Tek Hücre Transcriptome Analizi

Bu prosedürün genel amacı, transkriptom analizi için tek hücrelerden örnekler hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle izolasyon için uygun bir hücre bulunarak gerçekleştirilir. Ardından mikro pipet, izole edilecek hücrenin yanına konumlandırılır.

Ardından, hücre mikro pipet ucuna çekilene kadar şırıngaya vakum uygulanır. Prosedürün son adımı, mikro pipet ucunun toplama tüpü içinde kırılarak mikro pipette kalan içeriğin tüpe boşaltılmasıdır. Nihayetinde, protokolde açıklanan mRNA amplifikasyon yöntemi kullanılarak amplifiye edilen materyalin mikroarray analiziyle veya PCR ya da yeni nesil dizileme gibi diğer uygulamalarla, hücreler arasındaki mRNA popülasyonlarındaki farklılıkları gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, tekil hücreler arasındaki farklar ve bunlar hakkında içgörü sağlayabilse de, dendritler veya dendrit sınıfları gibi hücre altı bölmelere de uygulanabilir ve dendrit fonksiyonuna dair önemli bilgiler sunabilir. Prosedürü, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Jennifer Singh uygulamalı olarak gösterecek. Bu protokolün başlangıcından önce, embriyonik 18. gün sıçan hipokampuslarından alınan primer nöronlar, 35 milimetrelik bir kap içindeki 12 milimetrelik lameller üzerine ekilmiş ve yazılı protokolde açıklandığı şekilde muhafaza edilmiştir. Hasat için pipetleri hazırlamak amacıyla, otoklavlanmış cam pipetleri elektrofizyolojiye uygun bir çapta çekmek için bir mikro pipet çekici kullanın.

Üreticinin önceden ayarlanmış programı kullanıldığında, uç hücre toplama işleminden önce kırılacağı için delik boyutu kritik değildir. Pipetleri, hücre hasadı için hazır olduklarında uçların sağlam kalacağı mikropipet saklama kavanozu gibi tozsuz bir ortamda dikkatlice saklayın. Hasat edilen materyalin saklanması için, istenilen sayıda 1.7 milliliter ependorf tüpüne iki microliters PBS ekleyerek hazırlayın.

Doku kültürü kabininde, inkübatörden 35 mm'lik bir kap içerisindeki lamel setini çıkarın. Bu kaptaki bir lameli hızla, HBSS içeren yeni bir 35 mm'lik kabın kapağına aktarın. Hücrelerin sağlıksız hale gelmemesi için, işlem yapılmayan lamellerin hızla inkübatöre geri yerleştirilmesi kritik önem taşır.

Uzun süreler boyunca dışarıda bırakılırsa. Hücre hasadı için mikromanipülatör takılı 40 x objektifli bir ters ışık mikroskobu gereklidir. Tutucudan uzağa yönlendirilen esnek tüplere sahip bir pipet tutucu kullanın; toplama sırasında pipetin istenmeyen hareketlerini önlemek için tüpleri sabit bir yüzeye sabitleyin.

Borunun ucuna, lure lock bağlantılı bir mililitrelik şırınganın takılabilmesi ve kullanıcılar arasında değiştirilebilmesi için bir iğne yerleştirin. Bir elin parmakları arasında gergin tutulan bir Kim wipe üzerinden pipet ucunu bir veya iki kez çok hafifçe geçirerek ucu kontrollü bir şekilde kırıp mikropipeti hazırlayın. Açıklık, hedef hücre boyutunun yaklaşık %75 ila %100'ü kadar olmalıdır.

Mikropipeti mikropipet tutucuya sabitleyin ve mikropipet tutucuyu mikromanipülatörlerdeki ek parçaya takın. Son olarak, 40 x objektifi ayarlayın. Kabı mikroskop tablasına yerleştirin ve hasat için uygun bir hücre bölgesi bulun.

Primer nöronal kültürler söz konusu olduğunda, hücre komşularından nispeten izole olmalıdır. Çevre hücrelerin ve/veya uzantıların toplanmasını önlemek için, toplanacak olan hücreyi görüş alanının merkezine yerleştirin. Mikropipeti kap içerisindeki solüsyona doğru ve ışık yoluna girecek şekilde ilerletmek için mikromanipülatörü kullanın.

