Name: Efektör-Kompleksleri kullanarak BMP4 Mansabında Sinyal Algılama In situ PLA, Proximity ligasyon Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-03T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Öğrenin, hücre kültürlerinde BMP4 sinyalini görselleştirmek ve etkin etkileyici kompleksleri nicelendirmek için in situ PLA yöntemini. Bu hassas teknik, kemik morfojenetik protein sinyal yolaklarını in vivo çalışmak için araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, MRC ve BBSRC hibe tarafından finanse edilmektedir. Biz teknik ve faydalı öneri kurma yardımcı olmak için, Uppsala Üniversitesi Agata Ulf Landegren Lab Zieba ve Katerina Pardalis teşekkür ederiz. Teknik yardım ve sunum için Olink Biosience.

1. Hücre Kaplama ve BMP ile tedavi <ol><li> GMEM Kültür Neuro2a hücrelerin% 10 FBS ile desteklenmiş, 1x Sigara Esansiyel amino asitler (NEAM), 1x sodyum piruvat ve L-glutamin 1x. 16-kuyu oda slayt tripsin (% 0.05-EDTA) ve de her plaka 15,000-20,000 hücreleri kullanarak hücrelerin Böl. DMEM Kültür HEK293T veya Cos7 hücrelerin% 10 FBS, 1x L-glutamin ve 1x Penisilin / Streptomisin ile desteklenmiştir. % 70 etanol onları çeker ve 1 cm 2 kuyu çizmek Immedge kalem kullanarak polysine slaytlar sterilize edin. 50 inoküle tripsin (% 0.05-EDTA) ve de her plaka 20,000-25,000 hücreleri kullanarak hücrelerin Böl. </li><li> 37 ° hücreleri inkübe ° C nemlendirilmiş,% 5 CO2 inkübatör. </li><li> 24 saat sonra saat Neuro2a serum serbest GMEM (albümin% 0.1, 1x NEAM, 1x sodyum piruvat ve L-glutamin 1x ile desteklenmiş) ile veya HEK293T serum serbest DMEM (L-Glutamine ve 1x Penisilin / Streptomisin ile desteklenmiş) ile orta yerine / Cos7 ve hücreleri 2-3 saat süreyle inkübe Hücreleri kontrol grubu olarak kullanmak için, normal culturing koşullar altında (yani% 10 FBS) ile üç kuyu tutun. </li><li> Istenilen zaman için dorsomorphin (BMP yolun, 2 mcM inhibitörü) veya BMP4 (25 ng / ml) hücreleri (örneğin 10 dakika-1 saat) 5 davranın. </li></ol> 2. Fiksasyon ve Permeabilization <ol><li> Sabitleştirici,% 4 PFA hazırlayın. 100 ml PBS içinde% 4 çözelti hazırlamak için 4 g PFA tartılır. Çözüm Sıcak 50 ° C 'ye kadar açıktır. Kullanana kadar 4 0.22 mikron filtre ve mağaza ° C ile çözüm Filtresi. Taze fiksatif (en fazla 2 gün boyunca saklanan) kullanın. </li><li> Aspire kuyulardan orta ve 1xPBS bol suyla yıkayın. Bu hücrelerin ayrılması sonucu olarak hücreler üzerine doğrudan çözümler pipetle etmeyin. Odasının slaytlar kullanılması halinde, bir sonraki adıma geçmeden önce, odaları kaldırmak, ancak kuyuları etrafında silikon bırakın. </li><li> Ajitasyon olmadan, RT, 10 dakika süreyle 50 ul% 4 PFA ve inkübe ekle. </li><li> RT ajitasyon ile bir Coplin kavanoza 3 x 5 dakika hücreler PBS ile yıkayın. </li><li> PBS içinde% 0,5 'lik Triton X-100 RT ajitasyon olmadan 10 dakika ile hücreleri davranın. </li><li> TBS içinde% 0.05 Tween 20 (TBS-T) ile hücrelerin RT ajitasyon ile bir Coplin kavanoza 3 x 5 dakika yıkayınız. </li></ol> 3. Engelleme <ol><li> TBS-T dokunun. De ortalama Duolink II Engelleme Çözüm (1x) bir damla ekleyin. </li><li> 37 1 saat önceden ısıtılmış nem kabini ° C slaytlar inkübe </li></ol> 4. Primer Antikorlar <ol><li> Mix ve 1:100 aP-Smad1/5/8 (tavşan poliklonal) sulandırmak ve Duolink II Antikor Dilüent (1x) 1:100 bir Smad4 (fare monoklonal). Kontrolleri için kullanılmak üzere aynı konsantrasyonlarda da aP-Smad1/5/8 hazırlayın ve bir Smad4 yalnız. </li><li> Slaytları Engelleme Çözüm dokunun. Mümkün olduğunca engelleme çözüm çıkarın, ancak hücrelerin antikor eklemeden önce kuruması için ekstra özen. Kuyular için antikor çözümleri 40 ul ekleyin. Birinde sadece ek bir negatif kontrol olarak Antikor Diluent ekleyin. </li></ol> 5. PLA probları <ol><li> Antikor Seyreltici iki PLA sondalar (Duolink II anti-Mouse EKSİ ve Duolink II anti-Tavşan PLUS) 01:05 sulandırınız. </li><li> Slaytlar birincil antikor çözüm dokunun. 