Name: Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Öğrenin neokortikal organotipik dilim hazırlama ve piramidal nöronlardan elektrofizyolojik kayıt tekniklerini. Genetik manipülasyon sonrası iyon kanalı davranışlarını incelemek için kullanılan bu yöntem, transfeksiyon sonrası nöron özelliklerinin korunduğunu gösterir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, üstün teknik yardım için Mayumi Sakuraba ve Rebecca Foehring teşekkür etmek istiyorum. Buna ek olarak, Dr teşekkür etmek istiyorum. Rodrigo Andrade transfeksiyon için cDNA yapıları bize sağlamak için Organotipik dilim kültür ve Biyolistik transfeksiyon protokolleri ve Dr. Jeanne Nerbonne uygulanmasında yardım için. NS044163 NINDS (RCF): Bu çalışma NIH hibe tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li>
<li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li>
<li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li>
<li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+Abstr%22%5BJournal%5D)">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
<li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz sıçan neokorteks (4, 9-11) piramidal nöronlar voltaj bağımlı potasyum kanalları ifade ve işlevsel roller eğitim görüyor. Çünkü bu kanallar için özel farmakolojik ajanların eksikliği, kanal ifade (1,14,15,17-19) işlemek için genetik bir yaklaşım kullanır. Hücre morfolojisi ve korteks laminer düzenini korumak için Stoppini ve ark (16) yaklaşım değiştirilmiş. Organotipik kültür hazırlanması (12,13,15-22; 5-8 2,3) kullanır. Biz 6-17 postnatal gün akut neokortikal dilim izole ve 2-7 gün boyunca kültür d...

Cerrahi / transfeksiyon / kültür: <ol><li> Beyin Dilimleme: Chipping Vibroslice # MA572 Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL, Amerika Birleşik Devletleri </li><li> Gene Silah Sistemi: Bio-Rad, Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Sürücü, Hercules, CA 94.547) <ul><li> Gen tabancası, regülatör, tüp hazırlık istasyonu (165-2418), şırınga kiti, Tefzel tüp, boru kesici, optimizasyon kiti (165-2424), boru kesici ile helyum hortum montaj dahil </li><li> Bio-Rad Helyum Regülatörü (165-2413) </li><li> tek kullanımlık malzemeler Bio-Rad Helios: <ul><li> 1.6 mikron altın Microcarriers: # 165-2264 </li><li> Tefzel Boru: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> Kuluçka: Forma Bilimsel model # 3110 (Termo-Bilimsel: (866) 984 - 3766). </li></ol> Medya: <ol><li> At Serum: Hyclone donör at # SH 30.074. (HyClone, 925 Batı 1800 Güney, Logan, UT 84.321) </li><li> HMEM (Minimal Essential Medya artı HBSS ve Hepes, glutamin: Lonza BioWhittaker Katalog # 12-137F): Gibco / Invitrogen, (800) 955 - 6288, 1. Seçenek. </li><li> HBSS (Gibco Hanks, # 24.020-117 tamponlu tuz): Gibco / Invitrogen, (800) 955 - 6288, Seçenek 1. </li><li> MEM (Gibco asgari temel, orta, 12.360-038), Gibco / Invitrogen, (800) 955 - 6288, Seçenek 1. </li><li> 250 ml Millipore 0.2 mikron filtre: # SC6PU02RE </li><li> Plastik Transfer pipet: Fisher # 13-711-20. </li><li> 50 ml Millipore steriflip 0.22 mikron filtre (# SCGP00525) </li></ol> Elde edilen: Fisher Scientific, 1241 Büyükelçisi Blvd, PO Box 14.989, St Louis, MO 63.132 Öğeler 6-8. Kayıt: <ol><li> Pipetleyin cam: Harvard GC150TF-10: 84 Ekim Hill Road, Holliston, Harvard Apparatus, Massachusetts 01.746 </li><li> Sutter P-87 yatay elektrot çektirmenin: Sutter Instrument Company, Bir Dijital Sürücü, Novato, CA 94.949 </li><li> Axon Instruments Multiclamp 700B amplifikatör: Moleküler Devices, Inc 1311 Orleans Sürücü, Sunnyvale, CA 94.089-1136 </li><li> Moleküler Devices, Inc, 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94.089-1136: 10 veri toplama yazılımı PClamp </li><li> Sutter Instrument Company, Bir Dijital Sürücü, Novato, CA 94.949 lectrode pozisyonu Sutter ROE-200 manipülatörler ve PC-200 denetleyici ile kontrol edilir. </li><li> Mikroskop: IR-DIC optik ile Olympus BX-50WI dik mikroskop </li><li> IR duyarlı kamera OLY-150 (Olympus) veya DAGE MTI (DAGE MTI, 46.360 IN 01 Kuzey Roeske Avenue, Michigan City). </li></ol>

