Name: Tek Hücre Transcriptome Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Öğrenin, sıçan primer nöron kültürlerinden tek hücre izolasyonu ve aRNA amplifikasyonu kullanarak transkriptom analizi yapmayı. Bu yöntem, hücresel heterojeniteyi incelemek için uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Terri Schochet bu belgede yer alan resimler için hücre kültürlerinin sağlamak için, hücre kültürleri korumak için kaplama ve Kevin Miyashiro için teşekkür ederiz. Buna ek olarak, Kevin Miyashiro, Dr. Peter Buckley ve Tiina Pertiz Arna prosedürü giriş için teşekkür ederiz. Bu çalışma için fon Ulusal Yaşlanma Enstitüsü, Ulusal Ruh Sağlığı ve Pennsylvania Topluluğu İnsan Kaynakları Gerçek Bulucu fonları Enstitüsü oldu.

<ol><li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li>
<li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li>
<li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1%3A+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li>
<li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li>
<li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+analysis%3A+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neeurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li>
<li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+DNA+synthesis+in+situ%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enxymol%22%5BJournal%5D)">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li>
<li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li>
<li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Aging+Knowledge+Eviron%22%5BJournal%5D)">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22P-1000+%26+P-97+Pipette+Cookbook%22">P-1000 & P-97 Pipette Cookbook</a>. , rev. F, Sutter Instrument. (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MinElute+Handbook+For+MinElute+Reaction+Cleanup+Kit%22">MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit</a>. , Qiagen. 28-29 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Megascript+kit%22">Megascript kit</a>. , Ambion. 7-8 Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MEGAclear+kit%22">MEGAclear kit</a>. , Applied Biosystems. 4-5 Forthcoming.</li>
<li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis%3A+Implications+for+neuronal+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li>
<li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li>
<li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis%3A+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+%28PREXCEL-Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li>
<li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+forensic+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li>
<li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li>
</ol>

Dr Eberwine Arna patent Dr Eberwine bir pay sahibi olduğu LBS teknolojileri lisanslı bir mucit.