1x Duolink II Yıkama Tamponu her slaytları 2 kez 5 dakika yıkayın RT ajitasyon ile Coplin kavanoza. </li><li> A slaytlar Yıkama Tamponu dokunun ve PLA prob çözümü eklemek (40 ul / iyi). 37 1 saat önceden ısıtılmış nem kabini ° C slaytlar inkübe </li></ol> 6. Ligasyonu <ol><li> Vortex Duolink II ligasyon stoku (5x) ve yüksek saflıkta su eklenir ve karıştırılır 01:05 sulandırmak. Su hacmi hesaplarken sadece kuyulardan karışımı ilave önce 01:40 son bir seyreltme eklenecektir ligaz hacmi dikkate alır. </li><li> Slaytlar PLA prob çözüm dokunun. 1x Yıkama Tamponu slaytlar RT ajitasyon ile bir Coplin kavanoz 2 kez için her biri 5 dakika yıkayınız. </li><li> Ligaz donma blok kullanarak derin dondurucuda (-20 ° C) dışarı atın. Ligaz 1:40 seyreltme ve vorteks ligasyon solüsyonu (6.1 hazırlanan) ekleyin. </li><li> A slaytlar Yıkama Tamponu dokunun ve ligasyon ligaz çözüm ekleyin her iyi (40 ul / iyi). 37 az 30 dakika önceden ısıtılmış nem kabini ° C slaytlar inkübe </li></ol> 7. Amplifikasyon Not: Açık duyarlı reaktifler. Işıktan koruyarak slaytları tutun. <ol><li> Yüksek saflıkta su eklenir ve karıştırılır Duolink II Amplifikasyon stok (5x) 01:05 sulandırınız. Su hacmi dikkate 1:80 inci karışımı yanı sıra daha önce nihai bir seyreltme eklenecektir Polimeraz hacmi hesaplanırkene kuyular. </li><li> Slaytları ligasyon ligaz çözüm dokunun. 1x Yıkama Tamponu slaytlar RT ajitasyon ile bir Coplin kavanoza 2 kez her biri 2 dakika yıkayın. </li><li> Bir dondurma blok kullanarak derin dondurucuda (-20 ° C) Polimeraz çıkarın. Polimeraz 1:80 seyreltme ve vorteks Amplifikasyon solüsyonu (7.1 'de hazırlanan) ekleyin. </li><li> A slaytlar Yıkama Tamponu dokunun ve Amplifikasyon Polimeraz çözüm ekleyin her iyi (40 ul / iyi). 37 100 dk önceden ısıtılmış nem kabini ° C slaytlar inkübe </li></ol> 8. Görüntüleme için hazırlanması Not: Açık duyarlı reaktifler. Işıktan koruyarak slaytları tutun. <ol><li> Slaytları Amplifikasyon Polimeraz çözüm dokunun ve RT ajitasyon 1x Duolink II Yıkama Tamponu B ile bir Coplin kavanoza her 2 kez 10dk yıkayın. </li><li> 0,1 x Yıkama Tamponu B. slaytlar Dip </li><li> 16-iyi slayt tamamen silikon çıkarın. Lamel DAPI ile Orta Montaj Duolink II ~ 40μl ekleyin ve hafifçe bastırarak biraz bu yüzden kapak kayma altında hiç hava kabarcığı kalmamasına dikkat örnekleri üzerine yerleştirin. Düzeltme ve tırnak cilası kullanarak slayt lamel mühür. Görüntülemeye devam etmeden önce en az 15 dakika bekleyin. </li><li> Konfokal veya floresan mikroskobu ile numunelerin analiz edin. Dijital görüntü elde edin. </li></ol> 9 - Niceleme Not: Açık duyarlı reaktifler. Işıktan koruyarak slaytları tutun. <ol><li> Duolink ImageTool sinyal seviyesi ölçümü, görüntü sinyalleri saymak için kullanın. </li><li> Ölçümlerini karşılaştırın ve bir grafik yapmak. </li></ol> 10 Temsilcisi Sonuçlar Bir yerinde PLA deney sonucu olarak ayrık floresan noktalar gösterir. Sinyal konumu çalışılan spesifik proteinlerin bağlıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 in situ PLA BMP4 stimülasyon sonrasında Neuro2a hücreleri üzerinde. Hücreler 2 mcM dorsomorphin (BMP yolun inhibitörü) (A) veya 25 ng / ml BMP4 ile tedavi edilen (B) için tedavi edilmeyen 60 dakika veya sol (CE). P-Smad1/5/8 ve Smad4 karşı antikorlar, A ve B tek başına aP-Smad1/5/8 (C) primer antikor ve Smad4 tek başına (D) veya primer ihmal aktif kompleksleri tespit etmek için kullanılan antikorlar (E), kontrol grubu olarak kullanılmıştır. Mavi: DAPI Kırmızı: PLA sinyal. Resimler Leica SP5 konfokal mikroskop ile elde edildi. (F) PLA sinyalleri Duolink ImageTool yazılımı ile sayıldı ve hücre başına çekirdeğinde noktalar ortalama sayısı grafikte sunulmuştur. (G) Neuro2a hücrelerinin tedavi edilmezse veya Dorsomorphin (2 mcM) ya da 60 dakika için BMP4 (25 ng / ml) ile tedavi edildi. Hücreler parçalanmış ve proteinleri SDS-PAGE ve yükleme gibi kontrolü aP-Smad1/5/8 ve a-PCNA immün analiz edildi. (*) Non-spesifik bir grup. AP-Smad1/5/8 antikor 3 farklı proteinler arasındaki farkı ayırt edemezsiniz Not Smad4 karmaşık mevcut.

