Efektör-Kompleksleri kullanarak BMP4 Mansabında Sinyal Algılama In situ PLA, Proximity ligasyon Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, doku kültürü hücrelerinde BMP sinyalizasyonunu görselleştirmek ve nicelleştirmektir. BMP'ler hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanır ve üç smad efektörünü, smad one, smad five ve SMAD eight'i fosforiler. Bunlar smad four ile kompleksler oluşturur ve transkripsiyonu düzenledikleri çekirdeğe transloke olurlar.

Burada, BMP stimülasyonu olan veya olmayan doku kültürü hücrelerinde, endojen SMA efektörleri ile smad dört arasında oluşan kompleksleri görselleştirmek için PLA kullanıyoruz. İşlem, biri üç fosforile smma efektörünün tamamını tanıyan, diğeri ise smad dört'ü tanıyan iki primer antikorun paralel kullanımıyla başlar; her birine benzersiz kısa bir DNA dizisi eklenmiş PLA probları adı verilen sekonder antikorlar, primer antikorlara bağlanır ve böylece PLA probları birbirine yakın konumda yer alır. DNA dizileri, ardından eklenen iki çember oluşturucu DNA oligonükleotidi aracılığıyla etkileşime girer.

Bunlar enzimatik ligasyonla birbirine bağlanır ve amplifikasyon reaksiyonundan sonra rolling circle replikasyonu yoluyla çoğaltılan bir halka oluşturur. İşaretli tamamlayıcı oligonükleotid probların hibridizasyonu, her bir halkalaşmış DNA ürününün amplifikasyonu ile ilişkili floresan ürün lekelerini belirginleştirir. DNA ürünleri kolayca görülebilir.

Floresan mikroskobu altında incelendiğinde, noktalar efektör, seds ve smad four arasındaki komplekslere karşılık gelir ve bunlar hücrede aktif BMP sinyalizasyonunu belirtir. PLA'nın mevcut yöntemlere göre temel avantajları; kullanımının kolay olması, yüksek hassasiyete sahip olması, arka plan gürültüsü içermemesi ve in situ aktif BMP sinyalizasyonunu nicelendirmek için kullanılabilmesidir. BMP yolu, birçok organ ve dokunun gelişiminin yanı sıra kök hücre proliferasyonu ve diferansiyasyonu dahil olmak üzere çeşitli süreçler için gereklidir.

PLA, BMP sinyalizasyon dinamikleri, seviyeleri ve hücre altı lokalizasyonuna ilişkin temel soruları yanıtlamak için kullanılabileceği gibi, tanı amacıyla da kullanılabilir. Bu yolak çeşitli hastalıkların temelini oluşturduğu için, BLA diğer BMP veya farklı yolakların sinyal iletim bileşenlerini incelemek için kullanılabilir ve doku kesitleri veya bütün embriyolar üzerinde çalışacak şekilde uyarlanabilir. In situ yakınlık ligasyon analizine başlamak için hücre kültürlerini hazırlayın; Neuro 2A hücreleri, %10 FBS, 1x temel olmayan amino asitler, 1x piruvat ve 1x L-glutamin ile desteklenmiş GMEM içerisinde kültüre edilir.

Hücreleri tripsin kullanarak ayırın ve kuyu başına 15.000 ila 20.000 hücre ekleyin. 16 kuyucuklu bir chamber slide içerisinde, hücreleri %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. 24 saat sonra.

Kontroller için kültür ortamını takviye edilmiş serumsuz GMEM ile değiştirin ve iki ila üç saat daha inkübe edin. İkinci inkübasyondan sonra hücre içeren üç kuyuğu normal kültür ve koşullarda tutun. Hücreleri iki mikromolar dorsa morfin ile işleme tabi tutarak BMP yolunu inhibe edin veya hücreleri 10 ila 60 dakika boyunca BMP dört ile işleme tabi tutarak sinyallemeyi indükleyin.

