Name: Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Öğrenin fare mayotik hücrelerini FACS ile arıtma yöntemini. Kollajenaz ve tripsin ile hücre dağıtımı, DNA boyama ve sitogenetik analiz için yüksek saflıkta fraksiyon izolasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, Florida Devlet Scripps ve ödül sayıları sırasıyla Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü ve Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü R01GM085079 ve R21HD061304 paralar kısmen desteklenmiştir. Bu Scripps Araştırma Enstitüsü yazının sayısı 20.917.

Bu protokol, iki önemli adımlar ayrılabilir: (1) gerekirse fare testis hücrelerinin bölünmeler ve Hoechst 33.342 boyama, germ hücrelerinden mayoz tüm aşamaları da dahil olmak üzere ilgili mayotik kesirler, sıralama (2) FACS izledi yuvarlak spermatid. Bir kez toplanan bu zenginleştirilmiş mayotik popülasyonları geniş bir analiz için kullanılabilir. Bu protokol bir yetişkin testis ayrışma açıklar; miktarlar gençlerin veya ek testisler için buna göre adapte edilebilir. 1. Testis Ayrılma <ol><li> 15 ml'lik bir tüp içinde bir decapsulated testis. </li><li> Kollajenaz tip I, 120 U / ml içeren Gey Dengesi Tuz Çözüm 3 ml (GBSS) </li><li> 10 ul DNAz I (% 50 gliserol 1mg/ml stok solüsyonu) ekleyin ve ayırmak başlangıç ​​testis tübüller görene kadar elle kuvvetlice sallayın. </li><li> 33 ° C'de 15 dakika için 120 rpm maksimum yatay çalkalayın </li><li> Oda sıcaklığında dikey olarak 1 dakika için Durusu ve supernatant atın. </li><li> 1.5 ila 1.2 arasındaki adımları tekrarlayın. </li><li> Kollajenaz tip I, 50 ul, 1mm HCl çözeltisi ve 10 ul DNAz (1mg/ml) yeniden süspanse 50mg/ml tripsin stok solüsyonu içeren GBSS 2.5 ml ekleyin ve birkaç kez tüp ters. </li><li> 33 ° C'de 15 dakika için 120 rpm maksimum yatay çalkalayın </li><li> Geniş delikli plastik tek yeniden süspanse kullanarak, pipet yavaşça yukarı ve aşağı 3 min.No kümeleri için bu noktada görünür olmalıdır. </li><li> Tripsin 30, 10 DNAz I, 40 DMSO (10 mg / ml) yeniden süspanse Hoechst 33.342 ul ul ul ekleyin ve birkaç kez tüp ters. </li><li> 33 ° C'de 15 dakika için 120 rpm maksimum yatay çalkalayın </li><li> 400-ul fetal buzağı serumu (FCS) ve tripsin inaktive tersini ile karıştırın. </li><li> Final boyama Hoechst 33.342 50 ul DMSO (10 mg / ml) yeniden süspanse ve DNAz (1 mg / ml) 10 ul ekleyerek yapılır. </li><li> 33 ° C'de 15 dakika için 120 rpm maksimum yatay çalkalayın </li><li> Ayrışmış testis örnek daha sonra iki adet 40 mikron GBSS geçirilir 50 ml konik tüp üzerinde önceden ıslatılmış tek filtreleri, tek kullanımlık Pasteur ile birkaç kez pipetleme çözüm eklenir ve örnek hafifçe karıştırılır, propidium iyodür daha sonra 5 ul (PI) pipet. </li><li> 18-gauge iğne ile örnek bir 5 ml plastik şırınga aktarılır. İkinci örnek teslimat için 22-gauge iğne ile değiştirilir. Şırınga, buz üzerinde saklanır ve ışık FACS işlem için hazır olana kadar korunur. </li></ol> 2. FACS Kurulum ve Arıtma <ol><li> Sıralama Becton-Dickinson Aria IIU hücre sıralayıcı yapıldı. Bu nedenle açıklanan koşullar, özellikle farklı ekipman kullanılarak bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılmalıdır. Daha önce 7,8 açıklanan koşulları kullanılan. </li><li> Aria IIU UV lazer sahip olmadığından, biz Hoescht boyama 488nm bir mavi lazer ileri ve yan dağılım tespiti için kullanılan ek olarak 405nm menekşe lazer kullanarak tespit etmek için protokol uyarladı. Ayrıca, bazı filtreler, gelişmiş dağınık arsa netliği ile sonuçlanan bazı kırmızı lazer leakiness sınırlamak amacıyla modifiye edilmiştir. </li><li> Menekşe lazer Hoescht Mavi emisyon tespiti için bir 450/40nm bir bant geçiren ve Hoescht Kırmızı emisyon için bir 585/42nm bant geçiren yapılandırıldı. 