<ol><li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. one <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li>
<li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun%2FAP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun%2FFra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 Forthcoming.</li>
<li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li>
<li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor%2Fretinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li>
</ol>

Bu video-makale üretimi yakınlığı ligasyonu deneyi prosedürü kullanılan bir reaktif kimin OLINK tarafından sponsor oldu.

In situ protein kompleksleri görselleştirme özellikle protein etkileşimleri ve protein modifikasyonu hücrelerin kendi yüzeyinden çekirdeğine bir sinyal göndermek için kullandıkları araçlardır sinyalizasyon çalışmaları için büyük bir talep. Önce immünofloresan in situ iki endojen proteinler arasındaki kompleksleri görselleştirmek ve ölçmek için mümkün olmamıştır. Co-antikor lokalizasyonu düşük çözünürlükte sergileyen ve gerçek etkileşim görselleştirmek için kullanılamaz. PLA araştırmacılar büyük bir başarı 6, 7 farklı sistemler kullanarak başladı yeni bir tekniktir. Burada, zamanla alt-BMP stimülasyon aktif smad etkileyiciler arasında endojen kompleksleri görselleştirmek için değil, aynı zamanda ölçmek için yalnızca PLA nasıl kullanılacağını göstermektedir. Biz Neuro2a ve (Şekil 1) elde etmek için farklı türler (fare bir Smad4 ve tavşan aP-Smad1/5/8) yükseltilmiş ticari antikorlar dayanıyordu de dahil olmak üzere farklı doku kültürü hücreleri kullanıldı. Bu yöntem tüm Smad4 ile aktif kompleksleri yapan olmayabilir fosforile Smad1/5/8 sadece varlığı değil, zaman içinde BMP efektör komplekslerinin aktivasyon ve ilk kez, bize izin verdi. Biz sinyalleri (Şekil 1F) sayılır ve aynı hücreler 8 (şekil 1G), immunoblotting elde miktarının ölçüm karşılaştırıldı. Biz noktaların sayısı zamanla seviyesini sinyal doğru bir karşılaştırmalı ölçme sağladığı sonucuna vardı. Tekniği de benzer sonuçlar veren diğer hücre hatları (HEK293T ve Cos7) (veriler gösterilmemiştir) uygulandı. Teknoloji ilkesi Duolink kiti ile sağlanan iki eşsiz probları dayanmaktadır. Her PLA prob, bir muhabir gibi davranan eşsiz bir sentetik oligonükleotid, bağlı ikincil bir antikor oluşur. Probların yakınlık tam yerde bu problar yakınlık bağlı olan DNA ligasyonu sağlar. DNA hibridizasyon ve ligasyon küçük (&lt;40 nm) ve bu nedenle sağlar oligonükleotidler, mesafe, etkileşim, yalnızca proteinlerin ligasyonu izin verebilirsiniz. Bağlandı DNA amplifiye ve güçlendirilmiş dizisi etiketli oligonükleotidler hibridizasyon ile tespit edilebilir. Amplifikasyonu DNA-DNA hibridizasyon prensipleri bağlı olarak özel ve bağlandı DNA ilk ligasyonu olay geliştirme birkaç kat amplifiye olarak da yüksek hassasiyet sağlar. Çoğaltılan DNA etiketli oligonükleotidler hibridizasyon tarafından algılanır ve görünür ve oldukça geniş bir nokta üretir. Gibi noktalar sayılabilir, PLA tam uzamsal bilgiyi (etkileşim olayların yerini) 2-4 bu olayların nicel değil, aynı zamanda objektif bir şekilde sadece sinyal sağlar. Protein etkileşimlerinin tespiti için istihdam edilen diğer teknikler co-immunoprecipitation, immunofluoresence ve Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) sayılabilir. Protein komplekslerinin izolasyon sağlayan Co-immunoprecipitation testlerin yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem proteinleri tespit etmek için nispeten yüksek düzeyde ifade edilmesi gerektiği anlamına gelir immün eşlik ediyor. Yüksek arka plan veya boncuk bazı proteinlerin non-spesifik bağlanma Sorunları ortak immunoprecipitation aşmak için bazen zor. Buna ek olarak, ortak-immunoprecipitation deneyleri proteinlerin bir protein kompleksinin bir parçası olabilir algılama izin verir ancak birbirleri ile fiziksel olarak etkileşim çok yakın olduğunu ayırt edemez. Ayrıca, tek bir hücre, hücre içinde protein kompleksleri lokalizasyonu çözünürlük veya bilgi co-immunoprecipitations kantitatif sağlamak değildir. Immunofluoresence bir hücre veya bir hücre bölmesi protein kompleksleri, eş-varlık tespiti, bu nedenle üst üste yayılmış sinyalleri dayalı ve düşük uzaysal çözünürlüğe sahiptir ve protein etkileşimleri hakkında doğru bilgi sağlayamaz. Birkaç kat fark olduğunu ve sadece doğru veya PLA lekeler olarak ölçülebilir olamaz immunofluoresence sinyali