Hava Sıvı Arabirimi Fare Solunum Epitel Hücreleri ve Deneysel sigara dumanına maruz kalma izolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, sigara dumanına maruz kalmanın toksik etkilerini incelemek için havayolu epitel hücrelerini izole etmektir. Bu işlem, öncelikle fare trakealarının diseksiyonu ve ardından trakeaların pronaz çözeltisinde sindirilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, epitel hücrelerinin toplanması ve sıvı kültürün çoğaltılmasıdır.

Üçüncü adım, kültürlerin hava-sıvı arayüzünde farklılaştırılmasıdır. Prosedürün son adımı, epitel hücrelerini hava-sıvı arayüzünde apikal sigara dumanına maruz bırakmaktır. Nihayetinde, immünofloresan mikroskopi ile tam olarak farklılaşmış bir epitel hücresi tek tabakasını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, kronik obstrüktif akciğer hastalığı alanındaki; sigara dumanı maruziyetinin CLIA morfolojisi üzerindeki etkileri ve sigara dumanının tetiklediği hücre hasarı biyokimyasal markerları gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedür için hazırlıklara, diseksiyonun bir gün öncesinde hams F 12 besiyerini hazırlayarak başlayın. Antibiyotikli hams F 12 besiyeri ve %20 F-B-S-M-T-E-C, antibiyotikli temel besiyeri.

%5 FBS içeren MTEC besiyeri, DNA'nın tek çözeltisi, retinoik asit stok çözeltileri ve yazılı protokoldeki talimatlara uygun olarak MTEC proliferasyon besiyerini hazırlayın. Diseksiyonda kullanılacak tüm cerrahi aletleri diseksiyon gününde sterilize edin. Diseksiyon alanının temiz olduğundan ve tüm diseksiyon araçlarının el altında bulunduğundan emin olun.

Doku kültürü kabinini sterilize edin. Ardından doku kültürü kabini içerisinde çalışarak %0,15'lik pronaz çözeltisi hazırlayın.

50 mililitrelik konik bir tüp içerisindeki antibiyotik içeren 10 mililitre hams. F 12 besiyerine 15 miligram pronaz ekleyin. Kullanıma kadar buz üzerinde bekletin.

Fare trakeaları, standart cerrahi prosedürler kullanılarak farelerden diseke edilir; trakeaları içeren tüpü dezenfekte edin ve doku kültürü davlumbazına yerleştirin. Trake dokusunu, antibiyotik içeren hams F 12 medyumlu 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Trakeal bağ dokusunu temizlemek için steril cerrahi pensler kullanın.

Ardından temiz trakeaları, antibiyotikli Ham's F 12 medyumu içeren ikinci 100 milimetrelik Petri kabına aktarın. Trakeaları dikey eksen boyunca kesmek ve lümeni açığa çıkarmak için disseksiyon makası kullanın.

Trakeaları, 10 mililitre Pronase çözeltisi içeren 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve gece boyu dört derece Celsius'ta inkübe edilmek üzere buzdolabına yerleştirin. Son olarak, kullanım için kolajen bir ile işlem görmüş transwell plakalarını hazırlayın. Ertesi gün, 0,02 N asetik asidin mililitre başına 50 miligram kolajen bir ekleyin; bu çözeltiden 12'li plağın her bir kuyucuğuna bir mililitre pipetle aktarın.

Kuyu plakasıyla kuyucukları iyice yıkayın. Plakayı parafilm ile sarın ve doku kültürü davlumbazı içerisinde oda sıcaklığında gece boyunca bekletin. Ertesi gün.

Fare trakealarını içeren tüpü 10 ila 12 kez yavaşça altüst edin. Ardından, tüpün içeriğinin 4 °C'de 30 ila 60 dakika daha inkübe edilmesini sağlayın. Doku kültürü kabininde çalışarak, %20 FBS'li ve antibiyotikli 10 mL hams F 12 medyumunu, sindirilmiş trakeal dokunun bulunduğu konik tüpe pipetleyin ve 12 kez altüst edin.

Ardından, %20 FBS içeren ve antibiyotikli hams F 12 medyumundan 10 mililitreyle üç adet 15 mililitrelik konik tüpün her birini doldurun. Trakeal dokuyu pronaz çözeltisinden, desteklenmiş hams F 12 medyumunu içeren tüplerin ilkine aktarmak için steril bir pasta pipet kullanın.

Pronase çözeltisini buz üzerinde bekletin, trakeal dokunun bulunduğu tüpün kapağını kapatın ve karıştırmak için nazikçe 12 kez altüst edin. Ardından, pasta pipeti kullanarak trakeal dokuyu ikinci 15 mililitre konik tüpe aktarın ve bu tüpü 12 kez altüst edin. Aktarma ve altüst etme işlemini son 15 mililitre konik tüpü kullanarak tekrarlayın.

Son olarak, trakeal dokuyu çıkarmak ve atmak için pasta pipetini kullanın. Ardından pronaz çözeltisini buzdan çıkarın ve takviyeli hams F 12 ortamının üç adet 15 mililitrelik hacmini pronaz çözeltisi ile birleştirin. Numuneyi soğutulmuş santrifüjde, dört derece santigrat sıcaklıkta, dakikada 1.400 devir hızla 10 dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüjleme işleminin ardından süpernatanı atın, ardından trake başına yaklaşık 100 ila 200 mikrolitre DNA's, bir çözeltisini pelletin üzerine pipetleyin ve yeniden süspande edin.

