Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile

Diş yüzeylerinde oluşan biyofilmler oldukça karmaşık ve yapıdadır. Sürekli çevresel zorluklara maruz kalan hücre dışı bir matris içinde yer alan mikrobiyal topluluklar. Buradaki genel amaç, yeni bir floresan görüntüleme tekniğini veri işleme ve analiz için özel yapım yazılımla birleştirerek oral biyofilmlerin karmaşık doğasını göz önünde bulundurarak, yapısal ve moleküler çalışmaları kolaylaştırmak için tasarlanmış bir analitik araç kutusunun iki spesifik bileşenini göstermektir.

Bu, ilk olarak EPS ve bakterilerin eşzamanlı görselleştirilmesi için yeni bir konfokal görüntüleme yaklaşımı da dahil olmak üzere biyofilm, transkriptom ve yapı analizi için spesifik tahlillerin seçilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, biyolojik tahlillerden ham verilerin toplanmasıdır. Üçüncü adım, kolokalizasyon analizi için yeni geliştirilen ikili istatistik de dahil olmak üzere özel bir yazılım kullanarak ham verileri işlemektir.

Son adım, mikrodizi veri madenciliği ve organizasyon yazılımı mikrodizi, veri görselleştiricisi veya MDV kullanımı dahil olmak üzere süreç verilerini analiz etmektir. Sonuç olarak, oral patojenlerin karmaşık diyete yanıt olarak transkriptomlarını ve biyofilmlerin mimarisini nasıl değiştirdiğini, benzersiz bir şekilde entegre edilmiş analitik araç kutumuzu kullanarak mikrobiyal etkileşimlere ev sahipliği yaptığını ve daha kapsamlı bir biyofilm analizi ve veri yorumlaması sağladığını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, benim adım Michelle Kuh, Universal of Rochester Tıp Merkezi'nde Foral biyoloji merkezinde doçentim.

Bugün, biyofilm analizi için analitik bir araç kutusu sunuyoruz. Bu araç kutusu, biyofilm hücrelerinin nasıl yapılandırıldığı, hücre dışı matriks ile nasıl düzenlendiği ve Transkriptomik düzeyde karmaşık çevresel zorluklara nasıl yanıt verdikleri gibi biyofilm araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Benim adım Jean, o, Dr.Ks laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım.

Bugün araç kutumuzun görüntüleme kısmını göstereceğim. Merhaba, ben Aise Klein. Dr.Ks laboratuvarında araştırma görevlisi doçentim.

Bugün, mikroray veri analizi için MDV yazılımını sunacağım. Bu prosedürde, tükürük kaplı hidroksi iştah diskleri, biyofilmlerin büyütüldüğü diş yüzeyi vekilleri olarak kullanılır. İlk olarak, dekstrin konjuge LOR 6 47 boyasında plakayı ışıktan koruyan 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna S mutantları ile aşılanmış 2.8 mililitre kültür ortamı ekleyin ve her bir oyuklu bir mikromolar nihai konsantrasyona kadar ekleyin ve boyayı kültür ortamına karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Daha sonra, steril forseps daldırma kullanarak, fazla tükürük veya bağlanmamış tükürük bileşenlerini çıkarmak için steril tükürük kaplı hidroksiapatit diskleri steril AB tamponunda iki kez yıkayın. Daha sonra diskleri boya takviyeli kültür ortamına dikey olarak yerleştirin ve her bir diskin tamamen suya daldırıldığından emin olun. Plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve biyofilmlerin oluşmasına ve konjuge dokunun bakteri hücreleri tarafından üretilen ekzo polisakkaritlere dahil edilmesine izin vermek için% 5'lik bir karbondioksit inkübatörde 20 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Önce bakteri hücrelerini etiketlemek için, kuyucuk başına 2.8 mililitre steril milli Q su ile 24 oyuklu bir plaka hazırlayın. Her bir oyuğa 1.5 mikrolitre cyto dokuz boya ekleyin, bir mikromolar nihai konsantrasyona getirin ve plakayı ışıktan koruyun. Biyofilm oluştuktan sonra, diskleri içeren plakayı inkübatör daldırmasından çıkarın.

