Name: Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Keşfedin FRAP tekniği ile hipokampal nöronlarda EGFP protein hareketliliğini ölçme yöntemini. Bu protokol sinaptik plastisite ve protein dinamikleri araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü (NIDCD) İntramural Programı tarafından desteklenmiştir.

1. Nöron transfeksiyon <ol><li> Poli-d-lizin kaplı Mattek Kültür embriyonik gün 18 (E18) sıçan hipokampal nöron 35 mm cam alt yemekleri 1. (DIV), in vitro 16-18 gün Clontech CalPhos Memeli Transfeksiyon kiti kullanılarak transfect nöronlar. İlk olarak, 1,5 ml kültür ortamı değiştirmek <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Mammalian-Cell-Culture/Classical_Media/dmem.html">Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta</a> transfeksiyon önce 35 mm çanak 0.5 saat başına (DMEM). Daha sonra (adım 1.6) kullanımı için 15 ml steril bir tüp içinde özgün bir kültür ortamı kaydedin. </li><li> Steril H 2 O (Clontech) ve toplam hacmi 100 ul 12.4 ul 2 M kalsiyum solüsyonu (Clontech) ile 10 mg pEGFP-N1 plazmid DNA karıştırın. </li><li> 100 ul 2 adım 1.2) karışımı ekleyin. × HBS damla damla vorteks 2 iken × orta hızda HBS. </li><li> Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika oturup sonra DMEM inkübe nöronlar adım 1.3) son karışımı ekleyin. </li><li> Nöronlar 1-1.5 saat boyunca 37 ° C inkübatör içine geri koyun. </li><li> Kalsiyum fosfat içeren orta çıkarın, sonra hücreleri DMEM üç kez yıkayın. Orijinal bir kültür ortamı ile DMEM orta inkübatör, döviz kültür çanak dönmeden önce. </li></ol> 2. Bir omurga üzerinde sıkı bağlamak deney <ol><li> Nöronlar transfeksiyon 2-4 gün sonra sıkı bağlamak deney için kullanılır. </li><li> (MM) içeren 145 NaCl, KCl 5, HEPES 10, Glikoz 10, Glycine 0.005, CaCl 2, 2.6 ve MgCl önceden ısıtılmış Tyrode Çözüm, hemen ekleyerek, 35 mm cam alt çanak kültür ortamı değiştirin 2 1.3 (7.4 NaOH ile pH değeri ayarlanmış). </li><li> Zeiss LSM 710 konfokal mikroskop sıkı bağlamak deney için kullanılır. Zeiss TempModule sistemi (37 ° C) sıcaklık, nem ve çalışma sistemi, CO 2 (% 5) kontrol etmek için kullanılır. CO 2 tank bağlı ve nem dengeleme için kullanılan su şişesi, su ile dolu olduğunu emin olun. </li><li> 100 × objektif (αplan APOCHROMAT 100 × / 1,46 yağ) ile transfekte olgun dendrit bulun. Çanak transfekte hücreler seyrek istenen bir hücre için, 40 ile arama × hedefi (plan-NEOFLUAR 40 × yağ / 1.3) ve daha sonra 100 geçmek × görüntü yakalamak için objektif. </li><li> Kullanım 5 × optik zoom ve görüntü birkaç dikenleri ile dendrit kısa bir parça için 256 × 256 piksel çözünürlük. Çekim yapmak için, 0.5 saniyede bir tarama bitirmek için gereken nominal hızı 9 (durmak piksel zaman 3.15 μsec) kullanın. Iğne deliği güçlü floresan elde 2μm için ayarlanır. Görüntüleri çekerken, tüm görüntü photobleaching önlemek için, örneğin% 1-5, düşük lazer iletim kullanmayı deneyin. </li><li> Ilgi omurga seçin. Yaptığımız denemelerde, mantar dikenler ~ 1 mikron omurga kafa çapları seçin. </li><li> Sıkı bağlamak deney yapmak için, 488 lazer çizgisi% 50 (15 mW), argon lazer gücü 30 mW [çamaşır suyu, sonra beyazlatma önce% 100 lazer iletim, nominal faiz 10 kez omurga 5 kontrol görüntüleri alabilir ve yaklaşık 3-4 mW 488 lazer çizgisi ile mikroskop ulaşır ve daha sonra, hemen beyazlatma sonra görüntülerin