Pipet ucunu çözeltinin içine indirin. Okülerden bakıldığında, pipet görüş alanında bir gölge olarak görünmelidir. Bu noktadan itibaren, hücre düzleminin oldukça üzerinden şırınga ile hafifçe üfleyerek pozitif basınç uygulayın.

Pipet ucunun konumunu, görüş alanı içerisine girene kadar ayarlayın ve kaba odaklama düğmelerini kullanarak pipet ucuna odaklanın. Bu noktada, pipetin ağız boyutunun çok büyük veya çok küçük olup olmadığını değerlendirin. Toplama bölgesinde pipetin kırılmasını önlemek için, doğru ağız boyutu bulunana kadar başka bir mikro pipet ile değiştirin.

Mikromanipülatörleri kullanarak pipet ucunu hücrelere doğru ilerletmeden önce, odak düzlemini ilerletmek için kaba odaklama düğmesini kullanın. Hücreler yaklaştıkça, hem hücreler hem de pipet ucu odaklanana kadar ince odaklama düğmesini kullanın. Hücrelerin lamın üzerinden uçup gitmesini önlemek için, hedef hücreye ulaşmadan önce pozitif basınç uygulamayı durdurun.

Pipet ucunu, toplanacak hücre somasına temas edecek şekilde mikro manipülatörler ile konumlandırın. Şırıngayı kullanarak, hücre pipet ucuna girene kadar ağızla hafifçe vakum uygulayın. Eğer hücre pipete girmiyorsa, ucu nazikçe hücreye yaklaştırın ve lamdan kalkana kadar aşağıya doğru hareket ettirin.

Pipeti hemen yukarı hareket ettirmek ve çözeltiden çıkarmak için mikro manipülatörü kullanın. Pipeti tutucudan çıkarın. Hazırlanan 1,7 milliliter einor tüpünü bir elinizde tutun ve pipet ucunu tüpün alt kısmına doğru yan tarafına hafifçe çarptırarak kırın.

Kırık uç tüpün merkezinde olacak şekilde 0,1 mililitre işaretini hedefleyerek, bir mililitrelik bir şırıngaya takılı iğneyi pipetin üst açıklığından içeri yerleştirin. Pistonu hızla aşağı iterek pipetteki solüsyonun tüpün içine püskürmesini sağlayın. Ucun tüpün kenarlarındaki herhangi bir sıvıya temas etmemesine dikkat edin.

Kılcallık etkisi sıvıyı tekrar pipete çekeceği için hücre pipetin tam ucunda kalmalı ve bu durum hücrenin düzgün bir şekilde dışarı atılması için yeterli olmalıdır. Tüpün içeriğini bir masaüstü mikrosantrifüj kullanarak hızlıca çöktürün ve ileri işlemler veya PCR veya yeni nesil dizileme gibi diğer uygulamalar için kuru buz üzerinde dondurun veya buz üzerinde bekletin. Burada, izole edilmiş bir nöronun başarılı bir şekilde hasat edilmesine dair bir örnek gösterilmektedir.

Başlamak için, nispeten düşük yoğunluklu bir hücre bölgesi seçilmiştir. Ardından pipet ucu, hedeflenen hücreye doğru ilerletilmiştir. Burada, hücre toplandıktan sonraki görüş alanı gösterilmektedir.

Çevredeki süreçlerin lamella üzerinde kaldığına dikkat edin. Aksine, bu şekil, etkili toplama için uygun olmayan boyuttaki iki pipet ucu görüntüsünü göstermektedir. Bu uç eksik toplamaya yol açarken, burada gösterilen uç ise çevre ortamın toplanmasıyla sonuçlanacaktır.

Hasat ve RNA amplifikasyon analizinin ardından, amplifiye edilmiş RNA'nın dağılımını ve miktarını incelemek için bir biyonalizör kullanılması önerilir. Tek hücre materyalinden gerçekleştirilen başarılı bir amplifikasyon, düşük mikrogram düzeylerinde toplam miktar sağlayacak ve pürüzsüz ve geniş bir dağılıma sahip olacaktır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde dakikalar içinde tamamlanabilir; bu prosedürü gerçekleştirirken RNA içermeyen tekniklerin kullanılması önemlidir.