Notlar ve Sorun Giderme <ul><li> Öncesi ve sonrası hedef hücreyi izole olduğunu gösteren görüntüler ve kalan penumbra bakir kaldı almak isteyebilirsiniz. </li><li> Hasat gibi çok fazla çözüm pipet giriyor, 3 Luer-Lock parçaları yolu ve pozitif basınçlı tüp tutmak için şırınga pistonu kullanabilirsiniz. İstenilen ses işleme türüne göre değişir ama çoğu uygulama için en fazla 5 ul iyi olmalıdır. </li></ul> Moleküler biyoloji teknikleri hakkında genel ipuçları <ul><li> Vortex tüm hisse senedi tüpleri ve bir tepki eklemeden önce onları aşağı döndürün. ASLA vorteks enzimler. </li><li> Reaksiyonları, tampon uygun konsantrasyonda olmasını sağlamak için enzim eklemeden önce iyice karıştırın. </li><li> Mümkünse stratacooler kullanarak -20 ° C&#39;de enzim stokları tutun. Aksi halde, kullanımdan önce doğru kaldırmak buz üzerinde tutmak ve -20 ° C&#39;ye kadar hemen dönmek </li><li> Her zaman pipetleme hataları azaltmak için birden fazla reaksiyon hazırlarken ana karışımları olun. Örneklerin sayısına göre gerekli hacmi hesaplayın ve% 10-20 ekleyin. </li><li> Mağaza RNA -80 ° C geciktirir bozulması. RNA asidik koşullarda oluşur RNA geciktirir apurination tampon depolanan en istikrarlı. </li></ul> Arna Usul Genel Anahat Şekil 4A Arna prosedürün ilk turda göstermektedir. T7-oligo (dT) astar poli-T kısmı, ilk iplikli tepki olarak, Polya kuyrukları bağlanarak mRNA türleri (uzun beyaz dikdörtgen) seçer. Ayrıca bazı microRNA polyadenylated ve bu yordamı Çekilecek. Ancak, daha da önemlisi, hücre içinde en bol RNA, ribozomal RNA&#39;lar, olmaz. Bu oligo mRNA bir şablon olarak kullanarak tamamlayıcı iplikçik cDNA (uzun gri dikdörtgen) sentezlemek için Reverse Transcriptase için bir astar olarak davranır. T7, T7-oligo (dT) astar bölümü başlangıç ​​mRNA dizisi antisens çerçeve T7 RNA polimeraz organizatörü içermektedir. Bu, daha sonra in vitro transkripsiyon tepki olarak kullanılır. Daha sonra, önceki adımda oluşturulan mRNA / DNA hibrid mRNA gecikmeli iplikçik DNA sentezi oluşturulan Okazaki parçaları benzer RNA &quot;primerler&quot; (küçük beyaz dikdörtgenler) oluşturmak Rnase H tarafından kısmen hidrolize olur. DNA Polimeraz I, RNA parçaları, bir şablon olarak mRNA tamamlayıcı DNA kullanılarak asal DNA sentezi için kullanır. &#39;3&#39; sonraki RNA parçası, 5 ulaştığında nükleaz faaliyet ribonucleotides kaldırır ve deoxyribonucleotides ile değiştirir. DNA ligaz önde gelen iplikçik yedek tam olmayan herhangi bir ipliklerini Arter eklenir. T4 DNA Polimeraz RNA parçaları, DNA Polimeraz I oluşturarak ilk primerler olarak nerede görev alanları doldurmak için eklenen bir künt uçlu, çift tıklatın IVT reaksiyon gerçekleştirmeden önce arıtılarak cDNA mahsur. IVT tepki olarak, T7 RNA polimeraz anlamda iplikli bir şablon olarak kullanarak çift cDNA telli ve sentezler antisens RNA molekülleri (uzun siyah dikdörtgenler) dahil T7 organizatörü bağlanır. Bu binlerce antisens RNA molekülleri her çift zincirli cDNA molekülü (Şekil 4A) üretildiği amplifikasyon adım olarak hizmet vermektedir. Şekil 4B tasvir gibi ikinci turda, başlangıç ​​RNA bu yana ilk turda biraz daha farklı bir ters transkripsiyon reaksiyonu ile başlar antisens (düz siyah dikdörtgen) ve T7-oligo tarafından hedef alındı ​​polyadenylated kuyruk yoksun (dT) ilk turda astar. Bu nedenle, bu reaksiyon rastgele primerler (küçük gri dikdörtgenler) ve daha sonra denatüre RNA ile astarlanmalıdır. Ikinci iplikçik reaksiyon sonra önceki ters transkripsiyon tepki olarak oluşturulan anlamda RNA&#39;nın 3 &#39;ucuna poli-dizisi bağlanır T7-oligo (dT) astar ile astarlanmalıdır. Başka bir IVT reaksiyon ilk turda olduğu gibi aynı şekilde yapılır. Bu ikinci turda genellikle, tek bir hücre üç tur amplifikasyon elde etmek için en az bir kez tekrarlanır. Uygulamalar Biz bu yazıda olduğu teknikleri, uygulamalar çok sayıda tercüme edilebilir. Tek hücre izolasyonu protokol akut dilimler halinde kullanılmak üzere modifiye edilebilir. 14 teknik olarak daha zor olsa da bu alternatif hazırlanması, aynı ilkeler geçerlidir. Ayrıca, pipet boyutu biraz ayarlanır ise hücrelerin fizyolojisi kayıtları hasat fizyolojik çıkışları arkasında moleküler mekanizmaları iyi kontrollü bir soruşturma için izin vermeden önce yapılmış olabilir. Başka bir hafif bir değişiklik hücre soma süreçleri izole etmektir. Bu uygulama için 15, bir pipet ile hücre gövdeleri toplamak ve daha sonra yeni bir pipet yardımıyla geri dönün ve 100-300 tespit dendrit toplamakes veya toplama tüpünün başına aksonlar 16 Bir kez hücreler, aynı hücre popülasyonlarının içinde bile farklı ve karşılaştırmalar mRNA bollukları ve kompozisyonlar arasında yapılabilir, hasat edilmiştir. Üçüncü turda Arna içine biotinlenmiş-UTP birleştirilerek bu göreceli mRNA bollukları belirlemek için mikroarray analizi sağlar. Orijinal mRNA nüfusun kompozisyonu da yeni nesil sıralama kullanarak Arna işlemden sonra tespit edilebilir. Güçlendirilmiş Arna da, bir hücre tipi mRNA&#39;ların tam bir set, ikinci hücre tipi fenotipi eski haline geçiş ikna etmek için farklı bir hücre tipi transfekte olduğu hücre fenotipi dönüşüm çalışmaları onaylamak için kullanılabilir bir prosedür laboratuvarı tarafından geliştirilen ve TIPeR olarak bilinen 17 Bu çalışmalar, hastalık durumları ve hücre fenotipleri ve bu tür çalışmaların eğitim için yararlıdır laboratuvarda halen devam etmektedir . RT-PCR veya qPCR hücre spesifik genlerin ifadesi onaylamak için güçlendirilmiş malzeme üzerine yapılabilir. Ayrıca, transfeksiyon veya transdüksiyon verimliliği tek hücre düzeyinde değerlendirmeler yapılabilir. Avantajları ve Sınırlamalar Soyut olarak belirtildiği gibi, analiz için tek hücre izolasyonu, heterojen hücre popülasyonlarının analizi ile görülen ortalama etkileri ortadan kaldırır. Bu ortalama etkileri tek bir hücre içinde bol transkript temsil eden ve ortalamayla çok düşük bolluğu transkript tespiti ve önlenmesi ile mRNA bollukları yanlış. Flow sitometri hücreleri tek tek sıralamak için kullanılan, ancak bu yöntem hücre spesifik belirteçler ve pahalı ekipman bilgisi gerektirir. 