bir seri yakalamak. Bu deneme için, görüntüleri beyazlatma sonra 15 saniye boyunca her 1 saniyede yakalanır. Zaman aralığı, farklı hedefleme proteinler ve farklı deneysel tasarımları (Şekil 1) göre ayarlanmalıdır . </li><li> Görüntüleri kaydetme. </li></ol> 3. Veri analizi <ol><li> ImageJ yazılımı ile görüntüleri açın. </li><li> Ilgi omurga float değildir, böylece ImageJ - (→ → 'çeviri' ve / veya katı cisim '' yığın dilim align 'eklentileri' → 'karıştırma yığınları) hizalamak aracı kullanarak görüntü yığınını hizalayın Diğer bir deyişle bu görüntü üzerinde aynı pozisyonda kalır. </li><li> ImageJ 'Şiddeti v Zaman Monitör' aracı ('eklentileri kullanarak, ilgi (F), omurga, transfekte ama ağartılmamış bölgeye (kontrol) ve zaman atlamalı görüntüler bir arka plan bölgesi (F b) göreceli floresan ölçün '→' yığınlarının - karıştırma '→' Şiddeti v Zaman Monitör '). Kontrol bölgesi, iyi odaklanmış distal dendrit bir parçası olabilir. Arka plan bölgesi, floresan olmayan bir bölgedir. </li><li> Önce (F c0) ve (F c) photobleaching sonra kontrol bölgenin floresan karşılaştırarak photobleaching oranı (r) hesaplayın. r = F / F c0. </li><li> Normale hedef omurganın floresan yoğunluğu (F) aşağıdaki gibi: F = (F - F b) / r </li><li> Eğri bir fazlı üstel GraphPad Prism yazılım denklemi (Şekil 2) veya Othe hedef omurga floresan sığdırmakr da benzer bir yazılım. </li><li> Cep fraksiyonu (f) ve (f i) aşağıdaki denklemler hareketsiz fraksiyonu hesaplayın: f m = F ∞ / F 0, burada F ∞ tam iyileşme sonra floresan ve F 0 photobleaching önce floresan. f i = 1 - f m. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Bu çalışmada, biz olgun hipokampal nöronlar üzerinde sıkı bağlamak deney gerçekleştirir. 18-22 DIV, mantar dikenler zaten oluşur. Bizim yöntemini kullanarak, bir omurga gibi küçük bir bölgede floresan yoğunluğu, dinamik değişimler kaydedilebilir. EGFP floresan kurtarma işlemini analiz etmek, ağartma önce kontrol olarak 5 görüntüler ve daha sonra 15 saniye için ağartma hemen sonra her 1 saniyede 1 resim alır. Görüntünün çözünürlüğü kantitatif analiz için yeterli. Etiketli floresan proteinleri floresan kurtarma profilleri yüksek tekrarlanabilir. Biz de kısaca ImageJ ve GraphPad Prism yazılımı kullanarak bir floresan protein, mobil ve sabit kesirler, nasıl tanımlanacağı göstermektedir. Burada göstereceğimiz sıkı bağlamak yöntem ve analiz geniş nörobilim, hücre biyolojisi ve diğer çalışmalarda kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 bir kültür hipokampal nöron bir omurga EGFP floresan sıkı bağlamak ölçümleri. Kırmızı ok uçları photobleaching zaman gösterir. Fotoğraflar önce aynı bölgede (Ön) temsil eder ve photobleaching 0, 1, 5, 10, 15 saniye sonra. Omurga, kontrol ve arka bölge sırasıyla S, C ve B harfleri ile işaretlenmiş. Nöronlar deney sırasında 37 ° C'de muhafaza edildi. Ölçeği bar, 1 mikron. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 EGFP floresan 15 saniyelik bir süre içinde sıkı bağlamak eğrileri . Yeşil hat orijinal eğrisi gösterir; kırmızı çizgi normalize eğri gösterir. Eğrileri üzerinde nokta sıkı bağlamak, her 1 saniyede göstermektedir. Eğrileri tek fazlı üstel denklemler tarafından takıldı. Photobleaching önce ortalama floresan% 100 olarak sayılmıştır. Bu deneyde, cep fraksiyonu (MF),% 94 ve hareketsiz fraksiyonu (IF)% 6.

