Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Bu prosedürün genel amacı, multipleks kantitatif R-T-P-C-R'ı bir mikroakışkan platformla birleştirerek, minimal başlangıç materyali ile mikro RNA ekspresyonunu verimli, düşük maliyetli ve etkili bir şekilde profillemektir. İşlem, ekstrakte edilen RNA'nın konsantre edilmesiyle başlar, ardından multipleks ters transkripsiyon ve multipleks ön amplifikasyon işlemleri izler. Bir sonraki adım, fazla primerlerin saflaştırılarak uzaklaştırılmasıdır.

Son olarak, mikroakışkan bir platform kullanılarak singleplex mikro RNA ekspresyon profili çıkarılır. Sonuç, ilgilenilen örnekler genelinde doğru ve yüksek düzeyde tekrarlanabilir mikro RNA ekspresyon seviyeleridir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, pre-EMP amplifikasyonu sonrası ek saflaştırma adımının, multiplex Q-R-T-P-C-R yönteminin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini artırmasıdır.

Serumden ekstrakte edilmiş RNA ile başlayın. Homojenize edilmiş dokudan triol gibi fenol kloroform tabanlı RNA yöntemi veya bir RNA saflaştırma kiti kullanarak yapılan tüm ekstraksiyonları bir yıkama adımı takip etmeli ve tüm saklama işlemleri minus 80 degrees Celsius'da gerçekleştirilmelidir. RNA çözeltisini konsantre edin.

Öncelikle serumdan elde edilenler gibi sınırlı miktarda numune ile başlanıyorsa, bir MicroCon numune rezervuarını bir viyale yerleştirin, ardından pipet ucunun membrana değmemesine çok dikkat ederek RNA solüsyonunu rezervuara pipetleyin. Şimdi, viyali ve filtreyi, çatlak bandı rotora bakacak şekilde santrifüje yerleştirin ve santrifüj işlemini yaklaşık üç saat boyunca çalıştırın. Üç saat sonra, RNA'yı elüe etmek için RNA tamamen membran üzerinde konsantre olacaktır.

Membrana istenen miktarda RNAsปลอด su ekleyin, rezervuarı ters çevirerek yeni bir tüpe yerleştirin. Ardından, 4 °C'de maksimum 3000 ×g hızda üç dakika boyunca santrifüjleyin. Konsantre edilmiş RNA'yı ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın. RNA üzerinde xpl ters kök döngü (reverse stem loop) primerleri kullanılarak bir RT reaksiyonu ve ardından 12 ila 18le PCR döngüsü gerçekleştirildikten sonra, mikroRNA'lar cDNA zincirleri ile temsil edilir.

Buna pre-PCR ürünü denir ve bu, yaklaşan QPCR işlemini ifade eder. Pre-PCR ürününün, 10 baz çiftli bir DNA merdiveni ile birlikte %10'luk poliakrilamid jel üzerinde saflaştırılması gerekir; her kuyucuğa 6x orange G'den 5,5 µL ile 27,5 µL pre-PCR ürününün karışımı yükleyin.

Jeli 150 volt değerinde 55 ila 60 dakika boyunca çalıştırın. Romo fenol mavisi bu jelde 20 baz çifti bölgesinde ilerler. Jel çalıştırıldıktan sonra, ışığa maruz bırakmadan bir çalkalayıcı üzerinde 25 dakika boyunca cyber gold ile boyayın.

60 ile 80 baz çifti arasındaki PCR öncesi ürün bandını kesin ve jel bloğunu etiketli tüplere aktarın. Ürün konsantrasyonu düşükse bant görünmeyebilir, ancak yine de jel içerisinde yer alacaktır. Şimdi, tüp içinde tüp santrifügasyon yöntemiyle jel bandını ezin ve 300 mikrolitre TEN tamponu ekleyin.