sayısal görsel tahmini yapılabilir. FRET canlı hücrelerde protein kompleksleri görselleştirme sağlar ve antikorları için, epitopunun ihtiyaç ve pozlama üstesinden gelir. Ancak, genellikle FRET PLA gibi endojen protein kompleksleri yansıtmıyor olabilir yapay erimiş proteinler, aşırı ekspresyonu bağlıdır. PLA protokolü Engelleme koşulları antikor agregasyonu oluşur ve arka plan artırabilir kritik öneme sahiptir. Alternatif engelleme koşulları antikor ürün sayfaları bulunabilir. Primer ve sekonder antikor ihmal Uygun kontroller yanlış gitmiş olabilir bilgi vermek ve her zaman dahil edilmesi gerekir. Bunların bir arada olduğu zaman, bunlar tek başına kullanıldığında en az arka plan ve en iyi sinyal verecek farklı antikorları ekrana önemlidir. Cel, fiksasyonuprosedürün adımları sırasında yetersiz fiksasyon protein kompleksleri kaybına yol açabilir ise aşırı sabitleme, protein kompleksleri tam doğasını ve düşmeye neden olabilir ls kritik öneme sahiptir. Bu% 3 fiksatif konsantrasyonunu düşürerek veya fiksasyonun süresinin kısaltılması, kontrol edilebilir. Ancak, fiksasyon olmadığını primer antikorlar denatüre proteinler ya da farkındayız de bağlıdır. PLA tekniği çok hassas olduğu için, özel bakım kuluçka süreleri ve mikro koşulları farklı örnekleri arasında eşit tutmak için gereklidir. Örnekleri son adım önce herhangi bir durumda kuru bırakılmamalıdır. Numunelerin kurutulması artan arka yol açabilir. Engelleme çözümünün tümüyle kaldırılmasını da arka plan önlemek için kritik öneme sahiptir. , Düşük sıcaklıkta enzimatik reaksiyonları yavaşlatır yıkama tamponlar her zaman kullanmadan önce oda sıcaklığına getirilmiş olmalıdır. Daha fazla sorun giderme için Kit kılavuzuna başvurun. PLA sinyali (örneğin DAPI, aktin vb) alt hücresel yerleşimi tespit etmek için boyaların kullanımı için faydalıdır. Burada çekirdeklerin leke DAPI (montaj orta) kullandık. PLA, hücre tipi veya cep bölmesi (burada gösterilmemiştir) belirlemek için antikorlar ile immünofloresan kullanımı ile uyumludur. Doğru kantifikasyon sinyalleri ve özel bir yazılım kullanımı (Duolink Görüntü Aracı, Olink Biosience) sayım yapılabilir. Son derece hassas, kullanımı kolay, arka plan ve aktif BMP yerinde sinyal ölçmek için eşsiz bir yetenek: Sonuç olarak, BMP sabit hücrelerinde sinyalizasyon ve avantajları sundu algılamak için Duolink kiti kullanılarak, yerinde PLA nasıl kullanılacağını göstermiştir. Farklı protein etkileşimleri çalışmak için bu tekniği uygulayarak sınırlama soruşturma altında proteinleri tanıyan birincil antikor erişilebilirliği ve kalitesi bağlıdır.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21710025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>AutogenBioclear</td><td>7.01</td><td></td></tr><tr><td>Temel olmayan amino asitler</td><td>Invitrogen</td><td>11149068</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, %0,05 (1X) EDTA 4Na ile, sıvı</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>16 gözlü chamber slide'lar</td><td>Lab-Tek</td><td>178599</td><td></td></tr><tr><td>Polizini</td><td>VWR international</td><td>631-0107</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı</td><td>VWR international</td><td>631-0138</td><td></td></tr><tr><td>a-pSmad1/5/8</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9511</td><td></td></tr><tr><td>a-Smad4 (B8) </td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-7966</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfini</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>171260-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Mouse BMP-4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega Corp.</td><td>H5151</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Deteksiyon Reaktifleri (Turuncu)&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92007-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probu anti-Mouse MINUS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92004-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probu anti-Rabbit PLUS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92002-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">DAPI içeren Duolink II Montaj Medyumu&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82040-0005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Floresan Yıkama Tamponları&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82049</td><td></td></tr></tbody></table>

