Name: Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Öğrenin, gelişmekte olan zebra balığı ön beynindeki bireysel sinir progenitör hücrelerinin canlı görüntülenmesi için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi yöntemini. Bu teknik, sinir gelişim mekanizmalarını in vivo düzeyde anlamayı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma theNIH grantNS042626 tarafından desteklenmiştir. Biz Kurt Thorn UCSF Nikon Görüntüleme merkezi ve görüntüleme ile yardım için teşekkür ederim.

1. Zebra balığı Embriyolar hazırlanması <ol><li> Elektroporasyon İki gün önce, çiftleşme kafesleri ayrı kadınlarda erkeklere bölücüler kullanarak vahşi tip balık kurdu. </li><li> Elektroporasyon bir gün önce, önceki günden itibaren kafeslerde çiftleşme bölücüler çekin. </li><li> Embriyolar toplayın ve 28.5% 0.003 phenylthiourea (PTU) içeren 30 ml embriyonik orta ° C 50 döllenmiş embriyolar inkübe </li><li> Elektroporasyon gününde, dechorionate elle embriyoların 22hpf gelişimsel aşaması ulaşmak ince forseps (Inox 5, Dumont Elektronik, İsviçre) ile embriyoların. Sonra PTU% 0.003 içeren 10ml elektroporasyon ringer 3 (180 mM NaCl, 5mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2) embriyolar transfer. </li><li> Zil sesi embriyoların uyutmak için 10ml elektroporasyon 420 ul tricaine stoku (4mg/ml) ekleyin. </li></ol> 2. Elektroporasyon için hazırlanması <ol><li> Cam enjeksiyon iğneleri Flaming-Brown P897 çektirmesi (Sutter Instruments, Novato, CA, USA) kılcal damarlar (filament 1.2 mm OD, 0.9 mm ID) çekilmiştir. Rakam 1D gösterildiği gibi iğne ucu keskin bir ucu almak için forseps ile kırıldı. Ucunun çapı yaklaşık 10 mikron olmalı ve konik açısı 30 derece civarında olmalıdır. </li><li> % 0.8 'hazırlayın ve elektroporasyon ringer solüsyonu% 1 düşük erime noktası agaroz (Shelton Scientific, Inc. Katalog # IB70050). Kısım 2 ml mikrosantrifüj tüpler agaroz çözüm. ~ 37 ° C'de ısı bloğu alikotları tutun </li><li> Gal4/UAS sistemi, electroporated embriyoların nöral progenitör hücrelerin gen ekspresyonu sürücü kullanılır. İki plazmid kullanılır: Gal4FF her yerde organizatörü EF1α tarafından tahrik edildiği plazmid EF1α GFF-PT2KXIG, ve plazmid UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG. </li><li> EF1α-GFF-PT2KXIG ve UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG plazmid DNA GenEluteTM HP Plazmid Midiprep Kiti (Sigma) kullanarak hazırlayın. </li><li> Plazmid sonra 1-2 mg / ml 10 mM Tris · Cl final konsantrasyonu (pH 8.5) sodyum asetat / etanol yağış yoğunlaşmıştır. </li><li> Iki plazmid karıştırın ve her plazmid için 500 ng / ml bir final konsantrasyon nükleaz ücretsiz H2O ile seyreltilir. Çözümü için fenol kırmızısı (1 / 10 toplam hacmi seyreltilmiş) eklenmesi teslimat görünüm için tercih edilir. DNA çözümü buz üzerinde tutun. </li><li> 2 ul DNA çözümü ile elektroporasyon, backload bir iğne sağ öncesi ve enjeksiyon hacmi 2 nl ayarlayabilirsiniz. </li></ol> 3. Elektroporasyon <ol><li> A Stero diseksiyon mikroskobu (Zeiss 50x maksimum büyütme STEMI 2000), bir hava basıncı enjektör (Narishige IM 300 mikroenjektör), iki mikromanipülatörler (TEFE M3301R, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL, ABD), ve elektrik stimülatörü (SD9 Şekil 1A gösterildiği gibi kare dalga Stimülatörü, Çim Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, ABD) kurulur. </li><li> % 1 düşük erime noktası agaroz embriyolar batırmayın 2 embriyolar monte etmek için. Sonra hemen bir cam pipet ile agaroz embriyolar kaldırmak. </li><li> Embriyolar agaroz bireysel damla ters bir plastik Petri kabı kapağının üzerine koyun. Agaroz önbeyin elektrotlar ve mikroenjeksiyon iğnesi (Şekil 1B) erişilebilir olduğunu katılaşır önce