502nm bir uzun pas kırmızı floresan mavi ayırmak için kullanılmıştır. </li><li> 100 mikron meme 28.000 damla / saniye bir damla sürücü frekans ile kullanılmıştır. Örnek eşik hızı yaklaşık 4000 olayları / saniye idi. Sıcaklık kontrol seçeneği, 4 örnek ve toplama tüpleri korumak için kullanılan ° C sıralama tüm süresi. Ayrıca, örnek ajitasyon özelliği tür boyunca sedimenting örnek önlemek için 200 rpm'de kullanılmıştır. </li><li> Genellikle, her nüfus için 0.5-2.0x10 6 hücreli (temsilcisi bölümüne bakınız) toplanması için izin 02:58 testisler 6 saat her tür işlendi. </li><li> Örnek şırıngadan reçete yaklaşık 750μl alikotları sıralanır. Bu arada, bu duraklamalar sırasında toplama tüpleri 4 tutuldu ° C, ışıktan korumalı ve yavaşça önce sürdürme tür karışık. </li><li> % 10 FCS ile desteklenmiş 250μl DMEM içeren bir 12x75mm cam borosilicated toplama tüpünün içine sıralanır örnekleri toplandı. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Tipik bir FACS profili Şekil 1'de gösterilmiştir. Mayoz bölünme önemli adımlar tespit edilir ve göstergede gösterilir. Hoechst 33.342 optimal değildir leke varsa, çok daha kompakt küresel bir profil görünür ve daha az belirgin olacaktır. Yaygın bir sorun, yeterli DNAz, hızlı hücre topaklanma neden olacaktır ekleyerek görmektedir. Zan altındaki bütün adımları ekstra DNAz eklenmesi genellikle bu sorunu çözer. Freeze inciDNAz stok (-20 ° C'de saklanan) Awing bu enzim aktivitesi hızlı kaybı sonucu olarak, asgari düzeyde tutulmalıdır. Spo11 mayotik rekombinasyon hotspots 12 siteleri çift iplikli tatili yönlendirir mayotik endonükleaz Şekil 2. Tipik bir prematüre mayoz 12 çift iplikli sonu oluşan bir Spo11 boş testis profilleri, yanı sıra gösterir asenkron mayoz bu ilk dalga doğasını ortaya çıkarır, 13 gün yaşlı fare, ön puberous profili. Synaptonemal kompleks protein 3 (SCP3) ve fosforile histon H2AX antikorlar kombinasyonunu kullanarak Standart sitogenetik analiz aşamasında özel mayoz bölünme işaretleri ilk olarak açıklanan 11 elswhere sıralaması mayotik hücrelerinin saflık ve doğa, teyit için kullanılan olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Wild-tip mayoz FACS profilleri. A) Temsilcisi scatter plot gösterilmiştir. Kapılı hücreler gösterilmiştir. Çoğunlukla boş membranlar ve spermatid kuyrukları içeren erişkin testis bulunan enkaz büyük miktarda unutmayın. B) bir temsilci PI arsa çok sınırlı bir örnek PI pozitif hücre miktarını gösterir. Tipik bir kapı gösterilir. C) bir temsilci yabani tip Hoechst 33.342 FACS Profil gösterilir. Daha fazla çalışma için bu yöntemi kullanarak saflaştırılmış olabilir çeşitli mayotik hücre popülasyonlarının belirtilmiştir: spermatogonium (Sp), ön-leptoten (pL), leptoten zigoten (L / Z), erken Pachytene (EP), orta Pachytene ( mP), geç-Pachytene (LP), diploten (D) ve yuvarlak spermatid (SC). <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Spo11 boş ve yabani tip gün 13 mayotik FACS profilleri. A) Tipik bir Spo11 boş profil zigoten / leptoten erken pachytene geçmişte hiçbir aşamada tespit edilebilir bir açık mayotik yetmezliği ile gösterilir. B) 13 gün yabani tip erkek fare profili leptoten / zigoten hücreleri yüksek konsantrasyonda gösterir. Mayoz Bu ilk dalga olarak açık bir şekilde bu yöntemi kullanarak görüntülendi yerine, asenkron.

