Efektör-Kompleksleri kullanarak BMP4 Mansabında Sinyal Algılama In situ PLA, Proximity ligasyon Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, doku kültürü hücrelerinde BMP sinyalini görselleştirmek ve ölçmektir. BMP'ler hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanır ve FOSFOLAT üç, smad efektörleri, smad bir, smad beş ve SMAD sekiz. Bunlar, smad four ile kompleksler oluşturur ve transkripsiyonu düzenledikleri çekirdeğe yer değiştirir.

Burada, BMP stimülasyonu olan veya olmayan doku kültürü hücrelerinde endojen SMA efektörleri ile smad four arasında oluşan kompleksleri görselleştirmek için PLA kullanıyoruz. Bu, biri fosforile edilmiş, smma, efektörlerin üçünü de tanıyan ve diğeri, her biri kendisine bağlı benzersiz bir kısa DNA zincirine sahip PLA probları adı verilen dört ikincil antikoru tanıyan iki birincil antikorun paralel kullanımı ile başlar ve PLA problarının yakın olduğu birincil antikorlara bağlanır. DNA zincirleri, DNA oligonükleotidlerini oluşturan iki dairenin müteakip eklenmesiyle etkileşime girer.

Bunlar enzimatik ligasyon ile birleştirilir ve amplifikasyon reaksiyonundan sonra yuvarlanan daire replikasyonu yoluyla amplifiye edilen bir daire oluşturur. Etiketli tamamlayıcı oligonükleotid problarının hibridizasyonu, her bir daireselleştirilmiş amplifikasyon ile ilişkili ürün floresan lekelerini vurgular. DNA ürünü kolayca görülebilir.

Floresan mikroskobu altında bakıldığında, lekeler, hücrede aktif BMP sinyalini gösteren efektör, seds ve smad four arasındaki komplekslere karşılık gelir. PLA'nın mevcut yöntemlere göre temel avantajları, kullanımının kolay olması, son derece hassas ve arka plansız olması ve yerinde aktif BMP sinyalizasyonunu ölçmek için kullanılabilmesidir. BMP yolu, çeşitli organ ve dokuların gelişimi ve kök hücre çoğalması ve farklılaşması dahil olmak üzere süreçler için gereklidir.

PLA, BMP sinyal dinamikleri, seviyeleri ve hücre altı lokalizasyonu ile ilgili temel soruları ele almak için kullanılabilir, ancak aynı zamanda tanı için de kullanılabilir. Bu yol çeşitli hastalıkların altında yattığından, BLA, BMP'nin veya diğer yolların diğer sinyal işlem bileşenlerini incelemek için kullanılabilir ve doku kesitleri veya tüm embriyolar üzerinde çalışmak üzere uyarlanabilir. Yerinde yakınlık ligasyon testine başlamak için hücre kültürlerini hazırlayın Neuro iki A hücresi, bir kez esansiyel olmayan amino asitler, bir kez piruvat ve bir kez L glutamin ile desteklenmiş% 10 FBS ile desteklenmiş GMEM'de kültürlenir.

Hücreleri tripsin kullanarak bölün ve kuyucuk başına 15.000 ila 20.000 hücre plakalayın. 16 oyuklu bir odacıklı slaytta, hücreleri 24 saat boyunca nemlendirilmiş% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. 24 saat sonra.

Kültür ortamını takviye edilmiş serumsuz GMEM ile değiştirin ve kontroller için iki ila üç saat daha inkübe edin. İkinci inkübasyondan sonra normal kültür ve koşullar altında hücrelerle üç kuyu tutun. Hücreleri iki mikromolar dorsa morfin ile tedavi ederek BMP yolunu inhibe edin veya hücreleri 10 ila 60 dakika boyunca BMP dört ile tedavi ederek sinyalleşmeyi indükleyin.

Hücre stimülasyonunu takiben, ortamı kuyucuklardan aspire edin ve hücre ayrılmasını önlemek için hücreleri PBS ile nazikçe yıkayın. PBS'yi doğrudan hücrelerin üzerine pipetlemeyin. Daha sonra PBS'yi aspire edin ve odaları çıkarın, ancak silikonu kuyucukların etrafında bırakın.

Kuyucuklara 50 mikrolitre taze hazırlanmış ve süzülmüş% 4 para formaldehit ekleyin ve çalkalamadan oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Fiksasyondan sonra, hücreleri bir copin kavanozunda çalkalayarak oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS ile yıkayın. Toplam üç yıkama için yıkamayı iki kez tekrarlayın.

Daha sonra, hücreleri bir copin kavanozunda PBS'de% 0.5 Triton X 100 ile geçirgen hale getirin ve çalkalamadan oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri% 0.05 ile 20 ve TB S3 kez, yıkama başına beş dakika boyunca, bir kaplin kavanozunda çalkalayarak yıkayın. Son yıkama solüsyonunu çıkarmak için sürgüye dokunarak engelleme prosedürünü başlatın.

Hücrelerin kurumasına izin vermemeye özen gösterin. Her birine engelleme çözümüne bir damla DUO bağlantısı ekleyin. Hücreleri, damıtılmış su ile boş bir pipet ucu kutusundan oluşan önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca bloke edici çözelti içinde inkübe edin.

Birincil antikor çözeltilerini hazırlamak için, anti fosfo smad 1, 5, 8 ve anti SMAD dört, ikili bağlantı iki antikor seyrelticisinde bir ila 100 seyreltin. Her antikoru tek başına ve kombinasyon halinde kullanın. Şimdi blokaj solüsyonunu slayttan çıkarmak için slayta dokunun ve uygun kuyucuklara 40 mikrolitre antikor solüsyonu ekleyin ve negatif kontrol Sadece seyreltici ile dahil edilebilir.