neokorteks bir organotipik dilim hazırlık tüm hücre kaydı

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Biz sıçan neokorteks piramidal nöronlar gerilim-kapılı potasyum kanalları ifade ve işlevsel roller eğitim görüyor. Çünkü bu kanallar için özel farmakolojik ajanların eksikliği, kanal ifade işlemek için genetik bir yaklaşım almıştır. Biz hücre morfolojisi ve korteks laminer desen korumak için bir Organotipik kültür hazırlama (16) kullanın. Biz genellikle doğum sonrası gün 8-10 akut neokortikal dilim izole ve 3-7 gün boyunca kültür dilimleri korumak. Bu, bize benzer bir yaşta akut dilimleri ile çalışmalarımızı bu nöronların çalışma sağlar ve dilim coşkulu eksitatör bağlantılarının gelişimi en aza indirir. Biz akım veya voltaj-klemp tüm hücre yama kelepçe ile kızılötesi aydınlatma (IR) ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (DIC) kullanarak katmanları II / III veya V görsel tespit piramidal nöronlar kaydı. Biz onların fonksiyonu çalışma kanalları ifade işlemek için yabani türü veya potasyum kanal DNA mutant Biyolistik (Gen tabancası) transfeksiyon kullanın. Transfekte hücreleri kolayca yeşil flüoresan protein (GFP) için cDNA ile birlikte transfeksiyon sonra Epifloresans mikroskobu ile tanımlanır. Biz transfekte hücreler bitişik, aynı dilim aynı katmanda untransfected nöronlar kayıtları karşılaştırın.

Bu piramidal nöronların elektriksel kayıtlar yapma amaçlı bir Organotipik kültür neokortikal dilim hazırlama hazırlamak ve sürdürmek için bir protokoldür.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

Sıçan neokorteksindeki piramidal nöronlarda voltaj bağımlı potasyum kanallarının ekspresyonunu ve fonksiyonel rollerini incelemekteyiz. ... nedeniyle

