Tek Hücre Transcriptome Analizi

Bu prosedürün genel amacı, transkriptom analizi için tek hücrelerden örnekler hazırlamaktır. Bu, önce izolasyon için uygun bir hücre bularak gerçekleştirilir. Mikro pipet daha sonra izole edilecek hücrenin yanına yerleştirilir.

Daha sonra, hücre mikro pipetin ucuna çekilene kadar şırıngaya emme uygulanır. Prosedürün son adımı, mikro pipetin ucunu toplama tüpüne kırmak ve mikro pipetin kalan içeriğini tüpe boşaltmaktır. Sonuç olarak, protokolde de açıklanan arna amplifikasyon yöntemi kullanılarak amplifiye edilen materyalin mikrodizi analizi veya PCR veya yeni nesil dizileme gibi diğer uygulamalar için hücreler arasındaki mRNA popülasyonlarındaki farklılıkları gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, tek hücreler arasındaki farklar ve içgörü sağlayabilse de, dendritler veya dendrit sınıfları gibi hücre altı bölmelere de uygulanabilir ve dendrit işlevi hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Bu protokolün başlamasından önce, embriyonik 18. günden itibaren birincil nöronlar, sıçan Hippo Campi, 35 milimetrelik bir tabakta 12 milimetrelik örtü fişleri üzerine kaplandı ve yazılı protokolde açıklandığı gibi korundu. Pipetleri hasada hazırlamak için, otoklav cam pipetlerini elektrofizyolojiye uygun bir çapa çekmek için bir mikro pipet çektirme kullanın.

Üreticinin önceden ayarlanmış programını kullanarak, hücre toplanmadan önce uç kırılacağından delik boyutu kritik değildir. Pipetleri, hücreleri toplamaya hazır olduğunda uçların bozulmadan kalacağı mikro pipet saklama kavanozu gibi tozsuz bir ortamda dikkatli bir şekilde saklayın. Hasat edilen materyalin depolanması için iki mikrolitre PBS ekleyerek istenen sayıda 1.7 mililitre einor tüpü hazırlayın.

1 adet 35 milimetrelik kapak fişi tabağını bir doku kültürü başlığındaki inkübatörden çıkarın. Bu çanaktan bir kapak fişini HBSS içeren 35 milimetrelik yeni bir kabın kapağına hızlı bir şekilde aktarın. Hücreler sağlıksız hale geldikçe manipüle edilmeyen kapak fişlerini inkübatöre iade etmek çok önemlidir.

Uzun süre dışarıda bırakılırsa. Hücre toplama için bir mikro manipülatör ile donatılmış 40 x objektifli bir ters çevrilmiş ışık mikroskobu gereklidir. Tutucudan uzağa giden esnek borulu bir pipet tutucu kullanın, toplama sırasında pipetin istenmeyen hareketini önlemek için boruyu sabit bir yüzeye yapıştırın.

Borunun ucuna, yem kilidi bağlantısına sahip bir mililitrelik şırınganın takılabilmesi ve kullanıcılar arasında değiştirilebilmesi için bir iğne yerleştirin. Mikro pipeti, bir elinizin parmakları arasında gergin bir Kim mendilini tutarak ve pipetin ucunu kağıt üzerinde bir ila iki kez çok nazikçe fırçalayarak kontrollü bir şekilde kırarak hazırlayın. Açıklık, hedef hücre boyutunun yaklaşık% 75 ila 100'ü olmalıdır.

Mikro pipeti mikro pipet tutucuya sabitleyin ve mikro pipet tutucuyu mikro manipülatörlerin yuvasına takın. Son olarak, 40 x hedefini belirleyin. Çanağı mikroskop tablasına yerleştirin ve hasat için uygun bir hücre bölgesi bulun.

Birincil nöronal kültürler söz konusu olduğunda, hücre komşularından nispeten izole edilmelidir. Çevredeki hücrelerin ve/veya işlemlerin hasat edilmesini önlemek için, hasat edilecek hücreyi görüş alanının ortasına yerleştirin. Mikro pipeti tabaktaki çözeltiye doğru ışık yoluna ilerletmek için mikro manipülatörü kullanın.