<ol><li>Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAP102+is+a+highly+mobile+MAGUK+in+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines.</a> J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).</li>
<li>Grati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+turnover+of+stereocilia+membrane+proteins%3A+evidence+from+the+trafficking+and+mobility+of+plasma+membrane+Ca%282%2B%29-ATPase+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2.</a> J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).</li>
<li>Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+on+Red+Alga+Reveals+the+Fluorescence+Recovery+Is+Ascribed+to+Intrinsic+Photoprocesses+of+Phycobilisomes+than+Large-Scale+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion.</a> PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+with+EosFP+and+other+photoactivatable+marker+proteins+of+the+GFP+family%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family.</a> Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Sprague, B. L., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+analysis+of+binding%3A+proper+and+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FRAP analysis of binding: proper and fitting.</a> Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).</li>
</ol>

In vivo ve in vitro 1-2 çalışmalar sıkı bağlamak analiz geniş kullanılmıştır. Bu teknik yaygın GFP kullanır <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Fusion_protein" title="Füzyon proteini">füzyon proteinleri</a> aynı zamanda kırmızı alg füzyon proteinleri 3 rağmen. Bu analiz, duyarlı ve GFP-etiketli proteinlerin hareketliliği karakterize etmek için kullanılabilir. Anlamlı sıkı bağlamak analiz üretmek için, önce ve sıkı bağlamak deney sırasında gereksiz photobleaching önlemek için önemlidir. Bunu başarmak için iki yol vardır. İlk olarak, arama ve deneysel nöron gözlemlemek süreci hızlı olmalıdır. Özellikle, uzun bir süre 100X amacı ile nöronların gözlem önemli ölçüde floresan beyazlatıcılar. İkincisi, yüksek lazer gücü ve sık sık tarama genellikle photobleaching olasılığını artırır. Bu nedenle, bir kontrol bölgede photobleaching oranını hesaplamak ve ardından deneysel bölgede sıkı bağlamak eğrisi normalleştirmek için gerekli olacaktır. Normalizasyon yöntemi protokol tarif edilmiştir (Detaylar için adım 3,3-3,5 bakınız). Photobleaching adım, aynı zamanda, iyi bir sıkı bağlamak sonuç sağlanması için kritik öneme sahiptir. Bu deneyde, çamaşır suyu,% 100 lazer iletim ilgi 10 kat omurga. Bu durum, çamaşır suyu, sabit bir hazırlık arka plan seviyesi bir omurga floresan yeterli. Böylece, photobleaching sonra 0 saniye arka planı olarak aynı sayıda floresan yoğunluğunu ayarlayın. İlk tarama hızına bağlı olarak, önemli miktarda bir floresan kurtarma zaten ilgi protein son derece mobil tespit olabilir. Birçok floresan protein probları sıkı bağlamak protein dinamiklerini incelemek için geliştirilmiştir. Tamamlayıcı bir yaklaşım photoactivatable GFP (PA-GFP), ya da photoconvertible türevleri, örneğin. Sıkı bağlamak tekniği ile birlikte, bu araçları, canlı hücre görüntüleme çalışmaları 4-6 için vazgeçilmez olma .

<table><tbody><tr><td>35 mm cam tabanlı kaplar</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35GC-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>CalPhos Memeli Transfeksiyon Kiti</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 plazmidi</td><td>Clontech Laboratories</td><td>6085-1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss konfokal mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss TempModule sistemi</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>National Institutes of Health</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism yazılımı</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr></tbody></table>

kültür hipokampal nöronlar dendritik spine floresan takip edilen proteinler photobleaching sonra floresan kurtarma (sıkı bağlamak)