Bu prosedürün genel amacı, neokorteksin organotipik kesitlerindeki parametal nöronlardan elektriksel kayıtlar elde etmektir. Bu işlem, öncelikle postnatal P8 ile P10 yaşlarındaki sıçanlardan akut kesitler alınarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, CD NA'nın Bic transfeksiyonunu gerçekleştirmektir. Prosedürün üçüncü adımı ise kesitleri üç ila yedi gün boyunca kültüre etmektir.Prosedürün son adımı, akım veya voltaj klembi kullanarak transfekte edilmiş hücrelerden elektriksel kayıtlar elde etmektir. Sonuç olarak, organotipik kesitlerdeki parametal hücrelerin, aynı yaştaki akut kesitlerden elde edilenlerle benzer özelliklere sahip olduğu gösterilebilir. GFP transfeksiyonu bu özellikleri değiştirmez; böylece iyon kanallarının genetik manipülasyonları sonrası nöronların tüm hücre akım veya voltaj klembi kayıtları aracılığıyla incelenmesine olanak tanır.Bu tekniğin, örneğin akut dilimlere kıyasla temel avantajı, hücrelerin iyon kanallarını genetik olarak manipüle edebilecek kadar uzun süre normal bir ortamda tutulabilmesidir. Bu yöntem, spesifik iyon kanalı türlerinin fonksiyonel rolleri gibi iyon kanalı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Eşlik eden makalede belirtildiği şekilde laminer akışlı kabini, vakumlu akışlı kabini, cerrahi malzemeleri ve çözeltileri hazırlayın. Hazırlanan 250 milliliters kesme çözeltisini filtreledikten sonraki tüm adımlarda eldiven kullanın; bu çözeltiden 40 milliliters miktarını 50 milliliters bir behere aktarın.Kesme haznesini, 40 mililitrelik alikotu ve kesme çözeltisinin geri kalan 210 mililitresini, laminer akış kabini altında eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış dondurucuya yerleştirin. Altı kuyucuklu bir plakanın üç diyagonal kuyucuğuna 1,1 mililitre kültür medyumu ekleyin. Bu işlemi ikinci bir kez tekrarlayın.Altı kuyucuklu plakalar. Altı kuyucuklu plakaları, en az bir saat boyunca 37 °C'deki bir inkübatöre yerleştirin. Ardından, kesitlerin transferinde kullanılacak dört transfer pipetini kısaltmak için steril makas kullanın.Çözeltiler bulamaç benzeri karışımlara dönüştüğünde, diğer üç pipet bozulmadan saklanır. 40 mililitrelik kesme çözeltisi alikotunu dondurucudan çıkarın ve vakum davlumbazının altına yerleştirin. %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile kabarcıklandırın.Ardından, 210 milliliters kesim solüsyonunu dondurucudan çıkarın ve laminar akışlı kabin içinde gazla doyurun. Karışım %95 oxygen ve %5 carbon dioxide içermelidir. Daha sonra, yıkama medyasını buzdolabından çıkarın ve laminar akışlı kabin altında %100 oxygen ile doyurun.Bir Petri kabına iki mililitre kültür medyumu yerleştirin. Beyin dilimleme işlemine hazırlık amacıyla, hafta boyunca yapılacak medyum değişimleri için kalan kültür medyumunu buzdolabına koyun. Vakumlu davlumbaz altında, 50 mililitrelik beherin içindeki soğuk kesme solüsyonundan yaklaşık 10 mililitresini 25 mililitrelik bir behere dökün.Anestezi ve dekapitasyonun ardından, postnatal 8 ila 10 günlük bir sıçanın beynini çıkarın. Beyni, 30 mililitre soğuk kesme solüsyonu içeren beherde yaklaşık 30 saniye boyunca yıkayın. Ardından beyni dikkatlice 25 mililitrelik behere aktarın.Eldivenleri değiştirin ve eldivenleri etanol ile doyurun. Ardından beyni, soğuk kesme solüsyonu içerisinde laminar akışlı kabine taşıyın. Bir sonraki adımda, serebellumu ve frontal polü çıkarıp kısmi orta sagittal kesi yaparak beyni yönlendirin ve sabitleyin; sabitlenmiş beyni, frontal korteks yukarı bakacak şekilde sahneye yapıştırın.Dilimlerin boyutunu sınırlamak için gerektiği kadar ek bisturi kesileri yapın. Ardından, beyni içeren tablasını sterilize edilmiş metal dilimleme haznesine yerleştirin. Titreşimli doku dilimleyiciye bağlayın.Banyoyu buz soğukluğunda, gaz verilmiş kesme solüsyonu ile doldurun. Kalan kesme solüsyonunun 30 mililitresini 50 mililitrelik bir behere dökün ve %95 oksijen, %5 karbondioksit ile havalandırın. Bu beher, kesitleri toplamak için kullanılacaktır.Frontal parietal korteksten 250 mikron kalınlığında koronal kesitler alın. En az altı kesiti, kesim çözeltisi içeren 50 mililitrelik beherin içine yerleştirin. Ardından, 35 milimetrelik bir Petri kabına yaklaşık iki mililitre yıkama medyumu ekleyin.Kesilmiş pipet kullanarak dilimleri kesme solüsyonundan, yıkama medyası içeren Petri kabına aktarın. Dilimleri üç kez yıkayın; medyayı eklemek ve yıkama sonrası atık solüsyonları aspire etmek için her seferinde taze pipetler kullanın, ardından dilimleri kültür medyası içeren 35 milimetrelik Petri kabına aktarın. Sonrasında, gözenekli insertlerin paketlerinin üst kısımlarını çıkarın ancak insertleri paketlerin içinde bırakın.Ardından, kesilmiş bir transfer pipeti