Her bir diski% 0.89 sodyum klorür çözeltisi içinde yıkayın. Daha sonra bunları cyto nine boyasını içeren yeni plakaya aktarın. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Hücreler boyandıktan sonra, biyofilmleri ve sodyum klorürü daha önce olduğu gibi yıkayın. Daha sonra forseps kullanarak, biyofilmleri telden sodyum klorür içeren bir Petri kabına bırakın. Petri kabını alüminyum folyo ile sarın.

Biyofilmler artık bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak konfokal mikroskopi ile görselleştirmeye hazırdır. Her biyofilmi rastgele seçilen beş ila 10 pozisyonda tarayın ve her pozisyonda Z serisi oluşturun. 3B rekonstrüksiyonlara izin vermek için, konfokal görüntüleri açın ve bunları bir ayna yazılımı kullanarak işleyin.

Program kullanılarak üretilen bu üç boyutlu konfokal görüntüler, Amira gösterilen prosedür kullanılarak apathetik yüzey üzerinde oluşan bir S mutant biyofilmini göstermektedir. Bakteri hücreleri ve mikro koloniler yeşil renkte görülebilir ve ekzo polisakkaritler içeren biyofilm matrisine gömülüdür. Kırmızı renkte, seçilen bir alanın yakın plan görünümü oluşturulabilir, bu da mikro ölçekte spesifik bakteri EPS yapısal ilişkisini gösterir.

Bakteriler ve ekzo polisakkaritler gibi ayrı biyofilm bileşenlerinin kolokalizasyon miktarını ölçmek için ikili stat programını kullanın. İlk olarak, MATLAB sürüm 5.1'de yeni geliştirilen ikili istatistiğin yolunu ayarlayın ve iki biyofilm bileşeninin Z serisi görüntülerini içeren görüntü klasörlerini açın. Ardından, ilişkilendirilecek ve analiz edilecek iki kanal seçin.

İki görüntü yığını, tüm boyutlarda aynı piksel boyutlarına ve her yığında aynı sayıda görüntüye sahip olmalıdır. Her kanal için eşikleri ayarlayın ve yazılım arayüzündeki talimatları izleyin ve verileri analiz için veri işleme dosyasına girin. Bu şekil, ikili yığının bakteri ve DBS arasındaki uzamsal ilişkiyi nicel olarak nasıl yorumladığını göstermektedir.

Biyofilm içinde Duo yığını, burada bakteriler için yeşil çizgide ve EPS için kırmızı çizgide görüldüğü gibi, bakteri ve DPS'nin disk yüzeyinden sıvı fazına dikey dağılımını hesaplar. Ayrıca, biyofilm kalınlığı boyunca bakteri ve DPS'nin kolokalizasyonunu da hesaplar. Sarı çizgide gösterildiği gibi, veriler biyofilm derinliği boyunca bakterilerden daha yüksek EPS oranlarını göstermektedir ve bakteri hücrelerinin çoğu, özellikle orta katmanlardan ve yukarıdan EPS ile ilişkilidir 3D render ile Duo stat, biyofilmlerde bakteri ve DPS'nin yapısal organizasyonu ve etkileşiminin daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Biyofilmlerden yüksek kaliteli RNA elde edilmesini sağlamak için, RNA ekstraksiyonunun Curian KU'nun 2007 yılında yayınlanan makalesinde açıklanan biyofilm spesifik protokole göre yapılmasını öneriyoruz. Dergide, CD NA mikroarray hazırlama ve kantitatif gerçek zamanlı PCR testleri için analitik biyokimya standart protokolleri kullanılmaktadır. Mikrodizi deneyleri tarafından üretilen büyük veri kümelerinin analizini kolaylaştırmak için, www.oralgen.anl.gov'da çevrimiçi olarak mevcut olan bir veri madenciliği ve organizasyon yazılımı olan mikroarray veri görselleştiricisi veya MDV'yi tasarladık.

Verileri MDV'ye göndermeden önce, sınıf karşılaştırması için 0,001'lik bir kesme P değeri ile çevrimiçi olarak bulunan BRB dizisi araç yazılımını kullanarak rastgele varyans modeliyle eşleştirilmiş bir T-testi gibi istatistiksel analizler gerçekleştirin. Bu örnekte, koyun etinin, üç farklı şeker konsantrasyonunda ve dört zaman noktasında büyütülen biyofilmlerin analizi yapılmıştır. Eşleştirilmiş karşılaştırmalar, koşul A'dan kaynaklanan üç BRB dosyası oluşturuldu: %0.5 sükroz artı %1 nişasta, %1 sükroz koşulu B, %0.5 sükroz artı %1 nişasta, %0.5 sükroz ve %0.5 sükroza karşı %1 sükroz durumu.