18 Lazer yakalama mikrodiseksiyon UV veya IR lazer yakalama mikrodiseksiyon sistemleri ile ya da hatta tek bir hücre ve hücre içi çekim için izin ancak ilgi hücreleri gerektirir çok ince kesitler yüzeyinde bulunan 19 flow sitometri benzer, lazer yakalama mikrodiseksiyon da pahalı ekipman gerektirir. Yukarıda açıklanan elektrot tabanlı toplama tekniğinin en önemli avantajlarından biri, değerli elektrofizyolojik veriler aynı hücre üzerinde yapılacak işlevsel ve transcriptome analiz için izin, hasattan önce ilgi hücre elde edilebilir 20 A tekniğin dezavantajı. mikromanipülatörler kullanarak gerektirir. Mikromanipülatörler ile tanıdık Araştırmacılar, bu tekniğin çok sezgisel bulacaksınız; Ancak, böyle bir deneyime sahip bireyler gerekli ince hareketleri ile rahat olmak gerekir. Herhangi bir büyütme tekniği doğasında boyutu ve nükleotid kompozisyon dayalı belirli transkript tercihli büyütme. 4,6,7 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve cDNA hızlı amplifikasyon temelli teknikler transkript üstel amplifikasyon uçları (YARIŞ) Sonuç olarak, lineer amplifikasyon ise Arna amplifikasyon işlemi sonuçları. Böylece, Arna prosedürünün en önemli avantajlarından biri mRNA transkript bağıl bollukları sadece doğrusal katlanarak yükseltme karşı kuvvetlenme sürecinde meydana gelen herhangi bir hata ya da önyargıları büyüterek daha iyi korumak için onun yeteneği yatıyor hataları ve önyargıları söyledi. Mikroarray analizi ile birleştiğinde Arna prosedürü benzer ya da farklı morfoloji, tedavi edilen veya tedavi edilmemiş tek hücreleri arasındaki mRNA bollukları karşılaştırma için izin verir. Ayrıca, yeni nesil sıralama için amplifiye malzeme teslim edilebilir. 5,8, prosedür için rastgele primerler kullanımı aksine, oligo-dT astarlanmalıdır prosedür önyargıları amplifikasyon yukarıda açıklanan beri Ancak, bu tür analizlerde dikkat edilmelidir 3 &#39;mRNA ve genellikle her turda daha sonra güçlendirilmiş malzemeden hafif kısalma sona erer. Bakım mikroarray sonuçları analiz bazı yanlış yok çağrılar biraz kısaltılmış güçlendirilmiş malzemeden ortaya çıkabilir gibi standart yöntemleri ile alınmalıdır. Buna ek olarak, sıralama ise sonuç gerçekten de tam 5 sağlayacaktır &#39;en orijinal mRNA sıra, bazı mRNA 5&#39; dizileri kaçırmış olabilir. Bu nedenlerden dolayı, ilâvelerle, mermi sayısı sınırlı olmalı.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>Spiegelgas lamel camları</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 35x10 mm kültür kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü için su</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>Hücre kültürü için kullanılan çözeltilerin hazırlanmasında ve lamel camlarının durulanmasında kullanılır</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, ultrapure</td><td>BD Biosciences</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Earle&amp;rsquo; tuzları ve glutamax içeren MEM</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>Hücre ekimi için</td></tr><tr><td>D-glukoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>At serumu</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Sitozin beta-D-arabinofuranosid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Earle&amp;rsquo; tuzları ve L-glutamin içeren MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>Hücre büyütme için</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>B27 serumsuz supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kapiler tüpler (1.5mm dış çap, 100mm uzunluk)</td><td>Kimble Chase</td><td>34500 99</td><td>Uygun delik çapı elde edildiği sürece herhangi bir borosilikat cam pipet kullanılabilir.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>Bileşenleri sonraki işlemlere müdahale etmediği sürece (örneğin Ca&amp;rsquo;t interfere with any future processing (i.e. no Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; veya Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; içermemesi) herhangi bir çözelti kullanılabilir</td></tr><tr><td>1ml şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>İğne</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Kalibre, pipetlerin çapına bağlıdır</td></tr><tr><td>dNTP karışımı</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>dt-T7 oligo</td><td>Özel üretim</td><td>Midland Certified</td><td></td></tr><tr><td>İkinci zincir tamponu (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>İkinci zincir tamponu ile birlikte sağlanır</td></tr><tr><td>E.coli DNA Ligaz</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimeraz I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Rastgele primerler</td><td>BMB</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Ters Transkriptaz</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>Kit içerisinde (18080-044), birinci zincir tamponu (Y02321) ve DTT ile birlikte gelir</td></tr><tr><td>MEGAclear Kiti</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaksiyon Temizleme Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimeraz</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TotalPrep RNA Amplifikasyon Kiti</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>Alevli/Brown mikro-pipet çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>Sutter'ın birçok başka modeli vardır, birçoğu uygulama kılavuzunda tartışılmıştır</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Yeni Eppendorf modelleri gibi birçok başka mikromanipülatör de kullanılabilir</td></tr><tr><td>Pipet Tutucu</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>Mikromanipülatöre ve pipet dış çapına göre değişiklik gösterecektir</td></tr><tr><td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