Tampon jel karışımını 37 °C'de, ajitasyonla dört saat boyunca inkübe edin. Dört saat sonra, sıvıyı yeni bir tüpe aktarın ve 300 µL daha TEN tamponu ekleyin. Bu karışımı 4 °C'de, ajitasyonla gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, tüp içeriğini tekrar aktarın ve pre-PCR ürününün etanol çöktürme işlemine geçin. Bir çip paketinden çıkarıldığında, 24 saat içinde hazırlanmalı ve hazırlama işleminden sonraki 60 dakika içinde yüklenmelidir. Çip üzerindeki her bir akümülatöre 150 µL kontrol hattı sıvısı enjekte ederek dizinin hazırlama işlemine başlayın.

Çip veya girişlere herhangi bir sıvı dökmemeye dikkat edin, aksi takdirde çip kullanılamaz hale gelecektir. Ardından çipi entegre akışkan devreye veya IFC kontrolörüne yerleştirin ve kontrolörün hazırlama (priming) betiğini çalıştırın. Program başlar başlamaz örnekleri hazırlamaya başlayın.

Pres numuneyi hazırlayarak başlayın. TaqMan, universal master mix ve yükleme reaktiflerinden oluşan bir karışım hazırlayın. Ardından 96 kuyucuklu yükleme formatını kullanarak, yüklenmiş sıvıyı toplamak için her bir numuneden 2,25 µL'yi 2,75 µL pres numune karışımı ile birleştirin. Plakayı kısa süreliğine vorteksleyin ve 4 °C'de hızlıca santrifüjleyin.

Örnek plaka hazırlanmıştır. Şimdi, assay karışımının 13 x konsantrasyonlarını hazırlamak için yeni bir 96 kuyucuklu plaka kullanın. Bu işlem, her kuyucuğa bir evrensel primer, ileri primer ve gene özgü tacman probu karıştırılarak gerçekleştirilir.

1X konsantrasyonları; üniversal ve ileri primer için 1 µM, TaqMan probu için ise 0,2 µM'dur. Ardından, 5 µL'lik nihai kuyucuk hacminde 0,25% Tween nihai konsantrasyonu elde etmek için yeterli miktarda Tween ekleyin. Kabarcık oluşumunu önleyerek iyice karıştırın ve sıvının toplanması için plakayı kısa süreliğine santrifüjleyin.

Bu, analiz plakasıdır. Çipi yükleyerek 96.96 Q-R-T-P-C-R işlemine başlayın. Önce örnekleri, ardından her giriş için final hacmi 5 µL olacak şekilde analizleri IFC'ye yükleyin.

İkinci olarak, örnekleri ve assay'leri çipe yüklemek için yükleme karışımı (load mix) betiğini çalıştırın. Betik tamamlandığında, yüklü çip üzerindeki koruyucu filmi soyun ve yapışkan bant kullanarak çip yüzeyindeki toz parçacıklarını veya kalıntıları temizleyin. Şimdi biyo sistem amplifikasyon programını ayarlayın.

Çipi sisteme yerleştirin ve programı çalıştırın. Sonuçlar; amplifikasyon eğrileri, tüm çip ısı haritaları ve her biri için CT değerleri sağlamak amacıyla fluid dime yazılımı ile analiz edilebilir. Natif poliakrilamid jellerde boyut ayrımıyla saflaştırılmış, wild type DG CR eight ve ER null mutant pre-PCR ürünleri kullanılmıştır.

RNA, önceki protokollerle karşılaştırıldığında farklı şekilde hazırlanmıştır. Saflaştırma adımı sayesinde, hem DGCR8 null hem de ER null arka planlarda daha fazla mikroRNA elde edilmiş ve yalancı pozitif sinyallerin kaybı gerçekleşmiştir. Ayrıca, modifiye edilmiş QR TPCR R yaklaşımı, nadir bulunan D gcr eight bağımsız dicer bağımlı küçük RNA'ların uygun şekilde kategorize edilmesine olanak tanır.

Burada, hastalar ve kontrollerden alınan 48 cera, 384 farklı mikroRNA'nın ekspresyon değişimi açısından taranmıştır. Veriler, kontrollerde bir spike kullanmadan, ilgili medyan çıkarılarak her örnek için normalize edilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, sınırlı miktarda girdi RNA ile başlansa dahi, bir flu line platformu üzerinde multiplex Q-R-T-P-C-R'ın birçok örnekte yüzlerce mikroRNA'yı aynı anda profillemek için nasıl kullanılabileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.