Bu panel, BRB dizi aracı kullanılarak standart sınıf karşılaştırması ile değerlendirilen her koşul ve zaman noktasında diferansiyel olarak ifade edilen olarak tespit edilen gen sayısını temsil eder ve bu da BRB ham verileri olarak adlandırılan çok sayıda gen ile sonuçlanır. MDV'nin gösterimi için, Excel kullanarak 30 saatlik zaman noktasına odaklanacağız. BRB ham verilerini MDV sekmesiyle sınırlı metin dosyalarına dönüştürün.

Gen lokus sekme numarasıyla birlikte gelen tüm harfleri çıkardığınızdan emin olun, örneğin SMU dot 1432 C adında C harfini silin, MDV'yi açın. Dosya menüsünü açın ve ek açıklama kaynağı seç'i seçin. Bir iletişim kutusu göründüğünde düz dosya seçeneğini seçin.

Gen ontolojisi, numara yolu, işlevsel sınıflandırma verileri ve gen adı için ek açıklamalar içeren dosyaları seçmek için gözat düğmelerini kullanın. Dosyaya gidin ve MDV formatına dönüştürülen dosyaların her birini içe aktarın. Her dosya deneysel bir koşulu temsil eder.

Venn diyagramı özelliğini kullanarak, bu örnekte C.In her deneysel koşul A'ya karşı B'ye karşı ifade edilen genleri karşılaştırın. Bu gösteri için, kombinasyon halinde sakaroz ve nişastanın etkileriyle benzersiz bir şekilde ilişkili olan diferansiyel olarak ifade edilen genlere odaklanıyoruz. Venn şeması tabanlı özellik, bu farklı koşullar altında ifade edilen benzersiz ve paylaşılan genlerin sayısını görselleştirmek için kullanılır ve daha fazla analiz için seçilecek olanları belirlememize yardımcı olur.

Burada, yalnızca A ve veya B koşullarında benzersiz olan, diferansiyel olarak ifade edilen genleri seçiyoruz, ancak burada gösterildiği gibi gri ile gösterildiği gibi C'de tespit edilenleri seçmiyoruz. MDV, analiz edilecek toplam gen sayısını büyük ölçüde azalttı ve aynı zamanda deneysel durum için ilgili olmayan genleri filtreledi. Dosya menüsünden, verileri kaydetmek için dışa aktarma seçeneğini seçin.

Sekme sınırlı dosyalar olarak, dosyalar daha sonra veri çıktısının düzenlenebileceği ve istenen grafik ekranlara dönüştürülebileceği Excel'de açılabilir. Excel'deki veri organizasyonu, MDV çıktısının grafiksel olarak görüntülenmesine izin verir. Bu grafik, biyofilm gelişiminin farklı aşamalarında nişasta ve sükroz kombinasyonundan etkilenen genlerin benzersiz fonksiyonel alt kümelerinin diferansiyel ifadesine genel bir bakış göstermektedir.

S mutantları transkriptomu üzerindeki etkiler, 30 saatlik biyofilm gelişiminde diğer zaman noktalarına göre daha belirgindir. Çıktı, gen seçimini ve daha fazla doğrulama sürecini kolaylaştıran zamansal etkileri göz önünde bulundurarak, çalışma hipotezimizle ilgili olan genlerin tam olarak spesifik fonksiyonel alt kümelerini tanımlamamıza yardımcı oldu. Bu prosedürü takiben, biyofilmler içindeki organizmaların spesifik fizyolojik ve metabolik tepkileri nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için biyokimyasal ve proteomik yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Böylesine kapsamlı ve entegre bir analiz, biyofilmlerin son derece dinamik ve karmaşık bir ortam olan iç mekan boşluğunda patojeniteyi nasıl modüle ettiğini daha iyi anlamaya kesinlikle yardımcı olacaktır. Daha fazla ayrıntı için lütfen bu video makalesine eklenen PDF dosyasını kontrol edin.