tek hücre transcriptome analizi

Transcriptome Analysis of Single Cells

Birçok gen ekspresyon analizi teknikleri heterojen toplumlarda kültür doku homojenatlarında veya hücreleri hücreleri izole malzeme güveniyor. 1,2,3 durumda beynin hipokampus gibi bölgelerin her biri, farklı hücre türleri ile karmaşık bir düzen içeren farklı mRNA profilleri. Hücre popülasyonlarının arasında ve içinde moleküler farklılıklar içine derinlemesine bir soruşturma daha fazlası için tek hücre hasat yeteneği sağlar. Biz daha fazla işlem için hücre hasat için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. Genellikle elektrofizyoloji kullanılan Pipetler (aspirasyon kullanarak) bir ilgi hücre izole etmek için kullanılan ve moleküler biyoloji teknikleri herhangi bir sayı ile daha fazla işlem için elverişli bir Eppendorf tüp içine depozito. Bizim protokol dendritler hücre kültürü veya akut dilim bile tek tek hücrelerin hasat için modifiye edilebilir. Ayrıca tek bir hücre izolasyonların büyük bir alt uygulama olarak Arna amplifikasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, ters transkripsiyon veya gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi diğer gen ekspresyon analizi teknikleri, alternatif olarak laboratuar tarafından geliştirilmiştir. 4,5,6,7,8 Bu teknik, doğrusal amplifikasyonu için sağlar polyadenylated RNA sadece malzeme femtograms ile başlayan ve antisens RNA mikrogram miktarlarda. Doğrusal amplifiye malzeme izole hücre transcriptome bileşenleri göreceli bolluk PCR üstel amplifikasyon daha doğru tahmin sağlar. Temel prosedür amplifikasyon iki tur oluşur. Kısaca, bir T7 RNA polimeraz promoter mRNA transkript oluşturulan çift zincirli cDNA içine dahil edilmiştir. Bir in vitro transkripsiyon geceleme (IVT) reaksiyon sonra T7 RNA polimeraz çift telli cDNA birçok antisens transkript üretir yapılır. Ikinci turda bu süreci tekrarlıyor ancak başlangıç ​​materyali bu yana bazı teknik farklılıklar ile antisense RNA. Amplifikasyon üç turda, ikinci turda tekrar standarttır. Genellikle, üretilen antisens RNA melezleşmiştir ve bir mikroarray tespit böylece biotinlenmiş nükleozid trifosfatlar kullanarak in vitro transkripsiyon reaksiyonu üçüncü turda yapılır. 7,8

