Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bu benzersiz hücre döngüsü sırasında meydana gelen dinamik süreçleri incelemek için fare yetişkin testislerinden çok çeşitli mitik hücreleri bir kerede ve yüksek saflıkta saflaştırmaktır. Bu, testis hücrelerinin DNA varlığında kollajenaz ve tripsin ile bir dizi enzimatik sindirim ile verimli bir şekilde ayrıştırılmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak tek hücreli bir test süspansiyonu elde etmek için bir.

Testis süspansiyonu, Hulk'un 3 33 42 floresan canlı DNA boyası ile boyanır, bu da çeşitli miyotik hücre tiplerinin DNA içeriğine ve yoğunluğuna göre ayırt edilmesini sağlar. Daha sonraki miyotik hücreler, sitogenetik veya gen ekspresyon analizi gibi daha ileri analizler için gerekli tüm fraksiyonları tanımlamak ve saflaştırmak için floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması ile analiz edilir. Kapsamlı sitogenetik ve ekspresyon dizisi çalışmalarına dayalı olarak, elde edilmesi zor miyotik hücre popülasyonlarının yüksek saflıkta verimli bir şekilde saflaştırılmasını gösteren sonuçlar elde edilmiştir.

Bu gerçeklere dayalı protokolün santrifüj, literasyon veya yerçekimi sedimantasyonu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, çok yüksek saflıkta en miyotik fraksiyonlardan birinde toplamaya izin vermesidir. Bu yönteme yeni başlayan bireyler, verimli test ayrışması ve ayakta durma işlemlerini gerçekleştirmek için çok farklı beceri setlerini birleştirmek zorunda kalacaklar, ardından optimal hücre sıralaması, hücreleri hazırlayan kişi ile akış sitometrisi operatörü arasında iyi etkileşimler ve başarı için gerekli olan bu protokolün temellerinin iyi bir şekilde anlaşılması gerekecektir. Hücre ayrışma protokolünü göstermek, laboratuvarımızda bu protokolü önemli ölçüde geliştiren kıdemli bir doktora sonrası araştırmacı olan Dr.I Gatun olacaktır.

BVN Tores. Akış sitometrisi operatörümüz, verimli hücre sıralaması için en uygun kurulumda size yol gösterecektir. Bu protokolde, iki yetişkin fare testisinin ayrılması gösterilecektir, ancak hacimler gençler veya ek testisler için uygun şekilde uyarlanabilir.

Üç mililitre bakışla başlamak için, mililitrede 120 birim kollajenaz içeren dengeli tuz çözeltisi, tüpe bir tip Etkili, lezzetli ayrışma, hücrelerin doğru lekelenmesi ve çözülmesi için çok önemlidir. Yeterli G nase ilavesi ve çalkalama sırasında tüpün yatay pozisyonda yerleştirilmesi, verimli test ayrışması için çok önemlidir. Kapsüllenmiş bir testisi 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.

Testise bir adet 10 mikrolitre DNA ekleyin ve testis tübülünün ayrışmaya başladığını görene kadar tüpü elinizle kuvvetlice çalkalayın Sonraki yerleştirin ve tüpü dönen bir çalkalayıcı üzerine yatay olarak sabitleyin ve tüpü 15 dakika sonra 33 santigrat derecede 15 dakika boyunca maksimum 120 RPM'de çalkalayın, Oda sıcaklığında dikey olarak bir dakika boşaltın. Ardından süpernatanı atmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın. Numuneye üç mililitre kollajenaz tip bir içeren dengeli tuz çözeltisi ve 10 mikrolitre D nase bir tane ekleyin.

Yine, tüpü elinizle birkaç kez sallayın. Tüpü daha önce olduğu gibi 33 santigrat derecede 15 dakika boyunca maksimum 120 RPM'de yatay olarak çalkalayın, oda sıcaklığında dikey olarak bir dakika boşaltın ve ardından süpernatanı atın. Daha sonra, kollajenaz içeren 2,5 mililitre GBSS ekleyin.

Bir adet 50 mikrolitre tripsin ve 10 mikrolitre dase yazın. Tüpü birkaç kez ters çevirin, 33 santigrat derecede 15 dakika boyunca maksimum 120 RPM'de yatay olarak çalkalayın. 15 dakikalık çalkalamadan sonra, numuneyi üç dakika boyunca nazikçe yukarı ve aşağı pipetlemek için geniş bir deliğe sahip tek kullanımlık plastik bir pipet kullanın.

Bu noktada hiçbir küme görünmemelidir. Daha sonra 30 mikrolitre tripsin, 10 mikrolitre DNA bir ve DMSO'da yeniden süspanse edilmiş 40 mikrolitre Hulks 3 33 42 ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirin.

33 santigrat derecede 15 dakika boyunca maksimum 120 RPM'de yatay olarak çalkalayın. Numunenin çalkalanması tamamlandığında, 400 mikrolitre fetal buzağı serumu ekleyin ve tripsini etkisiz hale getirmek için tüpü ters çevirerek karıştırın. Son boyamayı gerçekleştirmek için 50 mikrolitre aldatmaca 3 33 42 ve 10 mikrolitre DNA ekleyin.

Bir kez daha, tüpü 33 santigrat derecede 15 dakika boyunca maksimum 120 RPM'de yatay olarak çalkalayın. Ayrışmış testis örneği daha sonra 50 mililitrelik konik bir tüp üzerinde GBSS ile önceden bağlanmış iki adet 40 mikron tek kullanımlık filtreden geçirilir. Numuneye beş mikrolitre propidyum iyodür çözeltisi ekleyin ve tek kullanımlık bir macun pipeti ile birkaç kez pipetleyerek hafifçe karıştırın.

