Name: Kompozit Bitkiler Üretimi Medicago truncatula Nodül Tahliller için kullanılan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Öğrenin, Medicago truncatula kök nodülasyonunu incelemek için Agrobacterium ile saçlı kök kompozit bitki üretimini. Bu yöntem, geleneksel doku kültürüne gerek kalmadan hızlı transgenik kök elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bizim laboratuar ve Dr kıllı kök teknolojisini tanıtmak için Dr. Chris Taylor (Ohio State Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Senthil Subramanian (South Dakota State Üniversitesi), protokol geliştirmek için Juan Zhang (Çin Shandong Ludong Üniversitesi). Biz aynı zamanda bu video yapımında yardımcı olan Dr Hao Cheng (Nanjing Tarım Üniversitesi) teşekkür ederim. Bu çalışma OY DOE (DE-SC0001295), NSF (MCB-0.923.779) ve USDA (2010-65116-20514) hibe kısmen desteklenen

Aşağıdaki protokol, bir model baklagil türleri M. kıllı kompozit bitkilerin kök oluşturmak için kullanılan truncatula. Benzer protokolleri en az sekiz 1-4 bitki türleri için adapte edilmiştir. M. kullanılan truncatula kıllı kök kompozit bitkilerin kök ve nodül gelişimi gen fonksiyonları çalışma. 2) kıllı kök kompozit üretim tesisleri; 3) simbiyotik Rhizobia enfeksiyonu ve 4) transgenik kök kimlik bitki materyali hazırlama) 1: protokol dört bölüme ayrılmıştır. Biz transgenik kompozit bitkilerin kök 3 tarama için bir muhabir olarak, yeşil flüoresan protein (GFP) geni içeren ikili bir vektör kullandı. Antibiyotik-temelli seçimi ile karşılaştırıldığında, GFP tabanlı tarama, hızlı, kolay ve ucuzdur. Bizim inşa ER-ifade-optimize GFP geninin transgenik ve transgenik olmayan kökleri arasında kolay ayrım sağlayan, transgenik kökleri güçlü kurucu GFP sinyalleri süper ubikuitin organizatörü tarafından tahrik edilir. 1. Bitki Materyali Hazırlama <ol><li> M. truncautla tohumları serada yetiştirilen bitkiler (% 50 bağıl nem, 16 / 8 saat ışık / karanlık, 22/18 ° C gün / gece sıcaklık) hasat edilir. Olgun tohumları 4 ° C'de saklanabilir </li><li> Yaklaşık 100 tohumları periyodik sallayarak 10 dakika için 10 ml konsantre sülfürik asit (% 95-98, Sigma-Aldrich, MO) Kırma. </li><li> Tohumlar 5-7 kez yavaşça sallanarak steril su ile durulanır. </li><li> Bu tohumlar daha sonra 6 saat boyunca oda sıcaklığında suya batırılmış ve 4 ° C 36-48 saat çimlenme senkronize etmek için tutulur. </li><li> Yaklaşık 20-30 tohum, bir Petri kabındaki yerleştirilen nemli filtre kağıtları üzerinde yayılır. 