<ol><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+elutriation%3A+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).</li>
<li>Purification, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Lassalle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+Population%27+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131, 479-487 (2004).</li>
<li>Bastos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li>
<li>Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+variation+in+human+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of variation in human meiotic recombination.</a> PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).</li>
<li>Roig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+TRIP13%2FPCH2+is+required+for+recombination+and+normal+higher-order+chromosome+structure+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis.</a> PLoS Genet. 6, (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+occupancy+landscape+and+dynamics+at+mouse+recombination+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots.</a> EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).</li>
<li>Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Spo11+gene+is+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis.</a> Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).</li>
</ol>

Burada sunulan protokol biri eş zamanlı olarak araştırmacılar, bu temel sürecin dinamiklerini incelemek için izin yetişkin erkek fareler, çok yüksek saflıkta mayotik sahne hücrelerinin tüm aralığı arındırmak için izin verir. Saf hücrelerin RNA ekstraksiyon 9,10, nucleosome haritalama 11, rekombinant molekül algılama, protein analizi, ve daha birçok arasında değişen çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Ancak, algılama yöntemleri, saflaştırılmış mayotik hücrelerinin miktarına adapte olmak zor...

<table><tbody><tr><td>Kolajenaz Tip-1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLSS1</td><td>GBSS içinde 12,000U/ml olacak şekilde çözün, 4&amp;#x00B0;C'de saklayın</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Worthington Biochemical</td><td>TRL3</td><td>1mM HCl içinde 50mg/ml olacak şekilde çözün, 4&amp;#x00B0;C'de saklayın</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Acros Organics</td><td>230001000</td><td>Doymuş çözelti (DMSO içinde 10mg/ml), 4&amp;#x00B0;C'de saklayın</td></tr><tr><td>DNAz I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNEP</td><td>Su/ %50 gliserol içinde 1mg/ml olacak şekilde çözün, -20&amp;#x00B0;C'de saklayın</td></tr><tr><td>Gey&amp;rsquo;s Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>6&quot; Transfer Pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119D</td><td></td></tr></tbody></table>

fare mayotik hücreler sitometrisi arıtma

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Testis hücre tipleri heterojen doğası ve mayoz hücre kültürü modelleri yokluğunda mayoz bölünme sırasında ortaya eşsiz bir farklılaşma programları çalışma için önemli engellerin edilmiştir. BSA ve / veya Percoll gradyanlar Yıkayarak tasviye veya Staput (sedimantasyon): İki ana yöntemleri, değişen derecelerde, hem yetişkin ve immatür hayvanlarda çeşitli mayotik kesirler arındırmak için geliştirilmiştir var. Bu yöntemlerin her ikisi mayotik hücreleri 1-5 ayrı hücre boyutu ve yoğunluğu güveniyor. Genel olarak, birkaç hücre popülasyonlarının 6 dışında, bu protokolleri detaylı moleküler analizler için gerekli olan çok sayıda mayotik hücre popülasyonlarının yeterli saflıkta verim başarısız olur. Ayrıca, bu tür yöntemleri ile genellikle tek tip mayotik hücreleri mayoz hücre örnekleri karşılaştırarak tekrarlanabilirlik ve homojenlik ile ilgili ekstra bir karmaşıklık düzeyi ekler belirli bir zaman, arındırılmalıdır. Burada, Hoechst 33.342 boyama 7,8 ile birlikte FACS kullanarak, germ hücreleri, yuvarlak spermatid, zarif bir yöntem tarif biri kolayca görselleştirmek belirlemek ve mayotik hücreleri arındırmak sağlar . Bu yöntem tüm mayotik sürecinin genel bir anlık sağlar ve bir mayoz en aşamasından son derece canlı hücreler arındırmak için izin verir. Bu saflaştırılmış hücreler daha sonra 11 mayotik rekombinasyon noktalarından örnek gen ekspresyonu 9,10 değişiklikleri ve nucleosome doluluk dinamikleri, mayoz bölünme yoluyla ilerlemesi eşlik moleküler değişiklikler için ayrıntılı olarak analiz edilebilir.

Floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile rafine bir hücre disosiasyon protokolü birleştirir fare testis yüksek derecede saflaştırılmış yaşayabilir mayotik kesirler elde etmek için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, DNA içeriği ve ayrık mayotik kesirler nükleer yoğunluğu farklılıkları yararlanır.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

Testisteki hücre tiplerinin heterojen yapısı ve meiyotik hücre kültürü modellerinin yokluğu, ... çalışmalarının önündeki önemli engeller olmuştur.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bu benzersiz hücre döngüsü sırasında meydana gelen dinamik süreçleri incelemek amacıyla, yetişkin fare testislerinden geniş bir mitotik hücre yelpazesini tek seferde ve yüksek saflıkta saflaştırmaktır. Bu, tek hücreli bir testis süspansiyonu elde etmek için ikinci bir adım olarak dna varlığında kollajenaz ve tripsin ile bir dizi enzimatik sindirimle testis hücrelerinin verimli bir şekilde ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir.Test süspansiyonu, çeşitli miyotik hücre tiplerinin DNA içerikleri ve yoğunluklarına göre ayırt edilmesini sağlayan Hulk's 3 33 42 floresan canlı DNA boyası ile boyanır. Ardından, sitogenetik veya gen ekspresyon analizi gibi ileri analizler için gerekli tüm fraksiyonları tanımlamak ve saflaştırmak amacıyla miyotik hücreler floresan aktive hücre ayıklama ile analiz edilir. Kapsamlı sitogenetik ve ekspresyon dizisi çalışmaları sonucunda, elde edilmesi zor olan miyotik hücre popülasyonlarının yüksek saflıkta ve verimli bir şekilde saflaştırıldığını gösteren sonuçlar elde edilir.Bu olgu tabanlı protokolün santrifügasyon, filtrasyon veya yerçekimi sedimentasyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çoğu mitotik fraksiyonun çok yüksek saflıkta toplanmasına olanak tanımasıdır. Bu yönteme yeni başlayan kişilerin; etkili hücre disosiasyonu ve bekletme işlemlerini gerçekleştirmek ve ardından optimal hücre ayıklama işlemini yapmak için çok farklı beceri setlerini birleştirmeleri, hücreleri hazırlayan kişi ile akış sitometrisi operatörü arasında iyi bir etkileşim kurmaları ve başarının temelini oluşturan bu protokolün prensiplerini iyi anlamaları gerekecektir. Hücre disosiasyon protokolü, laboratuvarımızda bu protokolü önemli ölçüde geliştirmiş olan kıdemli postdoktora araştırmacısı Dr. I Gatun tarafından gösterilecektir.BVN Tores. Akış sitometrisi operatörümüz, verimli hücre ayıklama için optimize edilmiş bir kurulum sürecinde size rehberlik edecektir. Bu protokolde, iki yetişkin fare testisinin disosiasyonu gösterilecek; ancak hacimler, genç fareler veya ek testisler için uygun şekilde adapte edilebilir.Tüpe, mililitre başına 120 ünite kollajenaz tip 1 içeren üç mililitre gaze dengeli tuz çözeltisi ekleyerek başlayın. Hücrelerin doğru boyanması ve sorunsuz ayrıştırılması için etkili doku disosiasyonu kritiktir. Yeterli miktarda kollajenaz 1 eklenmesi ve ajitasyon sırasında tüpün yatay konumda tutulması, etkili testis disosiasyonu için çok önemlidir. Bir adet kapsüllenmiş testisi 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.Testislere 10 µL DNase I ekleyin ve testiküler tübüller ayrışmaya başlayana kadar tüpü elinizle kuvvetlice çalkalayın. Ardından tüpü yatay olarak bir döner çalkalayıcıya yerleştirip sabitleyin ve 33 °C'de, maksimum 120 RPM hızında 15 dakika boyunca çalkalayın. 