efektör-kompleksleri kullanarak bmp4 mansabında sinyal algılama in situ pla, proximity ligasyon testi

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMP, gelişimsel ve biyolojik etkileri geniş bir yelpazede sorumludur. BMP reseptörleri (phosphorylate) Smad4 ile karmaşık bir form ve BMP özel mansap etkileri 1 başlatmak için transkripsiyon faktörleri olarak işlev çekirdeğine yerini değiştirmek Smad1/5/8 etkileyiciler etkinleştirin. Geleneksel fosfor-smad peptidler karşı antikorlar ile immüno-floresans teknikleri, düşük duyarlılık, yüksek arka plan gösterirler ve bu floresan ışığa ise özellikle antikor sinyal yoğunluğu güveniyor brüt kantifikasyon sunuyoruz. Buna ek olarak, fosfor-Smads Smad4 karmaşık ve aktif transkripsiyon yapan. In situ PLA yüksek özgüllük ve duyarlılık 2-4 ile protein etkileşimleri tespit edebilen bir teknoloji. Bu yeni teknoloji, proteinin DNA vekil amplifikasyon çiftler antikor tanıma. Bu tanıma olayı tam konumunu açığa noktalar bir form lokalize, ayrık bir sinyal üretir. Sinyallerin sayısı ve bir ölçüm sağlayan mukayese edilebilir. Biz, bu sadece sinyalizasyon ile ortaya çıkan karmaşık bir yakınlık, yani sadece BMP sinyal etkileyiciler phospho-Smad1/5/8 ve Smad4 algılanmasını sağlar antikor bir kombinasyonu ile Duolink kiti kullanılarak, yerinde PLA uygulanan aktivasyonu. Bu ilk kez BMP4 uyarımı altında bir süre ders deneyde yüksek özgüllük ve duyarlılık ile sinyalizasyon endojen BMP görüntüleme ve ölçüm izin verdi.

Burada kemik morfogenetik protein (BMP) sabit hücreler sinyal görselleştirmek için antikor kombinasyonu ile yakınlık ligasyon Assay (PLA), nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu teknik bize BMP4 uyarımı altında efektör-kompleksleri aktif endojen BMP nükleer birikimi takip etmek ve zaman içinde bunların seviyelerini ölçmek için izin verdi.

Efektör-Kompleksleri kullanarak BMP4 Mansabında Sinyal Algılama In situ PLA, Proximity ligasyon Testi

BMP'ler, geniş bir gelişimsel ve biyolojik etkiden sorumludur. BMP reseptörleri, daha sonra ... olan Smad1/5/8 efektörlerini aktive eder (fosforiller).