22 korunur ° C, 16 / 8 saat aydınlık / karanlık döngüsünü ve 40 ile μmol.m -2 s -1 ışık yoğunluğu, 5-6 gün boyunca. </li><li> Çimlenmiş fideler toprağa aktarılır ve bir ay boyunca sera yerleştirilir. </li></ol> 2. Tüylü Kök Kompozit Tesisleri oluşturuluyor <ol><li> İkili yapıları ilgi genleri taşıyan A. dönüştü standart protokolleri kullanarak rhizogenes. Biz transgenik dokuların tarama kolaylaştıracak bir belirteç olarak GFP genini içeren bir dizi ikili vektörler tasarladık. Bu bağlamda, çeşitli rehberleri içeren ve tüm Gateway aşırı ifadesi veya hedef genlerin 3,5, susturma klonlama siteleri (Invitrogen, Carlsbad, CA). </li><li> A. rhizogenes uygun antibiyotik seçimi ile 28 50ml LB orta ° C de 16-24 saat kültür. </li><li> Bakteriler azot bitki besin solüsyonu (Tablo 1 ve 6) = 0.3 toplanan ve OD 600, nihai konsantrasyonu yeniden askıya alınır. </li><li> Kıllı kök rejenerasyon, steril bir matriks (Taşyünü ", Hummert Uluslararası, Earth City, MO) desteklemek için yaklaşık 3 cm 3 fişler halinde kesilir. Biz 4 fişler bir Petri kabı içine yerleştirin. </li><li> Eksplantlar ekleme kolaylaştırmak için bir pipet kullanarak her fiş üstüne bir delik dürttü. A. rhizogenes (5 ml) her fiş eklenir. </li><li> 2-3 aksiller tomurcukları ile bir çekim bölümünde çekik bir kesim tarafından eksize edilir. Eksplant sonra fişi içine eklenir ve 22 ° C'de yaklaşık üç hafta boyunca yetiştirilen. Biz 5 ml azot içermeyen bir çözüm gerektiğinde su onları, daha sonra, ilk 10 gün boyunca sulama olmadan Medicago eksplantlar tutmak . Biz apikal meristem çıkarmadan adventif köklerin oluşumunu düşürebilir bulundu. </li></ol> 3. Simbiyotik Rhizobia (Sinorhizobium meliloti) Enfeksiyon <ol><li> Üç hafta sonra, bazı adventif kökler Taşyünü ortaya çıkacaktır. Kıllı kök kompozit bitkiler Taşyünü ile veya olmadan, kum veya vermikülit (steril) aktarılır. Bu serada yetiştirilen 22 ° C, 16 / 8 saat aydınlık / karanlık döngüsü, ve 300 μmol.m -2 -1 ışık yoğunluğu bir hafta daha. </li><li> Rhizobia enfeksiyonu, S. önce meliloti 1201, 50 ml maya özü-mannitol 30 ° C (Tablo 2 ve 6,7) 7 gün boyunca orta kültüre . </li><li> Yeniden askıya rhizobia hücreleri OD 600 nihai konsantrasyonu = 0.08 kullanarak azot ücretsiz beslenme çözüm seyreltilir. S. 10 ml taze süspansiyon meliloti nodül oluşumu ikna etmek için her kompozit tesisi yapıldı. </li></ol> 4. Transgenik Kök Tanımlama <ol><li> Rhizobia aşılama İki hafta sonra, bileşik bitkiler su ile yıkama kadar köklü. Kökleri, suda kolayca kum veya perlit ayrılabilir. </li><li> Biz bir UV-mikroskop altında (Nikon SMZ1500 Uyartım 460-500nm, Dikroik 505nm, 510nm daha Bariyer) kıllı kökleri yer. Transgenik kökleri GFP pozitif ve adventif kökler GFP negatif. Daha sonra kökleri accordin toplamakg GFP sinyal ve nodül numaraları sayısı, kök uzunluğu ölçmek ve yan kök yoğunluğunu hesaplamak. GFP negatif kökleri kontrol olarak kullanılır. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonucu Yaptığımız denemelerde, yeni saç köklerinin A. eksplantlar sonra 2-3 hafta içinde yeniden rhizogenes aşılar. UV-mikroskop altında, GFP geni taşıyan transgenik kökleri güçlü yeşil floresan (Şekil 1). Rejenere kökleri ve GFP pozitif kökleri kısmını miktarı eksplantlar ve bileşik plants.On ortalama büyüme ortamı şartlarına bağlıdır, üretilen köklerinin% 25, transgenik kıllı kökleri 3. Dönüşüm verimliliği, 1) artırmak için videoda gösterildiği gibi plastik kapak azap, ilk birkaç gün boyunca büyüme tepsiye nemi korumak için yeterli olup, bitkilerin sadece ilk birkaç gün içinde çok az suya ihtiyaç duyarlar. Aşırı sulama kıllı kök oluşumu için zararlıdır; 2) Agrobacterium innoculant konsantrasyonu dönüşüm için önemlidir. Aşırı miktarda hücre kıllı kök oluşumu veya nodül oluşumu için yararlı değildir. Nodül oluşumu için, sulama çözüm azot serbest olması gerekir, aksi takdirde birkaç nodüller oluşturacak. Kıllı kök kompozit bitkilerin başlangıç ​​materyali olarak kotiledonlarında veya entact fide kullanarak oluşturulabilir. Yukarıdaki protokol sadece küçük değişiklikler diğer dokular 8 kıllı kökleri oluşturmak için ncessary. Önemli olan, her kıllı kök bağımsız bir dönüşüm olayı. Bu nedenle, tek bir kompozit bitki gözlenen fenotipleri birden fazla kompozit tesislerinde tekrarlar tarafından teyit edilmesi için gereken birkaç transforamtion olayların toplamıdır <img src="/files/ftp_upload/2633/2633fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. A. Transgenik kökleri kıllı kökleri dışarı sıralanabilir. B. Nodüller kıllı kök kompozit tesislerinde kuruldu. 4 haftalık M. yerleştirilir UV-mikroskop ve GFP pozitif kökleri altında truncatula kıllı kök bitkiler kolayca tespit edilebilir. (Kırmızı ok: GFP kök; Sarı ok: non-GFP kök) <table border="1"><tbody><tr><td> Hisse senedi </td><td> g/200ml </td><td> ml stok / litre </td></tr><tr><td> MgSO 4 .7 H 2 O </td><td> 12,3 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> 14,7 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 .3 H 2 O </td><td> 6,8 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> K 2 SO 4 </td><td> 11 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Fe Cl 3 .6 H 2 O </td><td> 0,49 </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Mikrobesinler </td><td> Aşağıya bakın </td><td> 1 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Mikrobesinler </td><td> g litre başına </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> 0,142 </td></tr><tr><td> MnSO 4 H 2 O </td><td> 0,077 </td></tr><tr><td> ZnSO 4 .7 H 2 O </td><td> 0,1725 </td></tr><tr><td> CuSO 4 .5 H 2 O </td><td> 0,037 </td></tr><tr><td> NaMoO 4. H 2 O </td><td> 0,024 </td></tr><tr><td> CoCl 2. H 2 O </td><td> 0,0025 </td></tr><tr><td> Niso 4 </td><td> 0,001 </td></tr></tbody></table> (Tablo 1). Nitogen içermeyen bir beslenme çözümü <table border="1"><tbody><tr><td> K 2 HPO4 </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 0.1g </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> 0.2g </td></tr><tr><td> Maya Ekstraktı </td><td> 0.4g </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> 10g </td></tr><tr><td> pH = 6.8 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2. maya (litre) mannitol orta ayıklamak