Hücre stimülasyonunun ardından, kuyucuklardaki besiyerini aspire edin ve hücrelerin kopmasını önlemek için hücreleri PBS ile nazikçe yıkayın. PBS'yi doğrudan hücrelerin üzerine pipetlemeyin. Ardından PBS'yi aspire edin ve kuyucukların etrafındaki silikonu bırakarak şamberleri çıkarın.

Kuyucuklara taze hazırlanmış ve filtrelenmiş %4 paraformaldehitten 50 µL ekleyin ve oda sıcaklığında, çalkalamadan 10 dakika boyunca inkübe edin. Fiksasyon işleminden sonra hücreleri oda sıcaklığında, bir copin jar içerisinde çalkalayarak beş dakika boyunca PBS ile yıkayın. Yıkama işlemini toplam üç yıkama olacak şekilde iki kez daha tekrarlayın.

Ardından, hücreleri bir kopin kavanozunda PBS içindeki %0.5 Triton X 100 ile geçirgen hale getirin ve oda sıcaklığında, ajitasyon uygulamadan 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra hücreleri bir kopin kavanozunda, her yıkama için beş dakika boyunca ajitasyon uygulayarak %0.05 Tween 20 ve TBS ile 3 kez yıkayın. Son yıkama solüsyonunu uzaklaştırmak için lamı hafifçe vurarak bloklama işlemine başlayın.

Hücrelerin kurumamasına dikkat ederek, her bir kuyucuğa bloklama çözeltisi içerisine bir damla DUO link ekleyin. Hücreleri, içerisinde distile su bulunan boş bir pipet ucu kutusundan oluşan önceden ısıtılmış nemlendirme odasında, 37 °C'de 30 dakika boyunca bloklama çözeltisinde inkübe edin.

Birincil antikor çözeltilerini hazırlamak için, anti phospho smad 1 5 8 ve anti SMAD four'u duo link two antikor seyrelticide 1:100 oranında seyreltin. Her bir antikoru tek başına ve kombinasyon halinde kullanın. Şimdi, bloklama çözeltisini lamdan uzaklaştırmak için lama hafifçe vurun ve uygun kuyucuklara ve negatif kontrole 40 µL antikor çözeltisi ekleyin; negatif kontrol için yalnızca seyreltici kullanılabilir.

Hücrelerin kurumaması için bu adımı hızlıca gerçekleştirin. Şimdi lamları, önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir bölmede 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında, iki PLA probunu seyrelticide seyreltin.

Her bir reaksiyon karışımı için, probların çözelti içinde bire beşe seyreltilmesi amacıyla her bir probdan sekiz µL ve 24 µL dilüent ekleyin. Bir saatlik inkübasyonun ardından, primer antikor çözeltisini boşaltın ve slaytları, bir bağlantı kabı içerisinde oda sıcaklığında, ajitasyon eşliğinde beşer dakika süreyle Duo link to Wash Buffer a ile iki kez yıkayın. Yıkama işlemleri tamamlandığında, slaytlarda kalan wash buffer A'yı boşaltın ve her birine 40 µL PLA prob çözeltisi ekleyin.

Şimdi lamları, önceden ısıtılmış nemli bir inkübasyon kabında 37 °C'de inkübe edin. Bir saat boyunca, DuoLink ligasyon stok çözeltisini kullanın ve ligasyon karışımı için gerekli hacmi hazırlayın. Bunun için önce DuoLink ligasyon stok çözeltisini vorteksleyin ve yüksek saflıktaki su ile 1x konsantrasyona seyreltin.

Ligaz enziminin bu çözeltiye 1/40 oranında eklendiğini ve kuyucuk başına 40 µL karışımın gerektiğini göz önünde bulundurun. İnkübasyondan sonra, PLA prob çözeltisini lamlardan boşaltın ve lamları iki kez Yıkama Tamponu ile yıkayın. Son yıkama sırasında, oda sıcaklığında bir karıştırma kabında beş dakika boyunca ajitasyon uygulayın; Duo link Ligazı dondurucu bloktan çıkarın ve ardından ligasyon çözeltisine 1/40 son dilüsyon oranında ekleyip Vortex ile karıştırın.