Aşağıdaki deneyin genel amacı, doku kültürü hücrelerinde BMP sinyalizasyonunu görselleştirmek ve nicelleştirmektir. BMP'ler hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanır ve üç smad efektörünü, smad one, smad five ve SMAD eight'i fosforiler. Bunlar smad four ile kompleksler oluşturur ve transkripsiyonu düzenledikleri çekirdeğe transloke olurlar.Burada, BMP stimülasyonu olan veya olmayan doku kültürü hücrelerinde, endojen SMA efektörleri ile smad dört arasında oluşan kompleksleri görselleştirmek için PLA kullanıyoruz. İşlem, biri üç fosforile smma efektörünün tamamını tanıyan, diğeri ise smad dört'ü tanıyan iki primer antikorun paralel kullanımıyla başlar; her birine benzersiz kısa bir DNA dizisi eklenmiş PLA probları adı verilen sekonder antikorlar, primer antikorlara bağlanır ve böylece PLA probları birbirine yakın konumda yer alır. DNA dizileri, ardından eklenen iki çember oluşturucu DNA oligonükleotidi aracılığıyla etkileşime girer.Bunlar enzimatik ligasyonla birbirine bağlanır ve amplifikasyon reaksiyonundan sonra rolling circle replikasyonu yoluyla çoğaltılan bir halka oluşturur. İşaretli tamamlayıcı oligonükleotid probların hibridizasyonu, her bir halkalaşmış DNA ürününün amplifikasyonu ile ilişkili floresan ürün lekelerini belirginleştirir. DNA ürünleri kolayca görülebilir.Floresan mikroskobu altında incelendiğinde, noktalar efektör, seds ve smad four arasındaki komplekslere karşılık gelir ve bunlar hücrede aktif BMP sinyalizasyonunu belirtir. PLA'nın mevcut yöntemlere göre temel avantajları; kullanımının kolay olması, yüksek hassasiyete sahip olması, arka plan gürültüsü içermemesi ve in situ aktif BMP sinyalizasyonunu nicelendirmek için kullanılabilmesidir. BMP yolu, birçok organ ve dokunun gelişiminin yanı sıra kök hücre proliferasyonu ve diferansiyasyonu dahil olmak üzere çeşitli süreçler için gereklidir.PLA, BMP sinyalizasyon dinamikleri, seviyeleri ve hücre altı lokalizasyonuna ilişkin temel soruları yanıtlamak için kullanılabileceği gibi, tanı amacıyla da kullanılabilir. Bu yolak çeşitli hastalıkların temelini oluşturduğu için, BLA diğer BMP veya farklı yolakların sinyal iletim bileşenlerini incelemek için kullanılabilir ve doku kesitleri veya bütün embriyolar üzerinde çalışacak şekilde uyarlanabilir. In situ yakınlık ligasyon analizine başlamak için hücre kültürlerini hazırlayın; Neuro 2A hücreleri, %10 FBS, 1x temel olmayan amino asitler, 1x piruvat ve 1x L-glutamin ile desteklenmiş GMEM içerisinde kültüre edilir.Hücreleri tripsin kullanarak ayırın ve kuyu başına 15.000 ila 20.000 hücre ekleyin. 16 kuyucuklu bir chamber slide içerisinde, hücreleri %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. 24 saat sonra.Kontroller için kültür ortamını takviye edilmiş serumsuz GMEM ile değiştirin ve iki ila üç saat daha inkübe edin. İkinci inkübasyondan sonra hücre içeren üç kuyuğu normal kültür ve koşullarda tutun. Hücreleri iki mikromolar dorsa morfin ile işleme tabi tutarak BMP yolunu inhibe edin veya hücreleri 10 ila 60 dakika boyunca BMP dört ile işleme tabi tutarak sinyallemeyi indükleyin.Hücre stimülasyonunun ardından, kuyucuklardaki besiyerini aspire edin ve hücrelerin kopmasını önlemek için hücreleri PBS ile nazikçe yıkayın. PBS'yi doğrudan hücrelerin üzerine pipetlemeyin. Ardından PBS'yi aspire edin ve kuyucukların etrafındaki silikonu bırakarak şamberleri çıkarın.Kuyucuklara taze hazırlanmış ve filtrelenmiş %4 paraformaldehitten 50 µL ekleyin ve oda sıcaklığında, çalkalamadan 10 dakika boyunca inkübe edin. Fiksasyon işleminden sonra hücreleri oda sıcaklığında, bir copin jar içerisinde çalkalayarak beş dakika boyunca PBS ile yıkayın. Yıkama işlemini toplam üç yıkama olacak şekilde iki kez daha tekrarlayın.Ardından, hücreleri bir kopin kavanozunda PBS içindeki %0.5 Triton X 100 ile geçirgen hale getirin ve oda sıcaklığında, ajitasyon uygulamadan 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra hücreleri bir kopin kavanozunda, her yıkama için beş dakika boyunca ajitasyon uygulayarak %0.05 Tween 20 ve TBS ile 3 kez yıkayın. Son yıkama solüsyonunu uzaklaştırmak için lamı hafifçe vurarak bloklama işlemine başlayın.Hücrelerin kurumamasına dikkat ederek, her bir kuyucuğa bloklama çözeltisi içerisine bir damla DUO link ekleyin. Hücreleri, içerisinde distile su bulunan boş bir pipet ucu kutusundan oluşan önceden ısıtılmış nemlendirme odasında, 37 °C'de 30 dakika boyunca bloklama çözeltisinde inkübe edin.Birincil antikor çözeltilerini hazırlamak için, anti phospho smad 1 5 8 ve anti SMAD four'u duo link two antikor seyrelticide 1:100 oranında seyreltin. Her bir antikoru tek başına ve kombinasyon halinde kullanın. Şimdi, bloklama çözeltisini lamdan uzaklaştırmak için lama hafifçe vurun ve uygun kuyucuklara ve negatif kontrole 40 µL antikor çözeltisi