<ol><li>Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).</li>
<li>Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vitro+composite+plants%3A+an+inexpensive%2C+rapid+method+for+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology.</a> Plant J. 43, 449-457 (2005).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavones+and+flavonols+play+distinct+critical+roles+during+nodulation+of+Medicago+truncatula+by+Sinorhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti.</a> Plant J. 57, 171-183 (2009).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavone+synthases+from+Medicago+truncatula+are+flavanone-2-hydroxylases+and+are+important+for+nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation.</a> Plant Physiol. 144, 741-751 Forthcoming.</li>
<li>Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoters+of+two+isoflavone+synthase+genes+respond+differentially+to+nodulation+and+defense+signals+in+transgenic+soybean+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots.</a> Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).</li>
<li>Vincent, J. A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , Blackwell Science Ltd. Oxford. 1-13 (1970).</li>
<li>Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+of+Soybean+Isoflavone+Synthase+Genes+Leads+to+Silencing+in+Tissues+Distal+to+the+Transformation+Site+and+to+Enhanced+Susceptibility+to+Phytophthora+sojae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).</li>
</ol>

Kıllı kök kompozit bitki oluşturma birçok dikotil tür için transgenik malzeme büyük miktarlarda elde etmek için hızlı ve kolay bir yöntem. Bu yöntem, transgenik tohum üretemez rağmen, birkaç hafta içinde transgenik malzemeleri üretmek. Yöntemi zorluk doku kültürleri kurmak ya da istikrarlı transformants üreten tesisler için uygundur. Yıllar geçtikçe, genlerin fonksiyonlarının, organizatörü fonksiyonları, microRNA, kök ve yan kök gelişimi, savunma ve abiyotik stres tepkileri, nodül ve diğer simbiyotik süreçleri, hormon yanıtları, metabolik profil, gen profilleme, proteomik analiz ve incelemek için bu teknolojiyi kullandık diğer biyolojik süreçler. Protokol sağlam ve tekrarlanabilir.

kompozit bitkiler Üretimi medicago truncatula nodül tahliller için kullanılan

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Agrobacterium tumerfaciens benzer şekilde, Agrobacterium rhizogenes plazmid (Ri) kök neden özerk dayanan bitki hücre içine yabancı DNA&#39;lar aktarabilirsiniz. A. rhizogenes bitki dokularında tüylü kök oluşumuna neden ve kompozit bitkiler dönüşüm sonrası oluşabilir. Bu bileşik tesisler üzerinde, rejenere köklerinin bazıları, vahşi tip T-DNA ve mühendislik ikili vektör taşıyan transgenik; sürgünler, enerji ve büyümesine destek sağlamak için hizmet veren, hâlâ, transgenik olmayan. Bu kıllı kök kompozit bitkilerin transgenik tohum üretmek değil, ama, çok faydalı olan bu kompozit bitkiler bitki araştırma yapmak önemli özelliklerinden bir dizi vardır. İlk olarak, geniş bir host yelpazesi ile, A. rhizogenes türlerde genetik mühendislik sağlayan, özellikle birçok bitki türleri, ikiçeneklilerin dönüştürebilirsiniz. İkincisi, A. rhizogenes doğrudan enfekte doku ve eksplantlar; inatçı bitki türleri dönüştürmek için ideal hale dönüşümü için önce herhangi bir doku kültürleri, kompozit bitkiler elde etmek için gerekli . Ayrıca, transgenik kök dokular, birkaç hafta içinde oluşturulabilir. Medicago truncatula için, biz, normal çiçek daldırma Arabidopsis dönüşümü daha hızlı, üç hafta gibi kısa transgenik kökleri elde edebilirsiniz. Genel olarak, kıllı kök kompozit santrali teknolojisi, gen fonksiyonlarını incelemek ve ilgili-fenotipleri kök çok yönlü ve faydalı bir araçtır. Burada kıllı kök kompozit bitkiler bitki Rhizobium etkileşimleri ve nodül dönüşümü zor olan türlerin M. çalışma nasıl kullanılabileceğini göstermek truncatula.

Kıllı kök kompozit bitkiler, bitki-Rhizobium etkileşimleri ve nodül-dönüşümü zor olan türlerin çalışma nasıl kullanılabileceğini Biz göstermek<em&gt; Medicago truncatula</em&gt;.

Kompozit Bitkiler Üretimi Medicago truncatula Nodül Tahliller için kullanılan

Agrobacterium tumefaciens'a benzer şekilde, Agrobacterium rhizogenes, otonom kök indükleyici (Ri) ... temelinde yabancı DNA'ları bitki hücrelerine aktarabilir.

