Kompozit Bitkiler Üretimi Medicago truncatula Nodül Tahliller için kullanılan

Merhaba, ben Dan Bitki Bilimi Merkezi'nden Oliver Yu. Bugün size Agrobacterium Ogn aracılığıyla nasıl Ute Compote Bitkileri üretileceğini göstereceğiz. Bu teknik, şu anda Ohio State Üniversitesi'nde görev yapan Dr. Chris Taylor tarafından Dan Merkezi'ne getirilmiştir.

Eski grup üyelerimden birkaçı yıllar içinde bu teknikleri geliştirmişlerdir ve bugün mevcut grup üyelerim Dr. Stone ve Mao, Harry Root Kompozit Planlarının nasıl üretildiğini göstermek için bu videoyu hazırladılar. Agrobacterium ZOS, bitkilere yabancı DNA aktarmaları bakımından agrobacterium tumor fis ile oldukça benzerdir, ancak ZOS, bu örnekteki gibi kompozit bitkiler oluşturarak yabani tip dokularda daha yüksek kök oluşumunu indükleyebilir. Dolayısıyla, bu kompozit bitkilerde köklerin bazıları transgenikken, sürgünler hala yabani tiptir.

Bu nedenle, bu teknoloji transgenik tohumlar üretmeyecektir. Ancak, yüksek kök kampili bitkilerin bu teknolojiyi oldukça kullanışlı kılan üç temel avantajı vardır. Birincisi, birçok bitki türü, özellikle dikotil türler, agrobakteriyel yöntemlerle transforme edilebilir.

İkinci olarak, transformasyon öncesinde doku kültürü oluşturmamıza gerek yoktur. Doğrudan transgenic bitkiler üretmek için fideler, sürgünler ve kökler gibi bitkinin birçok kısmını kullanabiliriz. Ve son olarak, birkaç hafta içinde transgenik kök dokusu elde edebiliriz.

Soya fasulyesi ve medic cargo trans için, OPIS transformasyonundan üç hafta kadar daha kısa sürede transgenik kökler elde edebiliriz. Genel olarak, daha yüksek kök sit plant teknolojisi, gen fonksiyonlarını ve kökle ilgili fenotipleri incelemek için oldukça yararlı bir araçtır. Merhaba, benim adım Ong.

Merhaba, benim adım, yanımda kameramanım Bill var. Bugün Harry root Kompozit Bitki protokolünü tanıtacağız. Evet, bu protokolü birçok projemizde kullanıyoruz.

Zaten başladık, evet. Demonstrasyonumuz için örnek olarak meta cargo Tula'yı kullanacağız. Bunlar meta cargo olgun kapsülleridir.

Kapsülleri bir öğütme kutusuna yerleştirin ve ardından uzun, sıkı hareketlerle kapsülleri öğütün. Tohumları, kapsülleri nazikçe sallayarak ayırın ve tohumları 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Ardından beş mL derişik sülfürik asit ekleyin.

Çok dikkatli bir şekilde skarizasyon yapın. Yaklaşık 10 dakika sürer. Tüpü iki ila üç kez asit vorteksinden geçirin.

Asit işlemi sırasında tohum kabuğu sarı renge dönecektir. Sülfürik asidi tüpten uzaklaştırın ve tohumları steril su ile en az beş kez durulayın. Tohumları oda sıcaklığında deiyonize su içerisinde altı saat boyunca bekletin ve ardından iki gün boyunca 4 °C'de muhafaza edin.

Çimlenmeyi senkronize etmek için, 20 ila 30 tohumu Petri kabındaki nemli filtre kağıdına yayın. Beş ila altı gün sonra, tohum bağlantılarını toprağa aktarın ve ardından sera koşullarında dört hafta boyunca büyütün.

Kompozit bitki transformasyonu için normalde agrobacterium Zony K 5 99 suşunu kullanırız. Mekik vektör veya ikili vektör, standart agrobacterium tumor facit transformasyon protokolü izlenerek K 5 99'a transforme edilebilir. Agrobacterium'u inoküle edin ve büyüme süresince 30 °C'de 16 ila 24 saat boyunca büyütün. Kültür solüsyonunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktararak hücreleri toplayın.