Pipet ucunu çözeltiye indirin. Göz merceğinden bakıldığında, pipet görüş alanında bir gölge olarak görünmelidir. Bu noktadan itibaren, hücre düzleminin çok üzerinde şırıngadan hafifçe üfleyerek pozitif basınç uygulayın.

Pipet ucunun konumunu görüş alanı içine girene kadar ayarlayın ve rota odaklama düğmelerini kullanarak pipet ucuna odaklanın. Bu noktada, pipetin delik boyutunun çok büyük veya çok küçük olup olmadığını değerlendirin. Delik boyutu yanlışsa, doğru delik boyutu bulunana kadar başka bir mikro pipetle değiştirin Toplama bölgesinde pipet kırılmasını önlemek için.

Mikrom manipülatörlerini kullanarak pipet ucunu hücrelere doğru ilerletmeden önce odak düzlemini ilerletmek için kurs odağını kullanın. Hücreler yaklaştıkça, hem hücreler hem de pipet ucu odakta olana kadar ince odağı kullanın. Kapak kızağından uçmalarını önlemek için davacı hücrelere ulaşılmadan önce pozitif basınç uygulamayı bırakın.

Pipet ucunu mikro manipülatörlerle birlikte, hasat edilecek hücre soma'sına değecek şekilde konumlandırın. Şırıngayı kullanarak, hücre pipet ucuna girene kadar ağızdan hafifçe emme uygulayın. Hücre pipete girmiyorsa, ucu kapak fişinden kalkana kadar yavaşça hücreye yaklaştırın ve aşağı doğru hareket ettirin.

Pipeti hemen yukarı ve solüsyondan çıkarmak için mikro manipülatörü kullanın. Pipeti tutucudan çıkarın. Hazırlanan 1,7 mililitrelik einor tüpünü bir elinizle tutun ve tüpün yan tarafındaki pipetin ucunu yavaşça aşağıya doğru kırın.

Kırık uç tüpün içinde ortalanmış halde 0,1 mililitre işaretini hedefleyerek, bir mililitrelik şırıngaya bağlı bir iğneyi pipetin üst açıklığına sokun. Pistona hızlı bir şekilde bastırın ve pipetteki çözeltiyi tüpe püskürtmeye zorlayın. Tüpün kenarlarındaki herhangi bir sıvının ucunu değdirmemeye dikkat edin.

Kılcal hareket sıvıyı pipete geri getireceğinden, hücre pipetin en ucunda kalmalıdır ve bu, hücreyi düzgün bir şekilde dışarı atmak için yeterli olmalıdır. Bir masaüstü mikro fug kullanarak tüpün içeriğini hızlı bir şekilde döndürün ve kuru buz üzerinde dondurun veya daha sonraki işlemler veya PCR veya yeni nesil dizileme gibi diğer uygulamalar için buzun üzerine yerleştirin. Burada gösterilen, izole edilmiş bir nöronun başarılı bir şekilde toplanmasına bir örnektir.

Başlamak için, nispeten düşük yoğunluklu bir hücre bölgesi seçildi. Pipet ucu daha sonra istenen hücreye doğru ilerletildi. Burada görüş alanı, hücre hasat edildikten sonra gösterilir.

Çevredeki işlemlerin kapak fişi üzerinde kaldığına dikkat edin. Tersine, bu şekil, etkili hasat için uygun olmayan bir boyutta olan pipet uçlarının iki görüntüsünü göstermektedir. Bu uç eksik hasada yol açarken, burada gösterilen uç çevredeki ortamın toplanmasına neden olacaktır.

Hasattan ve bir RNA amplifikasyon analizinden sonra, amplifiye edilmiş RNA'nın dağılımını ve miktarını incelemek için bir biyoanalizör kullanılması önerilir. Tek hücreli materyalden başarılı bir amplifikasyon, düşük mikrogramlarda toplam miktarlar verecek ve pürüzsüz ve geniş bir dağılıma sahip olacaktır Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik dakikalar içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse, RNA içermeyen tekniği kullanmak önemlidir.