Bu yazıda, sıçan primer nöronal kültürlerin ve sonraki transcriptome analizi Arna amplifikasyon kullanarak tek hücre hasat için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, herhangi bir hücre tipi için genellenememektedir.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Birçok gen ekspresyon analiz tekniği, doku homojenatlarından elde edilen heterojen hücre popülasyonlarından izole edilen materyallere veya ... içindeki hücrelere dayanmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, transkriptom analizi için tek hücrelerden örnekler hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle izolasyon için uygun bir hücre bulunarak gerçekleştirilir. Ardından, mikro pipet izole edilecek hücrenin yanına konumlandırılır.Ardından, hücre mikro pipet ucuna çekilene kadar şırıngaya vakum uygulanır. Prosedürün son adımı, mikro pipet ucunun toplama tüpü içine kırılarak ayrılması ve mikro pipetin kalan içeriğinin tüpe boşaltılmasıdır. Sonuç olarak, protokolde ayrıca açıklanan RNA amplifikasyon yöntemi kullanılarak amplifiye edilen materyallerin mikroarray analizi veya PCR veya yeni nesil dizileme gibi diğer uygulamalar aracılığıyla, hücreler arasındaki mRNA popülasyonlarındaki farklılıkları gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, tek hücreler arasındaki farklar ve işleyiş hakkında bilgi sağlayabilse de, dendritler veya belirli dendrit sınıfları gibi hücre altı kompartmanlara da uygulanabilir ve dendrit fonksiyonu hakkında önemli bilgiler sunabilir. Prosedürü, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Jennifer Singh uygulamalı olarak gösterecektir. Bu protokolün başlangıcından önce, embriyonik 18. gündeki sıçan Hippo Campi'den alınan primer nöronlar, 35 milimetrelik bir kap içerisindeki 12 milimetrelik lameller üzerine ekilmiş ve yazılı protokolde açıklandığı şekilde muhafaza edilmiştir. Toplama pipetlerini hazırlamak için, otoklavlanmış cam pipetleri elektrofizyolojiye uygun bir çapa çekmek amacıyla bir mikro pipet çekici kullanın.Üreticinin ön ayarlı programı kullanıldığında, uç hücre toplama öncesinde kırılacağı için delik boyutu kritik değildir. Pipetleri, hücre toplama aşamasına gelindiğinde uçların sağlam kalacağı şekilde, mikro pipet saklama kavanozu gibi tozsuz bir ortamda dikkatlice saklayın. Toplanan materyallerin saklanması için iki mikrolitre PBS ekleyerek istenen sayıda 1,7 mililitrelik einor tüpü hazırlayın.Doku kültürü kabininde, inkübatörden 1 adet 35 milimetrelik lamel içeren kap çıkarın. Bu kaptaki bir lameli hızla HBSS içeren yeni bir 35 milimetrelik kabın kapağına aktarın. Hücreler sağlıksız hale geleceği için, işlem yapılmayan lamellerin inkübatöre geri döndürülmesi kritik önem taşır.Uzun süreler boyunca dışarıda bırakılırsa. Hücre hasadı için mikro manipülatörle donatılmış 40 x objektifli bir ters ışık mikroskobu gereklidir. Tutucudan uzağa yönelen esnek tüplere sahip bir pipet tutucu kullanın; toplama sırasında pipetin istenmeyen hareketlerini önlemek için tüpleri sabit bir yüzeye sabitleyin.Borunun ucuna, luer lock bağlantılı bir mililitrelik şırınganın takılabilmesi ve kullanıcılar arasında değiştirilebilmesi için bir iğne yerleştirin. Bir elin parmakları arasında gergin tutulan bir Kim wipe üzerine, pipet ucunu bir ila iki kez çok nazikçe sürterek ucu kontrollü bir şekilde kırıp mikropipeti hazırlayın. Açıklık, hedef hücre boyutunun yaklaşık %75 ila %100'ü kadar olmalıdır.Mikropipeti mikropipet tutucusuna sabitleyin ve mikropipet tutucusunu mikro manipülatörlerdeki ek parçaya takın. Son olarak, 40 x objektifi ayarlayın. Kabı mikroskop tablasına yerleştirin ve hasat için uygun bir hücre bölgesi