ekleyin; negatif kontrol için yalnızca seyreltici kullanılabilir.Hücrelerin kurumaması için bu adımı hızlıca gerçekleştirin. Şimdi lamları, önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir bölmede 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında, iki PLA probunu seyrelticide seyreltin.Her bir reaksiyon karışımı için, probların çözelti içinde bire beşe seyreltilmesi amacıyla her bir probdan sekiz µL ve 24 µL dilüent ekleyin. Bir saatlik inkübasyonun ardından, primer antikor çözeltisini boşaltın ve slaytları, bir bağlantı kabı içerisinde oda sıcaklığında, ajitasyon eşliğinde beşer dakika süreyle Duo link to Wash Buffer a ile iki kez yıkayın. Yıkama işlemleri tamamlandığında, slaytlarda kalan wash buffer A'yı boşaltın ve her birine 40 µL PLA prob çözeltisi ekleyin.Şimdi lamları, önceden ısıtılmış nemli bir inkübasyon kabında 37 °C'de inkübe edin. Bir saat boyunca, DuoLink ligasyon stok çözeltisini kullanın ve ligasyon karışımı için gerekli hacmi hazırlayın. Bunun için önce DuoLink ligasyon stok çözeltisini vorteksleyin ve yüksek saflıktaki su ile 1x konsantrasyona seyreltin.Ligaz enziminin bu çözeltiye 1/40 oranında eklendiğini ve kuyucuk başına 40 µL karışımın gerektiğini göz önünde bulundurun. İnkübasyondan sonra, PLA prob çözeltisini lamlardan boşaltın ve lamları iki kez Yıkama Tamponu ile yıkayın. Son yıkama sırasında, oda sıcaklığında bir karıştırma kabında beş dakika boyunca ajitasyon uygulayın; Duo link Ligazı dondurucu bloktan çıkarın ve ardından ligasyon çözeltisine 1/40 son dilüsyon oranında ekleyip Vortex ile karıştırın.Şimdi lamlar üzerindeki son Yıkama Tamponu A hacmini boşaltın ve 40 µL ligasyon ekleyin. Her birine enzimle birlikte karıştırın. Lamları önceden ısıtılmış bir nemlendirme odasında 30 dakika boyunca inkübe edin.DUO link amplifikasyon stokunu 37 °C'de çözün ve inkübasyon sırasındaki amplifikasyon aşamasına hazırlanmak için DUO Link amplifikasyon stokunu yüksek saflıkta su ile 1X olacak şekilde seyreltin. Reaktifler ışığa duyarlı olduğundan onları ışıktan uzak tutun. Ligasyon aşaması tamamlandığında, solüsyonu boşaltın ve lamları oda sıcaklığında, bir karıştırma kabı içinde ajitasyonla, her biri iki dakika boyunca iki kez Wash Buffer A ile yıkayın; son yıkama sırasında, DUO link polimerazı amplifikasyon solüsyonuna 1:80 nihai seyreltme oranında ekleyin ve vorteksleyin. Yıkama tamponunu boşalttıktan sonra, her kuyucuğa 40 µL amplifikasyon karışımı ekleyin ve lamları önceden ısıtılmış karanlık bir nemlendirme odasında 37 °C'de 100 dakika boyunca inkübe edin.Amplifikasyon inkübasyonu tamamlandığında, polimeraz çözeltisini lamlar üzerinden süzün ve lamları bir bağlama kavanozunda, her yıkama için 10 dakika boyunca iki kez Yıkama tamponu B ile yıkayın; reaktifler ışığa duyarlı olduğundan bu adım boyunca lamları ışıktan uzak tutun. Bu iki yıkamayı, 0,1 kat yoğunluktaki yıkama tamponu B içerisine daldırarak takip edin. Şimdi 16 kuyucuklu lam üzerindeki silikonu tamamen temizleyin ve ardından yaklaşık 40 µL duo ekleyin.Kapak camına bir damla montaj medyumu ekleyin ve örneğin üzerine nazikçe yerleştirin; kapak camının altında hava kabarcığı kalmaması için hafifçe bastırın, oje kullanarak kapak camını lama sabitleyin ve mühürleyin, görüntüleme öncesinde en az 15 dakika bekleyin. Bunlar, BMP yolunun bir inhibitörü olan 2 µM dorsa morphine ile veya 60 dakika boyunca 25 ng/mL BMP four ile işlem görmüş hücrelerin konfokal görüntüleridir.Aktif smad komplekslerini tespit etmek için Phospho Smad 1 58 ve Smad four antikorları kullanılmıştır ve bunlar kırmızı noktalar şeklinde görülmektedir. Hücre çekirdeği dpi ile maviye boyanmıştır. PLA sinyalleri DUO link image tool yazılımı ile sayılmış olup, hücre başına çekirdekteki ortalama nokta sayısı grafikte sunulmuştur.Birincil antikorlardan herhangi birinin tek başına kullanılması durumunda boyanma görülmemesi, PLA problarının arka plan bulgusu olmadığını ve oligonükleotitlerin ardından gelen ligasyonu olmadığını göstermektedir. Benzer şekilde, her iki birincil antikoru da içeren başka bir negatif kontrolde hiçbir nokta tespit edilmemiştir. Neuro 2A hücrelerinde SDS-PAGE immünobloting, işlem görmemiş ve BMP ile işlem görmüş hücrelerde fosforilasyonla ilişkili SMAD 1 5 8'i ortaya çıkarmaktadır.Buna karşın, dorsal morfin ile işlem gören hücrelerde fosfo smad seviyeleri belirgin şekilde azalmıştır. PCNA'ya karşı kullanılan antikor, yükleme kontrolü sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin fikse edilmesinden sonra altı saatten kısa sürede sonuçlar elde etmek için önerdiğimiz kurulumu ve adımları nasıl takip edeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Özetle adımlar; primer antikor inkübasyonunun bloklanması, PLA prob inkübasyonu, ligasyon amplifikasyonu, montaj ve görüntülemedir.