lifli bir prob ile dorsal pozisyonda yavaşça embriyolar yolunuzu. Embriyolar bireysel agaroz damla monte edilmelidir. </li><li> Sol mikromanipülatör ile elektrotlar işleyin. Agaroz içine elektrotlar Şekil 1B gösterildiği gibi yerleştirin. Özel platin iridyum 125 mm çap ve 500 mm aralıklı paralel bipolar elektrotlar dışında elektroporasyon (FHC, katalog # PBSA0575) için kullanılır. </li><li> Kırmızı sıvı akan ve ventrikül şişme görülebilir, ön beyin ventrikül içine mikroenjeksiyon iğnesi takın ve 4NL DNA karışımı enjekte edilir. </li><li> Hemen bir 28.5 V darbe ömürlü 1 milisaniyelik elle uygulandı. Sonra ters polarite ve birden fazla 28.5 V darbe kalıcı 1 milisaniye geçerlidir. Bu ikili mozaik etiketleme önbeyin nöral progenitör hücrelerin neden olacaktır. </li><li> 10 embriyoların elektroporasyon sonra, embriyolar serbest bırakmak için bir mikrocerrahi bıçakla embriyolar kapak ve agaroz soyma 5ml embriyonik orta ekleyin. </li><li> 28,5 az% 0.003 PTU ve inkübe içeren 30 ml embriyonik orta taze bir çanağı ° C electroporated embriyolar transfer </li></ol> 4. Montaj ve zaman atlamalı Canlı Görüntüleme <ol><li> Elektroporasyon sonra yaklaşık 4 saat, eğer bir epifluorescent diseksiyon mikroskobu altında incelendi EGFP sinyal gözlemlenebilir. </li><li> Elektroporasyon beş saat sonra, son derece mozaik değil, ön beyin bölgede güçlü EGFP ifade ile embriyolar seçin. </li><li> % 0.003 PTU içeren 10ml embriyonik orta seçilen embriyolar transfer. </li><li> 10ml embriyonik orta t 420 ul tricaine stoku (4mg/ml)o embriyoların uyutmak. </li><li> Embriyoların monte etmek için,% 0.8 düşük erime noktası agaroz 1 embriyo batırmayın. Sonra hemen bir cam pipet ile agaroz embriyo kaldırmak ve 35mm cam alt kültür çanak merkezi (Mattek şirketi, Part # P35GC-1.5-10-C, embriyo <a href="http://www.glass-bottom-dishes.com/">www.glass-alt-dishes.com</a> ) . </li><li> Agaroz katılaşır önce dorsal-yukarı konumda lifli bir prob hafifçe embriyolar yolunuzu. </li><li> Konfokal mikroskop sıcaklık kontrollü sahnede çanak düzgün şekil 1C (sağ-üst hedefleri ile Nikon C1 spektral konfokal mikroskop kullanımı) gösterildiği gibi yerleştirin. 28.5 için sıcaklığını ayarlamak ° C </li><li> Ekle 3ml 28.5 ° C embriyo kapsayacak şekilde PTU% 0.003 içeren embriyonik önceden ısıtılmış orta. Embriyo artık görüntüleme için hazırdır. </li><li> Su daldırma amacı kullanarak sabit bir aralığı ile zaman atlamalı canlı görüntüleme gerçekleştirin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 2'de gösterildiği gibi 22 hpf EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP electroporated embriyonun bir zaman atlamalı konfokal canlı görüntüleme kare seçilir. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Aparatı set-up. (A) elektroporasyon ekipmanların montaj: Çim SD9 kare dalga Stimülatörü (i), (ii) sol mikromanipülatör, elektrotlar (iii), (iv), (v) bir iğne, sağ mikromanipülatör Zeiss diseksiyon mikroskobu (vi) ve Narishige IM 300 mikroenjektör (vii). (B) elektrotlar (i), ön beyin ventrikül (ii) ve enjeksiyon iğnesi (iii) göreli konumunu. Kırmızı renkli DNA çözüm, ön beyin ventrikül içine enjekte edilmiştir. (C) Nikon C1 konfokal mikroskop canlı görüntüleme montaj: sıcaklık kontrolörü (i) su objektif len (ii) ve cam bir alt kültür çanak (iii) (D düşük erime noktası agaroz gömülü electroporated embriyo daldırma DNA mikroenjeksiyon için çekti ve kesilmiş iğne). <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 22 hpf EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP electroporated embriyonun 18 saatlik zaman atlamalı konfokal canlı görüntüleme Seçilmiş kareleri. Ventrikül yüzeyi her görüntü çerçevesinin alt tarafta. Ölçek çubuğu 10 mm temsil eder.