15 dakika sonra, oda sıcaklığında bir dakika boyunca dikey olarak dekante edin. Daha sonra, süpernatanı uzaklaştırmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın. Numuneye, kollajenaz tip 1 içeren 3 mL dengeli tuz çözeltisi ile 10 µL DNase I ekleyin.Tüpü tekrar birkaç kez elinizle sallayın. Tüpü, daha önce olduğu gibi 33 °C'de, maksimum 120 RPM hızda 15 dakika boyunca yatay olarak çalkalayın, ardından oda sıcaklığında bir dakika boyunca dikey olarak dekante edin ve süpernatantı atın. Sonrasında, kollajenaz içeren 2,5 milliliters GBSS ekleyin.50 µL tripsin ve 10 µL dase ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirin, 33 °C'de 15 dakika boyunca maksimum 120 RPM hızında yatay olarak çalkalayın. 15 dakikalık çalkalama işleminin ardından, örneği üç dakika boyunca nazikçe yukarı-aşağı pipetlemek için geniş ağızlı tek kullanımlık plastik bir past pipet kullanın.Bu aşamada herhangi bir topaklaşma görülmemelidir. Ardından 30 µL tripsin, 10 µL DNAs one ve DMSO içinde yeniden süspanse edilmiş 40 µL Hulks 3 33 42 ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.33 °C'de, maksimum 120 RPM ile 15 dakika boyunca yatay olarak çalkalayın. Numunenin çalkalama işlemi tamamlandığında, tripsini inaktive etmek için 400 µL fetal sığır serumu ekleyin ve tüpü tersyüz ederek karıştırın. Final boyamayı gerçekleştirmek için 50 µL hoax 3 33 42 ve 10 µL DNAs ekleyin.Tüpü yeniden, maksimum 120 RPM'de 15 dakika boyunca 33 °C'de yatay olarak çalkalayın. Ayrıştırılmış testis örneği daha sonra, 50 mL'lik konik bir tüp üzerinde GBSS ile ıslatılmış iki adet 40 mikronluk tek kullanımlık filtreden geçirilir. Örneğe beş µL propidyum iyodür çözeltisi ekleyin ve tek kullanımlık bir pastör pipeti ile birkaç kez pipetleyerek nazikçe karıştırın.Ardından, numuneyi 18 gauge bir iğne aracılığıyla beş mililitrelik plastik bir şırıngaya aktarın. Daha sonra, numune iletimi için 18 gauge iğneyi 22 gauge bir iğne ile değiştirin. Son olarak, numune fax işlemine hazır hale gelene kadar şırıngayı buz üzerinde saklayın ve ışıktan koruyun.Bu deney için, hücre ayıklama işlemi bir Backin Dixon alanında gerçekleştirilir. Hücre ayıklayıcı koşulları, daha önce 360 nanometre ultraviyole argon lazer ve 488 nanometre argon lazer ile donatılmış bir akış sitometresi için kullanılanlardan uyarlanmıştır. Sonuç olarak, akış sitometresi kurulumunun hücre ayıklayıcı operatörü tarafından optimize edilmesi gerekecektir.Becton Dixon Aria two U cihazında UV lazer bulunmadığı için, Hoechst boyamasının saptanmasına yönelik protokol 405 nanometre menekşe lazer kullanılarak uyarlanmıştır. Hoechst, 405 nanometre menekşe lazer ile uyarılırken; hem PI uyarımı hem de ileri ve yan saçılım saptamaları için 488 nanometre mavi lazer kullanılır. Ayrıca, bazı kırmızı lazer sızıntılarını sınırlamak amacıyla Hoechst saptama filtreleri modifiye edilmiştir, bu da saçılım grafiği netliğinin artmasını sağlamıştır.Mor lazer, sahte mavi emisyonun tespiti için 450 ± 40 nanometre bant geçiren filtre ve sahte kırmızı emisyon için 585 ± 42 nanometre bant geçiren filtre ile yapılandırılmıştır. Mavi floresan ile kırmızı floresanı birbirinden ayırmak için 502 nanometre uzun geçiren filtre kullanılmıştır. İki farklı filtre seti kullanılması arasındaki fark burada gösterilmiştir.5 85 42 nanometre filtre, 6 30 30 nanometre filtreye göre daha kompakt hücre popülasyonları sağlar. Bu nedenle operatör, en iyi uzlaşmayı elde etmek için kendi cihazında farklı kombinasyonları denemeye hazır olmalıdır. 