kullanarak bir ağ insertini paketinden çıkarmak için pens kullanın. Kültür ortamından bir dilimi ağın üzerine aktarın. Bütün bir transfer pipeti kullanarak dilimi membranın ortasına yerleştirin ve konumlandırın.Fazla kültür ortamını uzaklaştırın. Şimdi, dilimle birlikte ağ şeklinde eklemeyi, altı kuyucuklu plakanın sıvı dolu kuyucuklarından birine yerleştirin. Her bir sıvı dolu kuyucuğa bir dilim yerleştirdikten sonra, ağın altında hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.Her iki altı kuyucuklu plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve yaklaşık bir saat boyunca 37 degrees Celsius'de inkübe edin. Bu sırada, transfeksiyon hazırlığı için laminar akışlı kabin altındaki çalışma alanını temizleyin. Bir sonraki adım, ilk pozisyonu boş bırakarak BioRad Helios gen tabancasını doldurmaktır.CD NA kaplı mermiler içeren bir kartuşu, gen tabancasının kartuş tutucusundaki her iki pozisyondan birine yerleştirin. Ardından kartuş tutucusunu gen tabancasına yerleştirin. İlk olarak, içinde mermi bulunmayan bir namluyu ateşleyerek tabancayı temizleyin.Ardından namluyu cDNA içeren bir kartuşa ilerletin. Altı kuyucuklu plakaları inkübatörden çıkarın ve laminer akışlı kabine yerleştirin; tabancayı altı kuyucuklu plağın üst kısmının hemen üzerinde dikey tutarak 100 PSI basınçta bir dilim atın, ardından namluyu ilerletin ve boş bir atış yaparak namluyu tekrar temizleyin. Kalan dilimlere dilim başına bir atış yaparak ateşleyin.Çekimden sonra, altı kuyucuklu plakaları inkübatöre geri yerleştirin ve kesitleri inkübasyon süresi boyunca 37 °C'de %5 karbon dioksit ile iki ila yedi gün boyunca inkübe edin. Besiyerini gün aşırı şu şekilde yenileyin: laminer akışlı çeker ocak altında çalışarak, boş olan üç kuyucuğa yeni besiyeri ekleyin. Ardından altı kuyucuklu plağı en az bir saatliğine inkübatöre yerleştirin; bir saat sonra altı kuyucuklu plağı laminer çekere geri getirin ve her bir gözenekli inserti ve içindeki kesiti yeni bir kuyucuğa taşımak için etanolle temizlenmiş kavisli pensler kullanın, eski besiyerini aspire edin ve plağı inkübatöre geri koyun.Birkaç günlük inkübasyonun ardından, dilimler artık tüm hücre kayıtları için hazırdır. Laminer akışlı çeker ocuk altında, inkübatörden altı kuyucuklu bir plakayı çıkarın. Bir adet ağ şeklinde inserti ve içindeki dilimi çıkarmak için etanolle temizlenmiş kavisli pensler kullanın.Ardından altı kuyucuklu plakayı inkübatöre yerleştirin. Sonra, gözenekli ekli petri kabını ve dilimi kayıt alanına taşıyın, pens veya esnek bir metal parçasıyla gerginlik uygulayın. Gerekiyorsa, gözenekli eki dilimin etrafından kesmek için 11 numara bir skalpel kullanın, son kesimleri makasla tamamlayın.Ardından, kesiti ve ekli ağı kayıt odasına aktarmak için pens kullanın. Dik bir mikroskobun tablası üzerinde, kesiti IR DIC optikleri altında karbogenle doyurulmuş yapay beyin omurilik sıvısı ile yıkayın. Epi-floresans ve fitz filtresi altında ikinci, üçüncü veya beşinci tabakalardaki parametal nöronları görüntüleyin.IR DIC mikroskopisi altında transfekte edilmiş yeşil hücreleri bulun. Hücrelerin içinde küçük siyah noktalar şeklinde görünen CDNA mermilerine bakın. Tüm hücre kaydı (whole cell recording) için transfekte edilmiş bir hücre seçin.Ardından, bir mikro elektrot seçilen hücreye doğru ilerletin ve giga ohm sızdırmazlık sağlamak için hafif vakum uygulayın. Daha sonra, bütün hücre kaydı (whole cell recording) için hücreye giriş yapmak üzere ek vakum uygulayın. Hücre artık akım veya voltaj klempleme kayıtları için hazırdır.Bu şekil, GFP için CDNA ile transfekte edilmiş hücrelerin floresan görüntüsünü göstermektedir. Aşağıdaki kayıtlar, GFP için CDNA ile transfekte edilmiş hücrelerden alınmıştır. Burada, eşik değerin üzerindeki 10 milisaniyelik akım enjeksiyonuna yanıt olarak üçüncü katman parametal hücredeki bir aksiyon potansiyeli gösterilmektedir.Bu şekil, iki saniyelik 400 pico amp akım enjeksiyonuna yanıt olarak beşinci katman parametal nöronundan gelen tekrarlı ateşlemeyi göstermektedir. Bu şekil, beşinici katman parametal nöronundan alınan bir voltaj klem kayıtını göstermektedir. Voltaj kapılı sodyum akımını bloke etmek için tetrodotoksin kullanılmıştır.-70 millivolt tutma potansiyelinden uygulanan 500 milisaniyelik voltaj basamakları ile uyarılan dışa doğru potasyum akımlarını izler temsil etmektedir. Yönteme hakim olunduğunda, hazırlık süresi dahil olmak üzere hafif hazırlık ve transfeksiyon yaklaşık iki saat içinde tamamlanabilir. Bu Prosedürü uygularken.Steril koşulların korunması ve kurumayı önlemek için kesit kalınlığının ve boyutlarının sınırlandırılması önemlidir. İzlediğiniz için teşekkürler. Deneyinizde başarılar dileriz.Teşekkür ederim.