Hücrelerin kurumaması için bu adımı hızlı bir şekilde yapın. Şimdi slaytları önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Kuluçka sırasında, iki PLA probunu seyreltici içinde seyreltin.

Her reaksiyon için, her bir probun sekiz mikrolitresini ve 24 mikrolitre seyrelticiyi karıştırın, böylece problar çözelti içinde bir ila beş oranında seyreltilir. Bir saatlik inkübasyondan sonra, birincil antikor solüsyonunu hafifçe vurun ve slaytları Duo link ile iki kez Yıkama Tamponu a'ya her biri oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir kaplin kavanozunda çalkalayarak yıkayın. Yıkamalar tamamlandığında, kalan yıkama tamponunu A'yı slaytlardan çıkarın ve her birine 40 mikrolitre PLA prob solüsyonu ekleyin.

Şimdi, slaytları önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir saat boyunca ikili, ligasyon stoğuna bağlanır ve ligasyon karışımı için bir hacim hazırlar. Önce ikili bağlantıyı ligasyon stoğuna girdaplayarak ve yüksek saflıkta suda bir katına kadar seyrelterek.

Bu çözeltide Ligaz enziminin 40'a bir eklendiğini ve kuyucuk başına 40 mikrolitre karışıma ihtiyaç duyulduğunu dikkate alın. İnkübasyondan sonra, PLA prob solüsyonunu slaytlardan ayırın ve bunları Yıkama Tamponu ile iki kez yıkayın. Son yıkama sırasında bir kaplin kavanozunda çalkalama ile oda sıcaklığında beş dakika boyunca, Duo link Ligase çıkışlarını bir dondurma bloğunda alın ve ardından bir ila 40 ila 40 arasında bir son seyreltme ve Vorteks için ligasyon çözeltisine ekleyin.

Şimdi slaytlardan Yıkama Tamponu A'nın son hacmini çıkarın ve 40 mikrolitre ligasyon ekleyin. Her birine enzim ile karıştırın l. Slaytları önceden ısıtılmış bir nem odasında 30 dakika inkübe edin.

37 santigrat derecede DUO link amplifikasyon stoğunu çözün ve inkübasyon sırasında DUO Link amplifikasyon stoğunu yüksek saflıkta suda bir kez seyrelterek amplifikasyon adımına hazırlanın. Işığa duyarlı oldukları için reaktifleri ışıktan uzak tutun. Ligasyon adımı tamamlandığında, çözeltiyi hafifçe vurun ve slaytları Yıkama Tamponu A ile her biri oda sıcaklığında iki dakika boyunca iki dakika boyunca bir kaplin kavanozunda çalkalayarak yıkayın, son yıkama sırasında amplifikasyon çözeltisine 1, 2, 80 ve girdap. Yıkama tamponunu hafifçe vurduktan sonra, her bir oyuğa karıştırılmış 40 mikrolitre amplifikasyon ekleyin ve slaytları önceden ısıtılmış karanlık bir nem odasında 37 santigrat derecede 100 dakika inkübe edin.

Amplifikasyon inkübasyonu tamamlandıktan sonra, polimeraz çözeltisini slaytlardan ayırın ve bunları bir birleştirme kavanozunda bitki örtüsü ile yıkama başına 10 dakika boyunca iki kez Yıkama tamponu B'de yıkayın, reaktifler ışığa duyarlı olduğu için bu adım sırasında slaytları ışıktan uzak tutun. İki yıkamayı 0.1 kez yıkama tamponu B'ye daldırarak takip edin.Şimdi silikonu 16'dan tamamen çıkarın. İyi, daha sonra ikilinin yaklaşık 40 mikrolitresinde kaydırın.

Montaj ortamına dappy ile bir kapak kızağına bağlayın ve yavaşça numunelerin üzerine yerleştirin, kapak kızağının altında hava kabarcığı kalmayacak şekilde hafifçe bastırın, kapak fişini oje kullanarak slayt üzerine sabitleyin ve kapatın, görüntülemeden en az 15 dakika önce bekleyin. Bunlar, BMP yolunun bir inhibitörü olan iki mikromolar dorsa morfin ile muamele edilen veya mililitre başına 25 nanogram ile muamele edilen hücrelerin konfokal görüntüleridir. 60 dakika boyunca BMP dört.

Fosfo Smad 1 58 ve Smad dört'e karşı antikorlar, aktif smad komplekslerini tespit etmek için kullanıldı ve kırmızı noktalar olarak görüldü. Hücre nükleeri dpi ile mavi olarak sürdürüldü. PLA sinyalleri, DUO link görüntü aracı yazılımı ile sayıldı ve hücre başına çekirdekteki ortalama nokta sayısı grafikte sunuldu.

Her iki primer antikor tek başına kullanıldığında lekelenme görülmez, bu da PLA problarının arka plan bulgusunun ve ardından oligonükleotidlerin ligasyonunun olmadığını gösterir. Benzer şekilde, her iki primer antikoru yayan başka bir negatif kontrolde hiçbir nokta tespit edilmez. Nöro iki A hücresinde SDS sayfası immün bloklama, tedavi edilmemiş ve BMP ile tedavi edilmiş hücrelerde fosfo ile ilişkili SMAD 1 5 8'i ortaya çıkarır.

Bununla birlikte, dorsal morfin ile tedavi edilen hücrelerde fosfo smad seviyeleri belirgin şekilde azalır. PCNA'ya karşı antikor bir yükleme kontrolü sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin sabitlenmesinden sonra altı saatten daha kısa bir sürede sonuç elde etmek için önerdiğimiz adımları ve kurulumu nasıl takip edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Özetle, adımlar primer antikor inkübasyonunu bloke etmek, PLA prob inkübasyonu, ligasyon amplifikasyonu, bir görüntülemenin monte edilmesidir.