28.000 damla/saniye damlatma frekansıyla 100 mikronluk bir nozül kullanılır.Örnek eşik hızı, daha yüksek çözünürlüğü korumak amacıyla saniyede yaklaşık 4.000 olay ve bir ila üç arası bir akış hızıdır. Örneği, şırıngadan dağıtılan yaklaşık 750 µL'lik alikotlar halinde sıralayın. Bu aralar sırasında, şırıngada kalan örneği buz üzerinde ve ışıktan korunmuş şekilde tutun. Sıralanan örnekleri, %10 FCS ile desteklenmiş 250 µL DMEM içeren 12 x 75 mm'lik cam borosilikat toplama tüplerine toplayın.Örnekleri toplama tüplerinde dört derece santigrat sıcaklıkta tutmak için, sıralamanın tüm süresi boyunca sıcaklık kontrol seçeneğini kullanın. Ayrıca, sıralama boyunca örneğin çökelmesini önlemek için 200 RPM hızında örnek karıştırma özelliğini kullanın. Ana örnekten her alikvot eklendiğinde, toplanan hücrelerin bütünlüğünü korumak için toplama tüplerine hafifçe vurmak önemlidir.Yabani tip mayozun tüm ana basamaklarının belirlendiği, kapılı hücrelerin belirtildiği bu dağılım grafiğinde temsili gerçek profil verileri gösterilmektedir; yetişkin testislerde çoğunlukla boş membranlar ve sperm kuyruklarını içeren çok miktarda döküntü mevcuttur. Temsili bir Propidium iyodür grafiği, örnekte çok sınırlı miktarda propidium iyodür pozitif hücre olduğunu göstermektedir. Tipik kapı, bu temsili yabani tip hoax 3 33 42 fax profilinde belirtilmiştir.Bu yöntem kullanılarak ileri çalışmalar için saflaştırılabilecek çeşitli miyotik hücre popülasyonları; spermatogonia, preleptoten, leptoten, zigoten, paquitene, diplotene ve yuvarlak spermatositlerdir. Bu son iki profil, 13 günlük farelerin SPO 11 N testisinden ve vahşi tip bir testisinden alınmıştır. SPO 11, miyotik rekombinasyon sıcak noktalarında çift zincir kırılmalarını yönlendiren miyotik endonükleazdır ve burada gözlemlendiği üzere, SPO 11'in yokluğu, leptoten, zigoten ve erken paquitene aşamalarının ötesinde herhangi bir aşama tespit edilemediği için belirgin bir miyotik başarısızlıkla sonuçlanır.Buna karşılık, 13 günlük yabani tip erkek bir farenin profili, yüksek konsantrasyonda leptin zigot hücreleri göstermektedir. Net bir şekilde görselleştirildiği üzere, mayozun bu ilk dalgası oldukça asenkron seyretmektedir. Bu metodolojiyi kullanarak bu deney gerçekleştirilirken, yeterli miktarda DNA kullanılması önemlidir.Sorunsuz ayrıştırma için şehrin merkezi. Araştırmacılar başlangıçta kullanmaya isteksiz olsalar da, DNA ilavesi örnek viskozitesini azaltacak ve hücre ayrıştırmasını ve boyanmasını geliştirecektir; ayrıca sağlam hücreler zarar görmeyecektir. Somatik hücrelerin ayrıştırılması için FOX yöntemi, örneğin gen ekspresyon dinamiklerini incelemek için D-N-A-R-N-A ekstraksiyonu veya çeşitli epigenetik profillemeler oluşturmak için kromatin immünopresipitasyon tekniği gibi çok çeşitli alt uygulamalarda kullanılabilir.