Şimdi lamlar üzerindeki son Yıkama Tamponu A hacmini boşaltın ve 40 µL ligasyon ekleyin. Her birine enzimle birlikte karıştırın. Lamları önceden ısıtılmış bir nemlendirme odasında 30 dakika boyunca inkübe edin.

DUO link amplifikasyon stokunu 37 °C'de çözün ve inkübasyon sırasındaki amplifikasyon aşamasına hazırlanmak için DUO Link amplifikasyon stokunu yüksek saflıkta su ile 1X olacak şekilde seyreltin. Reaktifler ışığa duyarlı olduğundan onları ışıktan uzak tutun. Ligasyon aşaması tamamlandığında, solüsyonu boşaltın ve lamları oda sıcaklığında, bir karıştırma kabı içinde ajitasyonla, her biri iki dakika boyunca iki kez Wash Buffer A ile yıkayın; son yıkama sırasında, DUO link polimerazı amplifikasyon solüsyonuna 1:80 nihai seyreltme oranında ekleyin ve vorteksleyin. Yıkama tamponunu boşalttıktan sonra, her kuyucuğa 40 µL amplifikasyon karışımı ekleyin ve lamları önceden ısıtılmış karanlık bir nemlendirme odasında 37 °C'de 100 dakika boyunca inkübe edin.

Amplifikasyon inkübasyonu tamamlandığında, polimeraz çözeltisini lamlar üzerinden süzün ve lamları bir bağlama kavanozunda, her yıkama için 10 dakika boyunca iki kez Yıkama tamponu B ile yıkayın; reaktifler ışığa duyarlı olduğundan bu adım boyunca lamları ışıktan uzak tutun. Bu iki yıkamayı, 0,1 kat yoğunluktaki yıkama tamponu B içerisine daldırarak takip edin. Şimdi 16 kuyucuklu lam üzerindeki silikonu tamamen temizleyin ve ardından yaklaşık 40 µL duo ekleyin.

Kapak camına bir damla montaj medyumu ekleyin ve örneğin üzerine nazikçe yerleştirin; kapak camının altında hava kabarcığı kalmaması için hafifçe bastırın, oje kullanarak kapak camını lama sabitleyin ve mühürleyin, görüntüleme öncesinde en az 15 dakika bekleyin. Bunlar, BMP yolunun bir inhibitörü olan 2 µM dorsa morphine ile veya 60 dakika boyunca 25 ng/mL BMP four ile işlem görmüş hücrelerin konfokal görüntüleridir.

Aktif smad komplekslerini tespit etmek için Phospho Smad 1 58 ve Smad four antikorları kullanılmıştır ve bunlar kırmızı noktalar şeklinde görülmektedir. Hücre çekirdeği dpi ile maviye boyanmıştır. PLA sinyalleri DUO link image tool yazılımı ile sayılmış olup, hücre başına çekirdekteki ortalama nokta sayısı grafikte sunulmuştur.

Birincil antikorlardan herhangi birinin tek başına kullanılması durumunda boyanma görülmemesi, PLA problarının arka plan bulgusu olmadığını ve oligonükleotitlerin ardından gelen ligasyonu olmadığını göstermektedir. Benzer şekilde, her iki birincil antikoru da içeren başka bir negatif kontrolde hiçbir nokta tespit edilmemiştir. Neuro 2A hücrelerinde SDS-PAGE immünobloting, işlem görmemiş ve BMP ile işlem görmüş hücrelerde fosforilasyonla ilişkili SMAD 1 5 8'i ortaya çıkarmaktadır.

Buna karşın, dorsal morfin ile işlem gören hücrelerde fosfo smad seviyeleri belirgin şekilde azalmıştır. PCNA'ya karşı kullanılan antikor, yükleme kontrolü sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin fikse edilmesinden sonra altı saatten kısa sürede sonuçlar elde etmek için önerdiğimiz kurulumu ve adımları nasıl takip edeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Özetle adımlar; primer antikor inkübasyonunun bloklanması, PLA prob inkübasyonu, ligasyon amplifikasyonu, montaj ve görüntülemedir.