Merhaba, ben Dan Bitki Bilimi Merkezi'nden Oliver Yu. Bugün size Agrobacterium Ogn aracılığıyla nasıl Ute Compote Bitkileri üretileceğini göstereceğiz. Bu teknik, şu anda Ohio State Üniversitesi'nde görev yapan Dr. Chris Taylor tarafından Dan Merkezi'ne getirilmiştir.Eski grup üyelerimden birkaçı yıllar içinde bu teknikleri geliştirmişlerdir ve bugün mevcut grup üyelerim Dr. Stone ve Mao, Harry Root Kompozit Planlarının nasıl üretildiğini göstermek için bu videoyu hazırladılar. Agrobacterium ZOS, bitkilere yabancı DNA aktarmaları bakımından agrobacterium tumor fis ile oldukça benzerdir, ancak ZOS, bu örnekteki gibi kompozit bitkiler oluşturarak yabani tip dokularda daha yüksek kök oluşumunu indükleyebilir. Dolayısıyla, bu kompozit bitkilerde köklerin bazıları transgenikken, sürgünler hala yabani tiptir.Bu nedenle, bu teknoloji transgenik tohumlar üretmeyecektir. Ancak, yüksek kök kampili bitkilerin bu teknolojiyi oldukça kullanışlı kılan üç temel avantajı vardır. Birincisi, birçok bitki türü, özellikle dikotil türler, agrobakteriyel yöntemlerle transforme edilebilir.İkinci olarak, transformasyon öncesinde doku kültürü oluşturmamıza gerek yoktur. Doğrudan transgenic bitkiler üretmek için fideler, sürgünler ve kökler gibi bitkinin birçok kısmını kullanabiliriz. Ve son olarak, birkaç hafta içinde transgenik kök dokusu elde edebiliriz.Soya fasulyesi ve medic cargo trans için, OPIS transformasyonundan üç hafta kadar daha kısa sürede transgenik kökler elde edebiliriz. Genel olarak, daha yüksek kök sit plant teknolojisi, gen fonksiyonlarını ve kökle ilgili fenotipleri incelemek için oldukça yararlı bir araçtır. Merhaba, benim adım Ong.Merhaba, benim adım, yanımda kameramanım Bill var. Bugün Harry root Kompozit Bitki protokolünü tanıtacağız. Evet, bu protokolü birçok projemizde kullanıyoruz.Zaten başladık, evet. Demonstrasyonumuz için örnek olarak meta cargo Tula'yı kullanacağız. Bunlar meta cargo olgun kapsülleridir.Kapsülleri bir öğütme kutusuna yerleştirin ve ardından uzun, sıkı hareketlerle kapsülleri öğütün. Tohumları, kapsülleri nazikçe sallayarak ayırın ve tohumları 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Ardından beş mL derişik sülfürik asit ekleyin.Çok dikkatli bir şekilde skarizasyon yapın. Yaklaşık 10 dakika sürer. Tüpü iki ila üç kez asit vorteksinden geçirin.Asit işlemi sırasında tohum kabuğu sarı renge dönecektir. Sülfürik asidi tüpten uzaklaştırın ve tohumları steril su ile en az beş kez durulayın. Tohumları oda sıcaklığında deiyonize su içerisinde altı saat boyunca bekletin ve ardından iki gün boyunca 4 °C'de muhafaza edin.Çimlenmeyi senkronize etmek için, 20 ila 30 tohumu Petri kabındaki nemli filtre kağıdına yayın. Beş ila altı gün sonra, tohum bağlantılarını toprağa aktarın ve ardından sera koşullarında dört hafta boyunca büyütün.Kompozit bitki transformasyonu için normalde agrobacterium Zony K 5 99 suşunu kullanırız. Mekik vektör veya ikili vektör, standart agrobacterium tumor facit transformasyon protokolü izlenerek K 5 99'a transforme edilebilir. Agrobacterium'u inoküle edin ve büyüme süresince 30 °C'de 16 ila 24 saat boyunca büyütün. Kültür solüsyonunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktararak hücreleri toplayın.