flow-cytometry-purification-of-mouse-meiotic-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Akış Sitometri tabanlı Arıtma<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigot

Enzimler ve deterjan kaçınarak kemirgen malzemeden testis hücre süspansiyonları, mekanik hazırlanması için bir yeni protokol tarif edilmektedir. Yöntem çok basit, hızlı, tekrarlanabilir ve akış sıralama ve RNA ekstraksiyon için uygun kaliteli hücre süspansiyonları, vermektedir.

Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

Akış sitometrisi kullanarak fare spermatidleri için bir sıralama stratejisi açıklıyoruz. Spermatidler, yuvarlak (spermiyogenez aşamaları 1-9), erken uzayan (spermiogenez aşamaları 10-12), geç uzayan (spermiyogenez aşamaları 13-14) ve uzun spermatidler (spermiyogenez aşamaları 15-16) dahil olmak üzere oldukça saf dört popülasyona ayrılır. Seçim parametreleri olarak DNA boyama, boyut ve granülozite kullanılır.

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama&#39;yı Akışı Sitometrinin tarafından

Biz pDC fonksiyonel çalışmalar için, lupus-eğilimli farelerin kemik iliğinden, yüksek saflıkta plazmasitoid dendritik hücreleri (PDC) izole etmek için sıralama floresans ile aktive edilmiş hücre kullanarak bir protokol sunulmuştur.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Bu çalışma, farklı memeli türlerinin testiküler dokusundan saflaştırılmış germ hücresi popülasyonlarının elde edilmesi için bir yöntemin standartlaştırılmasını açıklamaktadır. Mekanik testis ayrışmasını, Hoechst-33342 ve propidyum iyodür ile boyamayı ve FACS sınıflandırmasını birleştiren basit bir protokoldür ve erkek üreme biyolojisi karşılaştırmalı çalışmalarında geniş uygulamalar yapılmıştır.

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Bu makalede mitokondri veya canlı hücrelerde organellerin ölçmek için güçlü bir yöntem gösterilmektedir. Primer hücre kullanarak doku örnekleri, hasat gibi karma hücre nüfus bu organelleri miktar lysosome veya mitokondri özel boyalar yüzey işaretleyicileri karşı fluorescently konjuge antikorlar ile kombinasyonu sağlar çok renkli akış sitometresi.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

Burada sunulan pachytene spermatositler zenginleştirmek için bir protokol, yuvarlak spermatidler, ve yetişkin fare testislerinden uzayan spermatidler standart laboratuvar ekipmanları ile bir kesintili sığır serum albumin yoğunluğu gradyanı kullanarak.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Bu yöntem, MEP ve MKp'nin fare femurları, kaval kemiği ve pelvik kemiklerden akış sitometrisi ile saflaştırılmasını açıklar.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Burada, erken patlama oluşturan birim eritroid (BFU-e) ve koloni oluşturan birim eritroid (CFU-e) progenitörlerinin doğrudan taze fare kemik iliği ve dalağından prospektif izolasyonu için yeni bir akış sitometrik yöntemi tanımladık. Tek hücreli transkriptomik verilere dayanarak geliştirilen bu protokol, dokunun tüm eritroid progenitörlerini yüksek saflıkta izole eden ilk protokoldür.

Patlama Oluşturan Birim ve Koloni Oluşturan Birim Eritroid Progenitörlerinin Fare Dokusundan Akım Sitometrisi ile Tanımlanması ve İzolasyonu

ScRNA-seq gereksinimlerini karşılayan fare beyni kortikal perisitlerini elde etmek için, CD13⁺/CD31⁻ seçimine dayalı kritik optimize edilmiş bir FACS protokolü sunuyoruz. Ana iyileştirmelerimiz, hücre canlılığını ve RNA bütünlüğünü önemli ölçüde artırır ve güvenilir transkriptomik profilleme imkanı sağlar.

Fare Kortikal Dokusundan Perisitlerin Tek Hücreli Dizileme için FACS Kullanılarak İzolasyonu

Öğrenin fare mayotik hücrelerini FACS ile arıtma yöntemini. Kollajenaz ve tripsin ile hücre dağıtımı, DNA boyama ve sitogenetik analiz için yüksek saflıkta fraksiyon izolasyonu sağlar.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

Daha fazla video keşfet