Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücre floresan mikroskopi yöntemiyle, kültürlenmiş nöronlarda mitokondriyal transportun uzun süreler boyunca görselleştirilmesidir. Bu işlem, öncelikle kültürlenmiş nöronlardaki mitokondrilerin organel hedefli bir floresan proteinle işaretlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise, kontrol koşulları altında mitokondriyal transport görüntülerinin elde edilmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı, serotonin gibi nöromodülatörlerin akut uygulamasının ardından mitokondriyal transportun zaman ayarlı (time-lapse) görüntü serilerinin elde edilmesidir. Prosedürün son adımı ise elde edilen zaman ayarlı görüntü serilerinin analizinin gerçekleştirilmesidir. Nihayetinde, nörotransmitterlerin mitokondriyal transportu modüle ettiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu sonuçlar, yalnızca nöronlardaki floresan işaretli mitokondrilerin uzun süreler boyunca görüntülenmesiyle elde edilir. Bu yöntemin, canlı boya işaretlemesi veya GFP'nin geçici transfeksiyonu gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı, sağlıklı kültür nöronlarında mitokondriyal taşımanın uzun süreli gözlemlerini gerçekleştirmeyi mümkün kılmasıdır. Sabit ısıtılmış ve nemlendirilmiş bir ortam sağlamak amacıyla bu prosedürü, laboratuvarımdan yardımcı araştırmacı Chen uygulamalı olarak gösterecektir.

Sahne üstü inkübatör, standart bir doku kültürü inkübatörüne kapalı bir devre ile bağlanmıştır; 35 milimetrelik cam tabanlı kültür kapları için kullanılan A-P-F-T-E membran kapak, nöronal kültür ile inkübatör içindeki ortam arasında gaz değişimine olanak tanır. Bunlar ve diğer özellikler birlikte, kültüre edilmiş nöronların çeşitli deneysel koşullar altında uzun süreli gözlemlenmesini sağlar. Mito turbo red proteini eksprese eden kültüre edilmiş hipokampal nöronları içeren kültür kabını bir doku kültürü steril kabinine transfer edin.

Plastik kapağı PFTE membran kapakla değiştirin ve kültür kabını mikroskoba taşıyın. İnkübatör tabanını mikroskop tablasına klipsleyin ve ardından membran kaplı kültür kabını dikkatlice yerleştirin. Gömülü açıklıkta, inkübatör muhafazasını inkübatör tabanındaki çelik direklerle hizalayın ve muhafazayı tabanın üzerine indirin.

Kasa ile taban arasında iyi bir sızdırmazlık sağlanana kadar başparmak vidalarını sıkın. Görüntüleme yazılımını açmadan önce mikroskop filtre tekerleği kontrol cihazını, ışık kaynağını ve CCD kamerayı açın. Bu protokolde görüntüleme için beş numaralı lam kullanılır.

63x yağ daldırma objektifine geçiş yapın ve objektif taretini indirin. Objektifin yüzeyine dikkatlice daldırma yağı uygulayın. Araç çubuğundaki odak penceresi simgesine tıklayın ve lamba sürgüsünü hareket ettirerek parlak alan lambasını açın.

Işık yoğunluğunu ayarlamak için okülerleri kullanarak bir hücre alanına odaklanın ve ilgilenilen bir hücre bulun. Mikroskop sekmesi altından XI üç filtreyi seçin, mito turbo red proteini ile işaretlenmiş hücrelerdeki mitokondriler için odak düzlemini bulun ve ardından CCD kameraya geçiş yapın. Araç çubuğundaki görüntü yakalama simgesine tıklayarak, 100 milisaniyelik bir başlangıç pozlama süresi ile işleme başlayın.

Yakalama penceresindeki test ve en iyi (best) butonlarını kullanarak optimum pozlamayı bulun. Yakalama türü kutusunun altında, zaman atlamalı (time-lapse) seçeneğini işaretleyin ve zaman atlamalı yakalama seçenekleri altından istenen görüntüleme aralığını ve görüntüleme oturumu süresini seçin.

Yakalama penceresinin sağ alt kısmındaki başlat düğmesine tıklayarak zaman ayarlı görüntüleme işlemini başlatın. Bir kontrol görüntüleme oturumu gerçekleştirdikten sonra, sahne üstü inkübatörün üst kısmındaki enjeksiyon portları aracılığıyla nörotransmitterleri veya diğer reaktifleri uygulayın. Serotonin reseptör agonisti 8-OH-DPAT eklendiğinde, ok başı ile belirtilen ve önceden hareketsiz olan mitokondriler hipokampal nöronun aksonu boyunca hareket eder.

Serotonin eklenmeden önce bireysel mitokondrilerin ortalama hızı ve yönelimi özetlenmiştir. Mitokondrilerin çoğunluğu durağandır; ancak serotonin eklemesinden sonra, mitokondrilerin %42'si artık yönlü hareket sergilemekte ve serotonin yokluğunda yönlü hareket sergileyenlere göre daha uzak mesafeler katetmektedir. Aksine, dopamin eklenmesinin ardından, bu prosedürün takibindeki bir görüntüleme oturumunun son 15 dakikasında mitokondrilerin %92'si durağandır.

Ek soruları yanıtlamak amacıyla birden fazla sinyali izlemek için diğer yöntemler uygulanabilir. Örneğin, nöronlardaki kalsiyum aktivitesi ile mitokondriyal transportun birbiriyle nasıl ilişkili olduğu incelenebilir.