Hafifçe vurarak süspande edin. Hücreleri buz üzerinde beş dakika inkübe edin. Tüpü 4 °C'de, dakikada 1.400 devirde beş dakika santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın.

Ardından, pelletin üzerine %10 FBS içeren sekiz mililitre MTEC besiyeri pipetleyin ve plakayı yeniden süspanse edin. Paria plakası üzerindeki hücre süspansiyonunu %95 hava ve %5 karbondioksit atmosferinde 37 °C'de beş ila altı saat boyunca inkübe edin. Bu, fibroblastların uzaklaştırılması için yapılan bir negatif seleksiyon adımıdır.

İnkübasyonun ardından, hücre süspansiyonunu petri kabından toplayın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe pipetleyin. Ardından, plakı %10 FBS içeren dört mililitre MTEC medyumu ile iki kez durulayın. Her iki yıkama işleminden elde edilen sıvıları da hücre süspansiyonunun bulunduğu 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.

Hücre süspansiyonunun bir mililitresini bir einor tüpüne pipetleyin. Bu alikotu cyto spin analizi ve hücre sayımı santrifüjü için ayırın. Geriye kalan 15 mililitre hücre süspansiyonunu içeren 50 mililitrelik konik tüpü, dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca dakikada 1.400 devirde santrifüjleyin.

Santrifüj sırasında, önceden hazırlanmış transwell plağındaki kolajen solüsyonunu uzaklaştırın ve atın. Plağı beş dakika boyunca çeker ocak altında kurumaya bırakın, ardından son yıkamadan sonra iki kez PBS ile yıkayın. PBS'nin tamamını aspire edin ve santrifüj sonrası transwell'in bazal bölmesine 1,5 mililitre proliferasyon medyumu pipetleyin.

Süpernatantı atın ve kuyuk başına 500 µL süspansiyonda 7,5 × 10⁴ ile 1 × 10⁵ hücrenin ekilmesini sağlamak için hücre peletini uygun hacimdeki proliferasyon medyumunda yeniden süspande edin. 500 µL hücre süspansiyonunu Transwell polikarbonat membran ekleminin apikal yüzeyine pipetleyin. Batırılmış MTEC kültürlerini, %95 hava ve %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde, 37 °C'de, her iki günde bir medyum değişimi yaparak yedi ila 10 gün boyunca inkübe edin.

Bir intervalometre kullanarak transepitelyal hücre direncini ölçün. Epitelyal direnç santimetrekare başına 1000 ohm değerine ulaştığında ve kültürler konfluent göründüğünde, apikal medyumu uzaklaştırarak LI kültürüne dönüştürün.

Ayrıca bazal medyumu, %2 yeni serum ve retinoik asit içeren MTEC temel medyumu ile değiştirin. Kültürleri, her iki günde bir medyum değişimi yaparak, farklılaşmaya izin vermek için 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 10 ila 14 gün boyunca inkübe edin. İlk olarak, sigara makinesini üreticinin talimatlarına göre kurun.

Kullanılmamış bir pole flex filtrenin ağırlığını kaydedin. Ardından filtreyi, tütün yakma haznesindeki örnekleme portundan sabit akışlı pompaya giden örnekleme borusu üzerindeki hat içi paslanmaz çelik tutucuya yerleştirin. Bir CS hücre maruziyet sistemi kullanarak, örnekleme ünitesini bir çıkış borusu aracılığıyla gaz ölçere bağlayın.

Transwell kültürlerinin apikal tarafını, üç R dört F araştırma referans filtre sigarasından çıkan ana akım sigara dumanına maruz bırakın. Hücreleri bir ila iki sigara dumanına maruz bırakın. Kontrol kültürlerini, gaz örnekleme ağırlığı kazanıldıktan sonra eşdeğer bir maruziyet süresi boyunca oda havasına maruz bırakın.

Havuz flex filtresinde, filtreye çöken toplam materyal miktarı miligram cinsinden normalize edilir. Örneklenen toplam hava hacmi için, bir ila iki sigaradan çıkan duman tipik olarak metreküp başına 100 ila 200 miligram TPM verir. Sigara maruziyeti sonrası, daha ileri analizler için hücreleri ve bazal medyumu toplayın.

Bu, nükleer epitel hücresi ve C belirteçleri için boyanmış sağlıklı bir fare solunum epitel hücresi tek tabakasının örneğidir. Başarılı epitel izolasyonu, proliferasyonu ve diferansiyasyonu, Arnavut kaldırımı morfolojisine sahip bozulmamış bir tek tabaka kullanır. Kültürler esasen fibroblast içermez.

Bu elektron mikrograf görüntüleri sağlıklı MTEC kültürlerini temsil etmekte olup, çeşitli hücre tiplerinin ve CELIA morfolojisinin ultrastrüktürünü betimlemektedir. Bu canlı hücre görüntüleme videosu, MTEC kültürlerinin sağlıklı C morfolojisini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, fare trakeal epitel hücrelerinin nasıl izole edileceği, hava-sıvı arayüzünde nasıl farklılaştırılacağı ve ana akım sigara dumanına nasıl maruz bırakılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.