyler oluşturmak için bir çerçeve görevi görür. Burada, hücreler bileşiğin her başarısı ile tedavi edilirken oksijen tüketim oranında beklenen yanıtı gözlemledik.

Liga için Mycin Oard, mitokondriyal kompleks beşte bir TP sentezinin bloke edilmesinin bir sonucu olarak azaldı. Hücreler, bir liga misin tedavisinden sonra oksidatif fosforilasyon yoluyla bir TP sentezleyemediğinden, TP taleplerini karşılamak için glikolize geri döndüler. Böylece, daha önce gösterildiği gibi glikolizin bir göstergesi olan hücre dışı asitleşme hızı olan ECAR'da bir artış gözlemledik. FCCP, bir ayırma ajanı olarak işlev görür ve proton yeniden giriş sınırlamasını ortadan kaldırır.

Solunum hızlanır ve artık elektron taşınması ile sınırlıdır. Son olarak, bilinen ezber, elektron taşıma zincirinde elektron akışının durmasına neden olan mitokondriyal kompleksi inhibe eder ve böylece oksijen tüketimi büyük ölçüde azalır. Burada, hücrelerin bazal solunumu, bir TP üretimine ayrılan oksijen tüketiminin yüzdesi ve proton sızıntısı nedeniyle proton gradyanını korumaya ayrılan miktar hakkında bilgi edinilir.

Ayrıca, bazen yedek solunum kapasitesi olarak adlandırılan bağlanmamış solunum koşulları altında maksimum solunum hızını elde edebiliriz. Ve son olarak, mitokondriyal süreçlerden kaynaklanmayan oksijen tüketimi miktarını belirleyebiliriz. Az önce denizatı ile gördünüz.

XF 96, hücredeki mitokondrinin BIE enerjileri hakkında muazzam miktarda bilgi veren bir dizi deney. Çok önemli olan temel deney, biz buna bir numaralı deney diyoruz, size bazal solunum, TP döngüsü, mitokondriyal proton sızıntısı ve yedek solunum kapasitesi hakkında bilgi veriyor. Bu parametreler size hücredeki mitokondrinin biyoenerjetik durumu hakkında bu temel bilgiyi verir.