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Sıkı bağlamak GFP etiketli proteinler hareketliliği ölçmek için kullanılır olmuştur. , Güçlü bir uyarım lazer kullanarak, bir GFP etiketli proteinin floresan ilgi bölgede ağartılmış. Bölge bölge dışından ağartılmamış GFP etiketli protein ilgi bölgeye yayılır floresan kurtarır. Protein hareketlilik floresan iyileşme oranı ölçerek analiz edilir. Bu teknik, protein hareketlilik ve devir hızı karakterize etmek için kullanılabilir. Bu çalışmada, kültür hipokampal nöronlarda (gelişmiş yeşil flüoresan protein) EGFP vektör ifade eder. Zeiss 710 konfokal mikroskop kullanarak, tek bir omurga GFP proteinin floresan sinyal photobleach ve sonra photobleaching sonra floresan kurtarma kaydı zaman atlamalı görüntüleri çekmek. Son olarak, ImageJ ve GraphPad yazılımları kullanarak görüntüleme verileri analiz ederek, dikenler, GFP mobil ve sabit kesirler yüzdesi tahmin ediyoruz. Bu sıkı bağlamak protokolünün yanı verilerini analiz etmek için nasıl bir temel sıkı bağlamak deneyi gerçekleştirmek için nasıl gösterir.

Sıkı bağlamak, Yeşil Floresan Protein (GFP) etiketli kültür hücreleri proteinlerin hareketliliği ölçmek için kullanılır olmuştur. Biz photobleaching sonra floresan kurtarma yüzdesi analiz ederek, GFP mobil / hareketsiz kesirler inceledi. Bu çalışmada, sıkı bağlamak hipokampal nöronlar, dikenler yapıldı.

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

FRAP, GFP etiketli proteinlerin hareketliliğini nicelendirmek için kullanılmıştır. Güçlü bir eksitasyon lazeri kullanılarak, GFP etiketli bir proteinin floresansı ağartılır...