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li>
<li>G#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li>
<li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+methods+for+in+vivo%2C+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish%3A+a+new+tool+to+study+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li>
</ol>

Bu video, zaman atlamalı, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bir klonal düzeyde nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz genetik ve floresan etiket bireysel nöral progenitör hücrelerin test edilmiş ve mevcut elektroporasyon protokolleri 4-6 değiştirilmiş. Klonal olarak ilişkilidir döl hücrelerinin oluşan bir soy ağacı sadece birkaç hücre seyrek elektroporasyon göreceli düşük voltaj ile etiketlenmiş beri kurulabilir. EGFP ek olarak, nöral progenitör hücreleri subcell...

gelişmekte olan zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir sinir progenitör hücreler zaman atlamalı canlı görüntüleme

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Bölünme, göç ve nöral progenitör hücrelerin farklılaşma hassas kalıpları, uygun bir beyin gelişimi ve işlevi 1,2 için çok önemlidir. In vivo ortamda karmaşık nöral progenitör hücrelerin davranışını anlamak için, sağlam bir beyin nöral progenitör hücrelerin zaman atlamalı canlı görüntüleme eleştirel gereklidir . Bu video, in vivo önbeyin nöral progenitör hücrelerin gelişimini görselleştirmek için zebrafish embriyoların benzersiz özellikleri istifade eder. Biz genetik ve seyrek etiket bireysel nöral progenitör hücrelerin elektroporasyon kullanın. Kısacası, DNA floresan belirteçler için kodlama yapıları, 22 saat sonra döllenme (hpf) zebrafish embriyolar ve elektrik bakliyat hemen teslim edildi önbeyin ventrikül içine enjekte edildi. Altı saat sonra, electroporated zebrafish embriyoların cam alt kültür yemekleri, düşük erime noktası agaroz ile monte edilmiştir. Floresan ile işaretlenmiş nöral progenitör hücreler daha sonra suya daldırma objektif lens kullanarak konfokal mikroskop altında sabit aralıklarla 36hours için görüntülenmiştir. Bu yöntemi, ön beyin nöral progenitör hücrelerin in vivo gelişiminde içgörüler kazanmak için bir yol sağlar ve Zebra balığı embriyonun merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerinde uygulanabilir .

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.<em&gt; In vivo</em&gt; Önbeyin klonal bir seviyede nöral progenitör hücrelerin gelişimini analiz bu şekilde elde edilebilir.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Nöral progenitör hücrelerin bölünme, göç ve farklılaşma süreçlerinin kesin paternleri, beynin uygun gelişimi ve işleyişi için kritik öneme sahiptir1,2. ...