Örneği santrifüj cihazında 5, 000 G'de 30 dakika boyunca döndürün. Peleti azot içermeyen besin solüsyonu ile yeniden süspanse edin. Agrobacterium hücrelerini OD 600'de 0.3 olacak şekilde dilüe ettiğinizden emin olun.

Maksimum transformasyon için bu konsantrasyon önemlidir. Destek matrisi olarak kaya duvarı kullanıyoruz. Yüksek frekanslı transformasyon için bu materyalin kullanılması önemlidir.

Kaya duvarı uygun boyutta kesin. Tıkaç haline getirin. Üst kısma yaklaşık bir buçuk ila iki santimetre çapında bir delik açın. Bir pipet ucu kullanarak, her tıkaç içine beş mililitre Resuspended Agrobacterium Zony çözeltisi ekleyin.

İki ila üç yardımcı tomurcuk içeren bir gövde kesiti seçin ve verev bir kesim yapın. Bitki kesitlerini kaya duvarındaki deliğe yerleştirin. Kesilen bitkileri üç hafta boyunca bir büyüme odasına veya laboratuvar tezgahına yerleştirin.

Her 10 günde bir her bir tıpaya beş mililitre besin solüsyonu ekleyin. Üç hafta sonra, kökler kesik taraftan yeniden oluşur. Bitkiyi suya daldırın.

Yumuşamış kaya duvarını dikkatlice kaldırın ve köklere zarar vermeyin. Kaya duvarının tamamının kaldırıldığından emin olun. Tüylü kök kompozit bitkilerini kuma veya perlite aktarabilirsiniz. Sembiyoz deneyleri için rhizobiumu, maya özütü manito besiyerinde yedi gün boyunca 30 °C'de büyütün.

Zoia hücrelerini toplayın ve resüspansiyon yapın. Peleti azot içermeyen besiyeri çözeltisi ile süspande edin. Çözeltiyi OD 600'de 0,08 olacak şekilde seyreltin.

Her bir kompozit bitki kültürüne 10 mililitre ZOA çözeltisi ekleyin ve nodüllerin oluşması için bitkiyi iki ila üç hafta daha bekletin. Kompozit bitkileri sökerek ve yıkayarak kumdan arındırın. Transgenik kökü kontrol etmek için yeşil floresan protein ekspresyonunu kullanın.

Bunu yapmak için floresan mikroskobu kullanacaksınız. Tüm tüylü kök konstrüktlarımız, transjenik hatların taranması için konstitütif bir GFP kasetine sahiptir. Bu resim, floresan mikroskobunda gözlemlenen GFP transjenik tüylü kök kompozit bitkilerini göstermektedir.

Daha parlak yeşil floresansa sahip transgenik kökleri, transgenik olmayan köklerden ayırt etmek kolaydır. Kompozit bitkilerin tüylü köklerinde nodüller oluşur. Protokolün tamamı aşağıdadır.

Tekrar belirtmek gerekirse, tüylü kök kompozit bitkileri oluşturmak, özellikle diploid türler için büyük miktarlarda transgenik doku elde etmenin hızlı ve kolay bir yöntemidir. Bu yöntem transgenik tohum sağlamasa da, birkaç hafta içinde transgenik materyal üretebilir. Özellikle doku kültürü oluşturma ve transformasyon konusunda zorluk yaşayan bitkiler için uygundur.

Yıllar boyunca bu teknolojiyi gen fonksiyonlarını, promotör fonksiyonlarını, mikroRNA'ları, kök ve yan kök gelişimlerini, savunma ve antibiyotik stres yanıtını, nodülasyonu ve diğer simbiyotik süreçleri incelemek için kullandık. Yüksek kök kompozit bitkilerini kullanarak hormon yanıtını, metabolik profillemeyi, gen profillemeyi ve proteomik analizi çalıştık. Bu videonun, bu sistemi tercih ettiğiniz türlere uyarlamanıza yardımcı olacağını umuyoruz.

Bu teknolojiyle ilgili sorularınız için bizimle iletişime geçebilirsiniz. Başarılar dileriz.