Bu prosedürün genel amacı, ilgi bölgesindeki proteinin FRAP'ını ölçerek geliştirilmiş yeşil floresan proteinin mobilitesini belirlemektir. Bu işlem, öncelikle kültürlenmiş sıçan hipokampal nöronlarına EGFP vektörünün transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, Zeiss 710 konfokal mikroskop kullanılarak ilgi duyulan bir dikende FRAP kaydı yapılır.Fotobeyazlama hızı daha sonra Image J ve GraphPad Prism yazılımları kullanılarak hesaplanabilir. Nihayetinde, konfokal mikroskopi aracılığıyla kültürlenmiş bir hipokampal nöronun dikenindeki EGFP hareketliliğini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu protokol, Chazen'in benimle, Ronald Pet ile, ayrıca Ya, Wang Bahar Kisha ve orijinal makalenin Ekim 2009'da vefat eden kıdemli yazarı Robert Ol ile iş birliği içinde geliştirilmiştir.Bu videoyu onun anısına ithaf ediyoruz. Bu yöntem, protein dinamiği alanındaki, ilgilenilen bir bölgedeki hedef proteinin döngü hızı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre, embriyonik 18. gün sıçan hipokampal nöronlarını poly-D-lysine kaplı mattec 35 milimetrelik cam tabanlı kaplarda kültüre ederek başlayın; nöronları in vitro 16 ila 18. günlerde, transfeksiyona başlamadan önce Clone Tech CalFoss memeli transfeksiyon kiti kullanarak transfekte edin.Orijinal kültür ortamını daha sonra kullanmak üzere steril 15 milliliter'lik bir tüpe kaydedin. Transfeksiyondan 30 dakika önce, her bir 35 millimeter'lik petri kabını 1.5 milliliters DOL eco modifiye eagle ortamı ile doldurun. Ardından, 10 micrograms P-E-G-F-P-N one plazmid DNA'sını 12.4 microliters iki molar kalsiyum çözeltisi ile birleştirin ve toplam hacmi steril su ile 100 microliters'e tamamlayın.DNA karışımını, 100 µL'lik 2x fosfat tamponlu saline çözeltisine DAMLA DAMLA ekleyin. Her damla eklendikten sonra tamponu vorteksleyin. Nihai karışımı oda sıcaklığında 20 dakika beklettikten sonra, tamponlu DNA çözeltisini DMEM içinde inkübe edilen nöronlara ekleyin.Nöronları 37 °C'de bir ila bir buçuk saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, kalsiyum fosfat içeren ortamı kültür kaplarından uzaklaştırın ve hücreleri DMEM ile yıkayın. DMEM yıkama işlemini toplamda üç kez tekrarlayın.Hücreleri inkübatöre geri koymadan önce DMEM besiyerini orijinal kültür besiyeri ile değiştirin. Nöronlar, transfeksiyondan iki ila dört gün sonra fraksiyona yönelik deney için kullanılır. Başlamak için, 35 milimetrelik cam tabanlı kaptaki kültür besiyerini derhal önceden ısıtılmış Tyro çözeltisi ile değiştirin.Kırılma deneyi için bir Zeiss LSM 710 konfokal mikroskop kullanılır. Zeiss sıcaklık modül sistemi; çalışma sisteminin sıcaklığını, nemini ve karbon dioksit yüzdesini sabit tutar. Karbon dioksit tankının bağlı olduğundan ve nem dengeleme için kullanılan su şişesinin dolu olduğundan emin olun.Mikroskop kurulduktan sonra, 100 x objektif ile transfekte edilmiş, olgun bir dendrit bulun. Eğer kapçık içindeki transfekte hücreler seyrekse, 40 x objektif ile istenen hücreyi arayın. Ardından 100 x objektife geçiş yapın.Görüntüleri yakalamak için 5x optik zoom ve 256 x 256 piksel çözünürlük kullanın. Birkaç spinal yapısı içeren kısa bir dendrit parçasını görüntüleyin. Görüntü yakalama işlemi için, 0,5 saniye süren nominal hız dokuzu kullanın.Taramayı tamamlamak için, güçlü floresans elde etmek amacıyla pinhole ayarını iki mikrometreye getirin. Görüntüler alırken, tüm görüntünün fotobeyazlamasını önlemek için örneğin %1 ila %5 gibi düşük lazer iletimi kullanmaya çalışın. Ardından, bu deney için ilgili spinal bölgeyi seçin.Sarma deneyi gerçekleştirmek için yaklaşık bir mikrometre diken baş çapına sahip mantar dikenler seçilir. Ağartma işlemi öncesinde beş kontrol görüntüsü alın, ardından ilgilenilen dikeni nominal %100 lazer iletiminde 10 kez ağartın ve ağartma işleminden hemen sonra bir dizi görüntü yakalayın. Zaman aralığı, farklı hedef proteinlere ve farklı deneysel tasarımlara göre ayarlanmalıdır.Bu deney için, beyazlatma işleminden sonra 15 saniye boyunca her saniyede bir görüntü alınır. Ardından, verileri analiz etmek için görüntüler kaydedilir. Görüntüler Image J yazılımı ile açılır ve ilgilenilen spinal bölgenin kaymaması ve aynı konumda kalması için hizalama aracı kullanılarak görüntü yığını hizalanır.Görüntü üzerinde, transfekte edilmiş ancak ağartılmamış bir bölge olan ilgili dikenin göreceli floresans yoğunluğunu ölçün. Zaman atlamalı görüntülerdeki arka plan bölgesini, ImageJ'in yoğunluk-zaman izleme aracıyla ölçün. Arka plan bölgesi olarak floresan içermeyen bir bölge kullanın; floresan yoğunluğunu GraphPad Prism yazılımında veya benzeri bir yazılımda tek fazlı üstel bir denklemle eğriye uydurun. Son olarak, floresansın mobil ve immobil fraksiyonlarının yüzdesini hesaplayın.Kültürlenmiş bir hipokampal nöronun dikeninde EGFP floresansının FRAP ölçümleri burada verilmiştir. Diken kontrol bölgesi ve arka plan işaretlenmiş olup, kırmızı ok ucu fotobezleme zamanını göstermektedir. Aynı bölgenin fotoğrafları, fotobezlemeden önce ve fotobezlemeden sonra 0, 1, 5, 10 ve 15. saniyelerde çekilmiştir.EGFP floresansının FRA eğrileri 15 saniyelik bir süre boyunca gösterilmiştir ve eğriler üzerindeki noktalar her saniyedeki FRA değerini temsil etmektedir. Eğriler tek fazlı eksponansiyel denklemlerle uydurulmuştur. Fotobeaching öncesindeki ortalama floresans %100 olarak kabul edilmiştir. Bu deneyde, mobil fraksiyon %87 ve immobile fraksiyon %13'tür.Bu videoyu izledikten sonra, FRAPPE tekniğini kullanarak GFP etiketli bir proteinin mobilitesinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