Örneği santrifüj cihazında 5, 000 G'de 30 dakika boyunca döndürün. Peleti azot içermeyen besin solüsyonu ile yeniden süspanse edin. Agrobacterium hücrelerini OD 600'de 0.3 olacak şekilde dilüe ettiğinizden emin olun.Maksimum transformasyon için bu konsantrasyon önemlidir. Destek matrisi olarak kaya duvarı kullanıyoruz. Yüksek frekanslı transformasyon için bu materyalin kullanılması önemlidir.Kaya duvarı uygun boyutta kesin. Tıkaç haline getirin. Üst kısma yaklaşık bir buçuk ila iki santimetre çapında bir delik açın. Bir pipet ucu kullanarak, her tıkaç içine beş mililitre Resuspended Agrobacterium Zony çözeltisi ekleyin.İki ila üç yardımcı tomurcuk içeren bir gövde kesiti seçin ve verev bir kesim yapın. Bitki kesitlerini kaya duvarındaki deliğe yerleştirin. Kesilen bitkileri üç hafta boyunca bir büyüme odasına veya laboratuvar tezgahına yerleştirin.Her 10 günde bir her bir tıpaya beş mililitre besin solüsyonu ekleyin. Üç hafta sonra, kökler kesik taraftan yeniden oluşur. Bitkiyi suya daldırın.Yumuşamış kaya duvarını dikkatlice kaldırın ve köklere zarar vermeyin. Kaya duvarının tamamının kaldırıldığından emin olun. Tüylü kök kompozit bitkilerini kuma veya perlite aktarabilirsiniz. Sembiyoz deneyleri için rhizobiumu, maya özütü manito besiyerinde yedi gün boyunca 30 °C'de büyütün.Zoia hücrelerini toplayın ve resüspansiyon yapın. Peleti azot içermeyen besiyeri çözeltisi ile süspande edin. Çözeltiyi OD 600'de 0,08 olacak şekilde seyreltin.Her bir kompozit bitki kültürüne 10 mililitre ZOA çözeltisi ekleyin ve nodüllerin oluşması için bitkiyi iki ila üç hafta daha bekletin. Kompozit bitkileri sökerek ve yıkayarak kumdan arındırın. Transgenik kökü kontrol etmek için yeşil floresan protein ekspresyonunu kullanın.Bunu yapmak için floresan mikroskobu kullanacaksınız. Tüm tüylü kök konstrüktlarımız, transjenik hatların taranması için konstitütif bir GFP kasetine sahiptir. Bu resim, floresan mikroskobunda gözlemlenen GFP transjenik tüylü kök kompozit bitkilerini göstermektedir.Daha parlak yeşil floresansa sahip transgenik kökleri, transgenik olmayan köklerden ayırt etmek kolaydır. Kompozit bitkilerin tüylü köklerinde nodüller oluşur. Protokolün tamamı aşağıdadır.Tekrar belirtmek gerekirse, tüylü kök kompozit bitkileri oluşturmak, özellikle diploid türler için büyük miktarlarda transgenik doku elde etmenin hızlı ve kolay bir yöntemidir. Bu yöntem transgenik tohum sağlamasa da, birkaç hafta içinde transgenik materyal üretebilir. Özellikle doku kültürü oluşturma ve transformasyon konusunda zorluk yaşayan bitkiler için uygundur.Yıllar boyunca bu teknolojiyi gen fonksiyonlarını, promotör fonksiyonlarını, mikroRNA'ları, kök ve yan kök gelişimlerini, savunma ve antibiyotik stres yanıtını, nodülasyonu ve diğer simbiyotik süreçleri incelemek için kullandık. Yüksek kök kompozit bitkilerini kullanarak hormon yanıtını, metabolik profillemeyi, gen profillemeyi ve proteomik analizi çalıştık. Bu videonun, bu sistemi tercih ettiğiniz türlere uyarlamanıza yardımcı olacağını umuyoruz.Bu teknolojiyle ilgili sorularınız için bizimle iletişime geçebilirsiniz. Başarılar dileriz.