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, nematod hücrelerinde in situ protein-protein etkileşimlerini incelemek için yakınlık ligasyon testini açıklar. İlgilenilen proteinlerin yakınlığı, ikincil bir antikora bağlı bir PLA probu yardımıyla dairesel DNA şablonunu oluşturur. Prob, hücrelerde protein-protein etkileşimlerinin lokalizasyonunu sağlayan uzun tek sarmallı bir DNA ve ardından dedektör probunun hibridizasyonunu üreten amplifikasyon çözeltisi kullanılarak daha da büyütülür.

Yerinde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Bu video, Yakınlık Ligasyon Testi (PLA) kullanılarak Drosophila nöromüsküler kavşakta (NMJ) protein-protein etkileşimlerinin görselleştirilmesini göstermektedir. Vücut duvarlarını izole ettikten sonra, etkileşen proteinler birincil antikorlar ve PLA ile konjuge ikincil antikorlar ile incelenir. Etkileşen proteinlerin yakınlığı, probların konektör oligonükleotidleri ile bağlanmasını kolaylaştırır, dairesel DNA oluşturur ve bu daha sonra yuvarlanan daire amplifikasyonu ile amplifiye edilir.

Drosophila Larvalarında Protein-Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testi Kullanılarak Saptanması

Bu makale, ilgilenilen bir protein ile E. coli'deki diğer faktörler arasındaki etkileşimleri izlemek için bölgeye özgü fotoçapraz bağlama ile birlikte nabız kovalama radyo etiketlemesinin kullanımını göstermektedir. Geleneksel kimyasal çapraz bağlama yöntemlerinden farklı olarak, bu yaklaşım, canlı bir hücredeki düzenli bir montaj yolunun yüksek çözünürlüklü "anlık görüntülerini" oluşturur.

Bölgeye Özgü Çapraz Bağlama Kullanarak Salgılanan Bir Bakteriyel Virülans Faktörünün Montajının İzlenmesi

Bu protokol Proximity ligasyon Testi Drosophila larva nöromüsküler kavşakta yerinde protein-protein etkileşimleri tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Bu teknikle, Diskler, büyük ve Hu-li tai shao postsinaptik bölgede bir kompleks, daha önce birlikte immunoprecipitation ile tespit dernek kurma gösterilmiştir.

Algılama In Situ Protein-protein kompleksleri Drosophila Larva Nöromüsküler Junction

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

İşte, bir yakınlık ligasyonu tahlil (PLA) ile yüksek hassasiyet MST1/MST2 heterodimerization sabit hücrelerdeki görselleştirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Cognate J-etki proteinleri hsp70 şaperon ile protein katlama bozulması arasında değişen biyolojik süreçler sayısız yardımcı olmak için işbirliği. Burada, bakteriyel, maya ve insan hücrelerinde geçici olarak oluşan bu şaperon makinelerinin izlenmesine olanak sağlayan bir in situ yakınlık ligasyon tetkikini tanımlıyoruz.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

Burada, patolojik ve fizyolojik sıvı kesme stres koşullarına maruz kalan endotel hücrelerinde yakınlık ligasyon testini (PLA) kullanarak birden fazla SMAD kompleksini aynı anda görselleştirmek ve analiz etmek için bir protokol oluşturuyoruz.

Yakınlık-Ligasyon-Tahlil Kullanarak Farklı Sıvı Kesme Stres Koşulları Altında TGFβ/BMP/SMAD Sinyalinin Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi

Büyüme Faktörü ß aile öncül proteinlerinin dönüştürülmesi Xenopus laevis embriyolarında ektopik olarak ifade edildiğinde, küçülürler, bölünürler ve erken gastrula aşamasına geç blastülde başlayan blastokoele salgılanırlar. İmmünoblot analizi için blastocoele boşluğundan dekolte ürünlerini aspire etmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Xenopus laevis Embriyolarının Blastocoele'sine Salgılanan Dönüşüm Faktörü ß Aile Bölünmesi Ürünlerinin Analizi

Öğrenin, hücre kültürlerinde BMP4 sinyalini görselleştirmek ve etkin etkileyici kompleksleri nicelendirmek için in situ PLA yöntemini. Bu hassas teknik, kemik morfojenetik protein sinyal yolaklarını in vivo çalışmak için araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

Efektör-Kompleksleri kullanarak BMP4 Mansabında Sinyal Algılama In situ PLA, Proximity ligasyon Testi

Daha fazla video keşfet