bulun.Primer nöron kültürleri durumunda, hücre komşularından nispeten izole olmalıdır. Çevre hücrelerin ve/veya uzantıların toplanmasını önlemek için, toplanacak hücreyi görüş alanının merkezine yerleştirin. Mikro pipeti kapta bulunan solüsyonun içine ve ışık yoluna doğru ilerletmek için mikro manipülatörü kullanın.Pipet ucunu solüsyonun içine indirin. Okülerden bakıldığında, pipet görüş alanında bir gölge şeklinde görünmelidir. Bu noktadan itibaren, hücre düzleminin oldukça üzerinden şırıngayla hafifçe üfleyerek pozitif basınç uygulayın.Pipet ucunu görüş alanı içerisine girene kadar konumlandırın ve kaba odaklama düğmelerini kullanarak pipet ucuna odaklanın. Bu noktada, pipetin iç çapının çok büyük veya çok küçük olup olmadığını değerlendirin. Toplama bölgesinde pipetin kırılmasını önlemek için, doğru iç çap bulunana kadar başka bir mikro pipet ile değiştirin.Mikromanipülatörleri kullanarak pipet ucunu hücrelere doğru ilerletmeden önce, odak düzlemini ilerletmek için kaba odak ayarını kullanın. Hücreler yaklaştıkça, hem hücreler hem de pipet ucu netleşene kadar ince odak ayarını kullanın. Hedef hücrelere ulaşmadan önce, onları lam üzerine üfleyip uzaklaştırmamak için pozitif basınç uygulamayı durdurun.Pipet ucunu, hasat edilecek hücre somasına değecek şekilde mikro manipülatörler ile konumlandırın. Şırıngayı kullanarak, hücre pipet ucuna girene kadar ağızla hafifçe vakum uygulayın. Eğer hücre pipete girmiyorsa, pipet ucunu hücreye doğru hafifçe yaklaştırın ve lamelden kalkana kadar aşağıya doğru hareket ettirin.Pipeti hemen yukarı hareket ettirmek ve çözeltiden çıkarmak için mikro manipülatörü kullanın. Pipeti tutucudan çıkarın. Hazırlanan 1,7 mililitrelik ependorf tüpünü bir elinizde tutun ve pipet ucunu, tüpün alt kısmına doğru yan tarafında nazikçe kırın.Kırık uç tüpün içinde ortalanmış şekildeyken 0,1 mililitre işaretini hedefleyerek, bir mililitrelik bir şırıngaya takılı iğneyi pipetin üst açıklığından içeri yerleştirin. Pistonu hızla aşağı iterek pipetteki solüsyonun tüpün içine püskürmesini sağlayın. Ucun tüpün kenarlarındaki herhangi bir sıvıya temas etmemesine dikkat edin.Kılcallık etkisi sıvıyı pipete geri getireceği için, hücre pipetin tam ucunda kalmalıdır ve bu durum hücrenin uygun şekilde dışarı atılması için yeterli olmalıdır. Tüpün içeriğini bir masaüstü mikro santrifüj kullanarak hızla çöktürün ve ileri işlemler veya PCR ya da yeni nesil dizileme gibi diğer uygulamalar için kuru buz üzerinde dondurun veya buz üzerinde muhafaza edin. Burada, izole edilmiş bir nöronun başarılı bir şekilde hasat edilmesine dair bir örnek gösterilmiştir.Başlangıç olarak, nispeten düşük yoğunluklu bir hücre bölgesi seçildi. Ardından pipet ucu, hedeflenen hücreye doğru ilerletildi. Burada, hücre toplandıktan sonraki görüş alanı gösterilmektedir.Çevreleyen süreçlerin lamel üzerinde kaldığına dikkat edin. Buna karşılık, bu şekil, etkili toplama için uygun olmayan boyuttaki iki pipet ucu görüntüsünü göstermektedir. Bu uç eksik toplamaya yol açarken, burada gösterilen uç ise çevreleyen ortamın toplanmasıyla sonuçlanacaktır.Hasat ve RNA amplifikasyon analizinin ardından, amplifiye edilmiş RNA'nın dağılımını ve miktarını incelemek için bir bioanalyzer kullanılması önerilir. Tek hücre materyalinden gerçekleştirilen başarılı bir amplifikasyon, düşük mikrogram seviyelerinde toplam miktar sağlayacak ve pürüzsüz ve geniş bir dağılıma sahip olacaktır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde dakikalar içinde tamamlanabilir; bu prosedür gerçekleştirilirken RNA içermeyen tekniklerin kullanılması önemlidir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