generation-composite-plants-medicago-truncatula-used-for-nodulation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

PTI Nicotiana benthamiana bitkiler için bir hücre ölümü tabanlı test açıklanmıştır.

Patojen İlişkili Moleküler Desen (PAMP) Triggered Tesisleri Bağışıklık (PTI) için Testi

Kök-ur nematodları ile ekran bitkiler için iki farklı yöntem tarif edilmiştir. Açıklanan yaklaşımlar ıslah programlarında bu bitkilerin kullanımı kolaylaştıran bir zarar vermeden nematodlar ile yüksek verimlilik ekranlar yer alıyor.

Kök-ur Nematod ile Yüksek ve Düşük Throughput Ekranlar Meloidogyne spp.</em

Standart laboratuvar plakalardan yapılmış bireysel, steril mikrokosmlarından yılında azot bağlayıcı bakteriler Sinorhizobium meliloti ile simbiyoz Medicago truncatula bitkilerin büyüme ödün vermeden, sterilite kök sistemleri ve nodüller sık muayene izin verir. Bitkiler kadar 9 hafta boyunca bu büyüme odalarına korunabilir.

Nodülasyona ve Baklagil Bitki Büyüme için tek-bitki, Steril Mikrokozmoslar<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Rhizobial Symbiont ile<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Amaç, baklagil Medicago truncatula modelinin, baklagil olmayan Arabidopsis modelini tamamlamak için erken bitki embriyogenezinin düzenlenmesini araştırmak için kolayca kullanılabileceğini göstermektir. Pod morfolojisi, zigotik embriyogenez aşamaları ile bağlantılıdır ve doku kültürü kullanılarak embriyoların toplanması için bir protokol de sağlanır.

Model Baklagil Erken Embriyo Geliştirme Yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar Elde protokolleri<em&gt; Medicago truncatula</em

Organizatörü ifade analizleri gen düzenlemesi anlayış ve hedef genlerin kronolojik zamanmekansal ifade geliştirmek için büyük önem taşımaktadır. Burada biz tanımlamak, ayırma ve bir bitki organizatörü klon için bir protokol mevcut. Ayrıca, ortak fasulye kıllı kökleri nodül özgü organizatörü karakterizasyonu açıklar.

Bitki organizatörü analizleri: Kimlik ve kök nodül belirli organizatörü ortak fasulye içinde karakterizasyonu

Bu iletişim kuralı kopya numarası değişimler tüm genom dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) analizi yürütmektedir ilgilenen araştırmacılar için deneysel adımlar ve reaktifler, ekipman ve çözümleme araçları hakkında bilgi sağlar bitkiler.

Dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon için bir Platform verimli algılama varyasyonları kopya numarası hızlı nötron kaynaklı Medicago truncatula mutantlar içinde

Geçici Contegra ifade Nicotiana benthamiana yaprakları biyosentetik enzimlerin 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Burada olduğunu hızlı (5 gün) hazırlık-ölçekli üretim triterpeneler ve bu güçlü bitki tabanlı platformu kullanan analogları için detaylı bir protokol açıklanan.

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

Bu yazıda bağışıklık elicitors maruz aşağıdaki Arabidopsis thaliana savunma tepkiler miktarının için iki yöntem açıklanmaktadır: geçici oksidatif patlama ve fide büyüme inhibisyonu.

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Parasponia andersonii, Kenevir ailesine (Cannabaceae) ait olan ve rizobium ile birlikte azot sabitleme kökü nodülleri oluşturabilen hızlı büyüyen tropikal bir ağaçtır. Burada, Agrobacterium tumefaciens-aracılı kararlı dönüşüm ve CRISPR/Cas9 tabanlı genom düzenlemesine dayalı P. andersonii'de ters genetik analizler için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Dönüşüm, Genom Düzenleme ve Fenotipleme Azot sabitleme Tropikal Cannabaceae Ağaç Parasponia andersonii

Burada, kompozit bitkiler üretmek için Agrobacterium tumefaciens'in aracılık ettiği tek adımlı bir dönüşüm yönteminin ayrıntılı protokolünü sunuyoruz.

Agrobacterium rhizogenes Bazlı Tüylü Kök Dönüşümü ile Kompozit Bitkilerin Üretilmesi İçin Verimli ve Tekrarlanabilir Bir Yöntem

Öğrenin, Medicago truncatula kök nodülasyonunu incelemek için Agrobacterium ile saçlı kök kompozit bitki üretimini. Bu yöntem, geleneksel doku kültürüne gerek kalmadan hızlı transgenik kök elde edilmesini sağlar.

Kompozit Bitkiler Üretimi Medicago truncatula Nodül Tahliller için kullanılan

Daha fazla video keşfet