Bu deneyin amacı, zebra balığı embriyolarının zaman ayarlı canlı görüntülemesi yoluyla, bireysel ön beyin nöral progenitör hücrelerinin in vivo gelişimini gözlemlemektir. Bu işlem, seyrek konumlandırılmış ön beyin nöral progenitör hücrelerini işaretleyen floresan markörleri kodlayan DNA konstrüktlarının elektroporasyonu ile gerçekleştirilir. Elektropore edilen embriyolar anestezi altına alınarak düşük erime noktalı agaroza gömülür ve zaman ayarlı konfokal mikroskopi ile görüntülenir.Sonuçlar, belirli bir ön beyin nöral progenitör hücresinin in vivo gelişimini göstermektedir. Bu yöntem, ön beyin nöroprogenik hücrelerin in vivo gelişimine dair içgörü sağlayabilir. Ayrıca membran, beyin ve omurilik gibi merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerine de uygulanabilir.Bu yöntemin veya tek hücre evresi DNA veya RNA enjeksiyonu gibi mevcut yöntemlerin temel avantajı, herhangi bir gelişimsel zaman noktasında tam olarak hedeflenen ilgi alanına odaklanabilmesidir. Bu protokol, planlanan elektroporasyonun bir gün öncesinde başlar. Sabah saatlerinde, çiftleşmiş zebra balıklarından 50 döllenmiş embriyo toplayın; embriyoları phenylthiourea veya PTU içeren embriyonik ortamda yıkayın ve daldırılmış em

time-lapse-live-imaging-clonally-related-neural-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon teknikleri verilmektedir. Time-lapse görüntüleme ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için...

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Kaynak: Williams, A. L.,  et al. Gelişimi Gerçek Zamanlı Olarak Görselleştirmek için Çoklu Foton Hızlandırılmış Görüntüleme: Zebra Balığı Embriyolarında Göç Eden Nöral Krest Hücrelerinin Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, bir zebra balığı embriyosundaki nöral krest hücrelerinin göçünü gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlükte görselleştirmek için çok fotonlu hızlandırılmış bir görüntüleme protokolünü göstermektedir.

Çoklu Foton Zaman Atlamalı Görüntüleme Kullanarak Bir Zebra Balığı Embriyosunda Nöral Krest Hücre Göçünü Görselleştirme

Zaman atlamalı konfokal görüntüleme embriyo gelişimini karakterize etmek için yararlı olan bir güçlü bir tekniktir. Burada, yöntemini açıklar ve iskeletsel vahşi tür morfolojilerinden yanı sıra, PDGFRA, smad5 ve smo mutant embriyolar karakterize eder.

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

In vivo görüntüleme sinir sistemi gelişiminin altında yatan hücresel mekanizmaları araştırmak için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Burada zebra balığı embriyonik beynini larva ve çocuk evrelerine kadar in vivo olarak görüntüleyen bir yöntem sunuyoruz. Elektrofizyolojik yaklaşımlardan uyarlanan bu mikroinvaziv prosedür, olgun nöronun hücresel ve hücre altı ayrıntılarına erişim sağlar ve beyin fonksiyonu ve ilaç müdahalesini karakterize etmek için optogenetik ve nörofarmakolojik çalışmalarla birleştirilebilir.

Kafatası ve Deri Temizleme ile Uyanık Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun In vivo Görüntülemesi

Burada, yetişkin zebra balıklarının dorsal ön beyninde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme yapmak için bir protokol sunuyoruz.

Davranan Yetişkin Zebra Balıklarında Ön Beyin Aktivitesinin İki Fotonlu Kalsiyum Görüntülemesi

Gelişmekte olan zebra balığı optik tektumunda mikroglia hücrelerinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için hızlı taramalı konfokal mikroskopiden yararlanan ve bu hücrelerin dinamiklerinin in vivo analizine olanak tanıyan bir yöntem gösteriyoruz.

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Öğrenin, gelişmekte olan zebra balığı ön beynindeki bireysel sinir progenitör hücrelerinin canlı görüntülenmesi için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi yöntemini. Bu teknik, sinir gelişim mekanizmalarını in vivo düzeyde anlamayı sağlar.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Daha fazla video keşfet