RNA polimeraz II transkripsiyonel kinetiği canlı hücrelerin belirli genlerin ölçülür. ilgi gen transkripsiyonu mRNA'ların floresan etiketli ve (sıkı bağlamak) in vivo kinetiği transkripsiyonel uzama elde edilir Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak.

Tek Yaşayan Hücreler mRNA Transkripsiyon Kinetik Ölçüm

Tek hücreli ifade profil, tek tek hücrelerin ayrıntılı gen ekspresyon analizi sağlar. Biz kardiyomiyositlerde izolasyonu için yöntemler tanımlamak ve belirli hedeflere bütün transcriptome mikroarray veya qPCR için lizatları hazırlanıyor.

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

Tek memeli hücrelerini sıralamak ve her hücrede ilgilenilen 96'ya kadar hedef genin ekspresyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mutlak transkript sayılarının tahminini sağlamak için dahili qPCR standartlarının kullanılmasını içerir.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Toplu gen ifade ölçümleri bulut tek hücre farkları türdeş olmayan hücre popülasyonlarının. Burada, bir protokol açıklamak nasıl tek hücreli gen ifade analizi ve dizin için Variety aktif hücre sıralama (FACS tarafından) sıralama heterojenite betimlemek için birleştirilebilir ve immunophenotypically karakterize tatlı ayrı hücre popülasyonlarının.

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Bu iletişim kuralı genel işlemlerini açıklar ve kalite kontrol sağlıklı yetişkin memeli tek hücreleri damlacık-esaslı, yüksek üretilen iş tek hücre RNA-Seq hazırlıkları hazırlanması için gerekli denetler. Sıralama parametreleri, okuma hizalama ve aşağı akım tek hücreli bioinformatic analiz da sağlanır.

Damlacık tek hücre barkodlama tabanlı Transcriptomics yetişkin memeli dokuların

Bu protokol, lazer yakalama mikrodisseksi kullanarak yüksek doğruluk ve anatomik özgüllük ile amigdala merkezi çekirdeğinden tek nöron, mikroglia ve astrosit toplamak için nasıl açıklar. Ayrıca, bu hücrelerin transkripsiyonu bir alt kümesini ölçmek için mikroakışkan RT-qPCR kullanımımızı açıklarız.

Tek Hücretranskripsiyonel Profillerini Analiz Etmek Için Lazer Yakalama Mikrodisseksive Mikroakışkan QPCR'nin Birleştirilmesi: Opioid Bağımlılığına Sistem Biyolojisi Yaklaşımı

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Bu yayın, çekirdeklerin olgun adipositlerden izole edilmesi, floresan-aktive sıralama ile arınma ve tek hücre düzeyinde transkripsiyon için bir protokol açıklar.

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Bu makalede, farklı patolojileri temsil eden farklı şekillerde kardiyak miyositlerin yetiştirilmesi ve morfolojilerine göre bu yapışık kardiyak miyositlerin tek hücre düzeyinde sıralanması için yöntemler yer alıyor. Önerilen platform kalp yetmezliği farklı türleri için yüksek iş ve ilaç tarama için yeni bir yaklaşım sağlar.

ŞekilBağımlı Transkripsiyonları Tek Hücre Düzeyinde Çalışma Yaklaşımı

Mevcut protokol, yeniden kullanılabilir tek bir hücre kullanarak yinelemeli epigenomik analizler için tek hücreli bir yöntemi açıklamaktadır. Yeniden kullanılabilir tek hücre, aynı tek hücrede birden fazla epigenetik işaretin analizine ve sonuçların istatistiksel olarak doğrulanmasına izin verir.

Yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre

Bu makale, doku mimarisini korurken çeşitli transkriptomların yüksek çözünürlüklü haritalanmasını sağlayan Stereo-seq kullanarak formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku bölümlerinden konakçı, viral, fungal ve mikrobiyom RNA'sının kapsamlı uzamsal transkriptomik profilini çıkarmak için bir protokol sunmaktadır.

Stereo-seq ile Türden Bağımsız Transkriptomların Kapsamlı Uzamsal Profili

Öğrenin, sıçan primer nöron kültürlerinden tek hücre izolasyonu ve aRNA amplifikasyonu kullanarak transkriptom analizi yapmayı. Bu yöntem, hücresel heterojeniteyi incelemek için uygulanabilir.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Daha fazla video keşfet