Ardından, numuneyi 18 gauge bir iğne ile beş mililitrelik plastik bir şırıngaya aktarın. Ardından, numune teslimi için 18 gauge iğneyi 22 gauge iğne ile değiştirin. Son olarak, şırıngayı buz üzerinde saklayın ve numune faks işlemine hazır olana kadar ışıktan koruyun.

Bu deney için, hücre sıralaması bir Backin Dixon alanında gerçekleştirilir. İki, kullanım hücresi sıralayıcı koşulları, 360 nanometre ultraviyole argon lazer ve 488 nanometre argon lazer ile donatılmış bir akış sitometresi için daha önce kullanılanlardan uyarlandı. Sonuç olarak, akış sitometresi kurulumunun hücre sıralayıcı operatörü tarafından optimize edilmesi gerekecektir.

Becton Dixon Aria two U'nun UV lazeri olmadığından, şahin lekelenmesini tespit etme protokolü 405 nanometre menekşe lazer kullanılarak uyarlanmıştır. Hooks, 405 nanometre mor lazer tarafından uyarılır ve hem PI uyarımı hem de ileri ve yan saçılma tespiti için 488 nanometre mavi lazer kullanılır. Ek olarak, hos algılama filtreleri, bazı kırmızı lazer sızıntılarını sınırlamak için değiştirilir, bu da saçılma grafiği keskinliğinin artmasına neden olur.

Mor lazer, sahte mavi emisyonun tespiti için 4 50 40 nanometre bant geçişi ve sahte kırmızı emisyonun tespiti için 5 85 42 nanometre bant geçişi ile yapılandırılmıştır. Maviyi kırmızı floresanstan ayırmak için 5 0 2 nanometre uzunluğunda bir geçiş kullanılır. İki farklı filtre seti kullanmanın farkı burada gösterilmiştir.

5 85 42 nanometre filtre, 6 30 30 nanometre filtreden daha kompakt hücre popülasyonları sağlar. Bu nedenle, operatör en iyi uzlaşmayı elde etmek için kendi cihazında farklı kombinasyonları denemeye hazır olmalıdır. Saniyede 28.000 damla düşürme frekansı ile 100 mikronluk bir nozul kullanılır.

Örnek eşik hızı, daha yüksek çözünürlüğü korumak için bir ila üç arasında bir akış hızıyla saniyede yaklaşık 4.000 olaydır. Numuneyi şırıngadan dağıtılan yaklaşık 750 mikrolitrelik alikotlar halinde sıralayın Bu duraklamalar sırasında, kalan numuneyi şırıngada buz üzerinde tutun ve ışıktan koruyun. Sıralanan numuneleri,% 10 FCS ile desteklenmiş 250 mikrolitre DMEM içeren 12 x 75 milimetre cam borisy bulunan toplama tüplerine toplayın.

Numuneyi toplama tüplerinde dört santigrat derecede tutmak için, tüm sıralama süresi boyunca sıcaklık kontrol seçeneğini kullanın. Ek olarak, numunenin sıralama boyunca çökelmesini önlemek için 200 RPM'de numune çalkalama özelliğini kullanın. Ana numunenin bir alikotu her eklendiğinde, toplanan hücrelerin bütünlüğünü korumak için toplama tüplerini de hafifçe vurmak önemlidir.

Kapılı hücrelerin gösterildiği bu dağılım grafiğinde vahşi tip mayozun tüm ana adımlarının tanımlandığı temsili gerçekler profilleri burada gösterilmektedir, yetişkin testislerde çoğunlukla boş zarlar ve sperm kuyrukları içeren büyük miktarda döküntü vardır. Temsili bir Propidyum iyodür grafiği, numunede bulunan çok sınırlı miktarda propidyum iyodür pozitif hücreyi gösterir. Tipik yürüyüş, bu temsili vahşi tip aldatmaca 3 33 42 faks profilinde belirtilmiştir.

Daha ileri çalışma için bu yöntem kullanılarak saflaştırılabilen çeşitli miyotik hücre popülasyonları spermatogonia, pre leptin, leptin, zigotlar, pacu, diploten ve round sperate olarak belirtilmiştir. Bu son iki gerçek profili, bir SPO 11 N testis ve 13 günlük farelerden alınan vahşi tip bir testisten alınmıştır. SPO 11, çift ipliği yönlendiren miyotik endonükleazdır, miyotik rekombinasyon sıcak nokta bölgelerini kırar ve burada gözlemlendiği gibi, SPO O 11'in yokluğu açık bir miyotik başarısızlıkla sonuçlanır, çünkü leptin zigot erken PACU'yu geçen hiçbir aşama tespit edilemez.

Buna karşılık, 13 günlük vahşi tip bir erkek farenin profili, yüksek konsantrasyonda leptin zigot hücreleri gösterir. Bu ilk miyoz dalgası, açıkça görüldüğü gibi oldukça asenkrondur. Bu deneyi gerçekleştirirken, yeterli miktarda DNA kullanmak önemlidir.

Sorunsuz sıralama için şehrin merkezidir. Araştırmacılar başlangıçta onu kullanmak konusunda isteksiz olsalar da, DNA ilavesi numune viskozitesini azaltacak ve hücre ayrılmasını artıracak ve bozulmamış hücrelerin yanı sıra lekelenme zarar görmeyecektir. Matik hücrelerin asyonu için FOX yöntemi, örneğin gen ekspresyon dinamiklerini incelemek için D-N-A-R-N-A ekstraksiyonu veya çeşitli epigenetik profilleme oluşturmak için kromatin immünopresipitasyon tekniği gibi çok çeşitli aşağı akış uygulamalarında kullanılabilir.