whole-cell-recording-from-an-organotypic-slice-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Bu video, ince uçlu bir pipetin beyin dilimlerinin yakınına yerleştirilmesini ve bir nöronal hücre ile bir mühür oluşturmasını göstermektedir. Emme, hücre zarını kırar, böylece elektrofizyoloji deneyleri için akım ölçümlerini sağlayan bir tam hücre yama kelepçesi oluşturur.

Beyin Dilimlerinde Elektrofizyolojik Kayıtlar için Tüm Hücre Voltaj-Kelepçe Konfigürasyonunun Oluşturulması

Bu videoda, nörona özgü floresan proteinler içeren transgenik beyin dilimlerinden elektriksel aktivitenin aynı anda görüntülenmesi ve kaydedilmesi için bir yöntem özetlenmektedir. Prosedür, beyin diliminin havalandırılmış yapay beyin omurilik sıvısı ile bir perfüzyon odasında tutulmasını, floresan etiketli hücreleri uyarmak için bir ışık kaynağı kullanılmasını ve elektrik sinyallerinin çok kanallı bir prob ve yama kelepçesi ile kaydedilmesini içerir.

Beyin Dilimlerindeki Nöronal Hücrelerin Eş Zamanlı Optik ve Elektrofizyolojik İzlenmesi

Çift kayıtlar, tek tek nöronlar arasındaki sinapsların hassas elektrofizyolojik ve farmakolojik karakterizasyonunu sağlayan, sinaptik olarak bağlı iki nörondan eşzamanlı tam hücre yama kelepçe kayıtlarıdır. Burada, elektrofizyoloji için donatılmış herhangi bir laboratuvarda organotipik hipokampal dilim kültürlerinde bu tekniği oluşturmak için ayrıntılı metodolojiyi ve gereksinimleri açıklıyoruz.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Kapalı döngü protokolleri günümüz elektrofizyolojisinde giderek yaygınlaşmaktadır. Kortikal piramidal nöronlarda in vitro olarak karmaşık elektrofizyolojik protokolleri gerçekleştirmenin basit, çok yönlü ve ucuz bir yolunu sunuyoruz.

Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

Burada, foto-reaktif doğal olmayan bir amino asidi, kültürde veya in vivo nöronlarda eksprese edilen bir hedef nöronal proteine genetik olarak kodlayarak kısa bir ışık darbesi ile bir nöronal proteini seçici olarak aktive etmek için bir prosedür sunulmaktadır.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Bu iletişim kuralı bir en iyi duruma getirilmiş Nuygulanmasını gösteren-metil-D-glucamine (NMDG) koruyucu kurtarma yöntemi beyin dilim hazırlık. Bir tek medya formülasyon güvenilir bir şekilde sağlıklı beyin dilimleri her yaştan ve çeşitli deneysel uygulamalar için hayvanlardan elde etmek için kullanılır.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

Burada, vitro omurilik dilim nöronlarda gözlemliyorum gelatinosa (SG) yapılan bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları için gerekli adımları açıklar. Bu yöntem, içsel membran özelliklerini, sinaptik iletimi ve morfolojik belirlenmesi için SG nöronlar karakterizasyonu sağlar.

Akut omurilik dilimleri hazırlanması gözlemliyorum Gelatinosa nöronlar bütün hücreli yama-kelepçe kayıt için

Burada, lateral genikulat çekirdeğini içeren akut beyin dilimleri ve retinogeniculate ve kortikogeniculate sinenler fonksiyonunun elektrofizyolojik incelenmesi için protokoller sunuyoruz. Bu protokol, aynı akut beyin dilimleri içinde yüksek salınımı ve düşük salınımı olasılığı ile sinaps incelemek için etkili bir yol sağlar.

Retinogeniculate ve Kortikogeniculate SYNAPSE fonksiyonunun elektrofizyolojik Incelemeleri

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Öğrenin neokortikal organotipik dilim hazırlama ve piramidal nöronlardan elektrofizyolojik kayıt tekniklerini. Genetik manipülasyon sonrası iyon kanalı davranışlarını incelemek için kullanılan bu yöntem, transfeksiyon sonrası nöron özelliklerinin korunduğunu gösterir.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

Daha fazla video keşfet