fluorescence-recovery-after-photobleaching-frap-fluorescence-tagged

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu yazıda, photobleaching sonra çok foton floresan kurtarma kullanarak difüzyon katsayıları ölçmek için prosedür anlatacağız. Biz örnek optik yol boyunca lazer hizalayarak ve uygun deneysel parametrelerin belirlenmesi ile başlayacak, daha sonra devam üreten ve nihayet uydurma floresan kurtarma eğrileri.

İki foton Floresan Kurtarma üzerinden Photobleaching sonra Difüzyon Katsayıları Ölçüm

Biz Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak) ve embriyonik kök hücreleri (ES) kromatin protein dinamiklerini izlemek için (FLIP) Photobleaching Floresan kaybı da dahil olmak üzere photobleaching yöntemleri açıklanmaktadır. Kromatin plastisite çalışma araçlarının biri olarak kabul edilir Kromatin protein dinamiği, pluripotent hücreler geliştirilmiş.

Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

Çok sayıda yeni çalışmalar sinaptik proteinlerin beyin patolojileri ile ilişkili mutasyonlar belirledik. Primer kültür kortikal nöronların dendritik omurga morfoloji ve motilite bu hastalıkla ilişkili proteinlerin etkilerini inceleyen büyük esneklik sunar.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Bu rapor yüzey ekspresyonu, ulaşım yolları ve dışsal olarak ifade edilen, pH-duyarlı GFP-etiketli nöronların plazma membran proteinlerinin kaçakçılığı kinetik belirlemek için canlı hücre görüntüleme ve photobleach tekniklerinin kullanımı anlatılmaktadır.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Fonksiyonel sinir terminallerinin sinaptik vezikül görüntü geri dönüşüm için stiril FM boyaların kullanımını tarif eder. Bu protokol, sadece uyarılmış için değil, aynı zamanda doğal ve minyatür sinaptik faaliyetleri uygulanabilir. Protokol etkili değerlendirilebilir sinaptik olayların çeşitli genişletir.

Uyarılmış, Spontan ve Minyatür Synaptic Faaliyetleri Sırasında FM boyalar kullanarak sinaptik vezikül Geri Dönüşüm Sınavı

Sinaptik vezikül endositoz sinaptik vezikül protein ile erimiş pHluorin ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu vezikül Alım tarafından algılanır.

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Arka plan autofluorescence biyolojik örneklerin kez Floresans tabanlı görüntüleme teknikleri, özellikle yaşlı insan postmitotic doku zorlaştırmaktadır. Bu protokolü nasıl autofluorescence bu örnekler üzerinden etkin bir şekilde kaldırılabilir açıklar bir ticari olarak mevcut ışık yayan diyot ışık kullanarak örnek immunostaining önce photobleach için kaynak.

İnsan beyninin Formalin sabit bir doku arka plan Floresans ayirt mikroskopi için basit ortadan kaldırılması

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Sonra hücreleri ile photobleaching deneyler canlı Floresans kurtarma için kapsamlı ve pratik iletişim kuralı açıklar. Her ne kadar sarı floresan protein etiketli p62 aggresome benzeri indüklenen yapılarda hareketliliğini ölçmek için kullanılan protokol, çeşitli mikroskobu sistemleri ve floresan proteinler için uygulanabilir.

Photobleaching, sarı floresan Protein etiketli p62 indüklenen Aggresome benzeri yapılarda sonra Floresans kurtarma

Keşfedin FRAP tekniği ile hipokampal nöronlarda EGFP protein hareketliliğini ölçme yöntemini. Bu protokol sinaptik plastisite ve protein dinamikleri araştırmalarına katkı sağlar.

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak) (Video) | JoVE Journal

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

Daha fazla video keşfet