Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Bu prosedürün genel amacı, kromatin, immünopresipitasyon veya chip analizlerinde kullanılmak üzere E 8.5 fare embriyolarını izole etmektir. Bu işlem, öncelikle fare embriyolarının izole edilmesi ve tek hücre süspansiyonlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, DNA'ya bağlı proteinlerin genomik DNA'ya kimyasal olarak çapraz bağlanması ve ardından DNA'yı fragmante etmek için sonikasyon uygulanmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, protein kromatin komplekslerini immünopresipite etmek ve saflaştırılmış DNA'yı izole etmektir. Prosedürün son adımı, immünopresipite edilmiş saflaştırılmış DNA'nın geleneksel PCR veya kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz edilmesidir. Nihayetinde, gelişmekte olan doku ve organlarda diferansiyasyon programının başlatılması sırasında, proteinlerin diferansiyasyona özgü genlerin düzenleyici dizileriyle olan etkileşimlerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu dönem, farklılaşmaya özgü genlerin transkripsiyonel olarak yetkin hale geldikleri sırada, bu genlerin düzenleyici dizileriyle etkileşime giren düzenleyici faktörlerin tanımlanması yoluyla, embriyogenez sırasında farklılaşma programının başlatılmasına dair önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamak için, embriyonik 8.5. günde sakrifiye edilen bir fareden uterus boynuzları çıkarılır. Onaylanmış bir protokole uygun olarak, doku makas kullanılarak taze kesit medyum içeren bir Petri kabına yerleştirilir.

Aşırı kanamayı önlemek için her bir implantasyon bölgesini ayrı ayrı kesin ve taze diseksiyon ortamı içeren bir Petri kabına yerleştirin. Bir penset yardımıyla, decidua tabakasını ortaya çıkarmak için her bir implantasyon bölgesindeki uterus tabakasını kaldırın; bireysel embriyoları penset kullanarak izole edin. Gelişimin bu aşamasında embriyolar; decidua dokusuyla temas eden paryetal vitellus kesesi, visseral vitellus kesesi ve amniyon ile çevrilidir.

Amniyon, embriyo ile doğrudan temas halinde olan şeffaf bir zardır. Viseral vitellüs kesesi, amniyon ile paryetal vitellüs kesesi arasında yer alır ve 8,5 ila 9,5 günlük embriyolarda, embriyoyu besleyen belirgin kan damarlarının varlığıyla kolayca ayırt edilir. Her bir embriyoyu çevreleyen zarlardan ayırın ve fazla kanı temizlemek için diseksiyon medyası içeren yeni bir plakaya tek tek aktarın.

Ardından, her bir embriyoyu 200 µL diseksiyon medyası içeren 1,5 mL'lik bir eppendorf tüpüne aktarın. İzole edilen embriyonun homojenizasyonu, embriyoları içeren her bir eppendorf tüpüne 200 µL tip iki kollajenaz çözeltisi eklenerek başlatılır.

Numuneleri 37 °C'deki bir çalkalayıcıda 100 RPM hızında 20 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Ardından, hücre kümelerini dağıtmak için numuneleri pipetleme yöntemiyle yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu, 1,5 mL'lik bir ependorf tüpü üzerine yerleştirilmiş 40 µm gözenek boyutundaki steril bir hücre süzgecinin üzerine uygulayın.

Ayrıştırmayı tamamlamak için hücre süzgecinin üzerine hemen oda sıcaklığında 600 microliters 1X DPBS uygulayın. Süspansiyon süzüldükten sonra hücre süzgecini atın ve örnekleri 4 °C'de beş dakika boyunca 4.000 G'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından süpernatantları atın.

Her bir peleti bir mililitre oda sıcaklığındaki 1X DPBS içerisinde süspanse edin. Ardından, örnekleri oda sıcaklığında 4.000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı ikinci kez uzaklaştırdıktan sonra, her bir peleti 200 µL oda sıcaklığındaki diseksiyon medyumu içerisinde yeniden süspanse edin; 200 µL'lik örneklere, final konsantrasyonu %1 formaldehit olacak şekilde 5,6 µL %37'lik formaldehit ekleyerek kromatini çapraz bağlayın.

Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin, ardından numuneleri 4 °C'de 3 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın. Hücreleri, mililitre başına 80 µL proteaz inhibitör kokteyli veya PIC içeren soğuk 1X DPBS ile yeniden süspanse edin. Ardından numuneleri 4 °C'de 3 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüjleyin.

Süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra, örnekler -80 °C'de dondurulabilir ve sonikasyon öncesinde birkaç ay boyunca stabil kalır; dondurulmuş hücre peletini buz üzerinde çözdürün veya önceki adımdaki peleti buz üzerine yerleştirin. Hücre peletini 100 µL oda sıcaklığında SDS liziz tamponunda yeniden süspande edin. Ardından 100 µL daha oda sıcaklığında SDS liziz tamponu ekleyin ve örneği pipetleme ve ters çevirme yöntemiyle yeniden süspande edin.

Hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyonun ardından, çapraz bağlı DNA'yı 200 ile 500 baz çifti arasına kırpmak için cihazı hazırlayın. Bu gösterimde, bir DIO geno bio rupture UCD 200 kullanılmıştır.

Örneği buz karışımıyla çevreleyerek sonikleyin. Sıcaklığının 4 °C'nin üzerine çıkmasına veya donmasına izin vermeyin. Soniklenen örneği 4 °C'de, 14.000 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı, buz üzerinde ön soğutulmuş taze bir eend DPH tüpüne aktarın. Sonikasyon uygulanmış örneği en fazla beş alikota bölün. Çapraz bağ geri dönüşü (cross-link reversal) için giriş materyali olarak saklamak amacıyla bir alikotu -20 °C'de depolayın.

Diğer alikotları, 800 µL tampon başına 1 µL taze eklenmiş PIC içeren çip dilüsyon tamponu ile on kat seyreltin. Öncelikle, çip analizi proteini için kullanılacak antikora göre ön temizleme için hangi aero hızlarının kullanılacağını belirleyin. Çip için kullanılacak antikor tavşan kaynaklı olduğundan burada A boncukları kullanılır.

Süpernatantı, 75 µL %50'lik somon spermi DNA ve proteini ekleyerek ön temizlemeden geçirin. Örnekleri 4 °C'de rotasyonla bir saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından örnekleri 4 °C'de 2.500 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantları önceden soğutulmuş yeni bir Eppendorf tüpüne aktarın.

Ön temizleme yapılmış Eloqua'ya örnek başına dört µg antikor ekleyin ve 4 °C'de rotasyonla gece boyunca inkübe edin. Her bir örneğe 60 µL somon spermi DNA proteini Ageros boncuk süspansiyonu ekleyerek başlayın ve 4 °C'de rotasyonla bir saat boyunca inkübe edin. Örnekleri 4 °C'de 1000 G hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işleminin ardından, süpernatantları dikkatlice uzaklaştırın ve atın; DNA-protein boncuk kompleksini buz üzerinde tutun. Pelletleri, yazılı protokolde açıklandığı şekilde bir ila dört numaralı tamponlar ile yeniden süspanse edin ve yıkayın.

Her bir yıkama, rotasyon eşliğinde beş dakikalık bir inkübasyon süresini, ardından 1000 G'de bir dakika boyunca santrifüjleme ve yıkama sonrası süpernatantın uzaklaştırılmasını içerir. Yıkanmış kromatin protein boncuk kompleksini 250 µL taze hazırlanmış elüsyon tamponunda yeniden süspanse ederek kromatin antikor kompleksini elüe edin. Her bir örneği beş saniye boyunca kuvvetlice vortexleyin ve ardından örnekleri oda sıcaklığında, rotasyon eşliğinde 15 dakika inkübe edin; ardından 2,500 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, her bir elüatı yeni bir Eppendorf tüpüne aktarın.

Elüsyon işlemini tekrarlayın ve her numune için elüatı aynı epp tüpünde birleştirin. Çapraz bağları geri döndürmek için, her 500 µL elüata 20 µL beş molar sodyum klorür ekleyin. Daha önce ayrılan girdi kontrolü için mililitre başına 40 µL beş molar sodyum klorür ekleyin.

EIT'leri 65 °C'lik bir su banyosunda dört saat boyunca ısıtın. DNA fragman boyutunu kontrol etmek için her örnekten 10 µL'yi, 0,1 ile 1 kb arasını kapsayan bir boyut belirtecinin yanındaki %2'lik agaroz jele yükleyip gece boyunca çalıştırın. DNA, keskin bir bant şeklinde değil, bir yayılma (smear) şeklinde görünecektir.

Kaya quick gel extraction kiti kullanarak her 500 µL örneğin DNA'sını geri kazanın. Bir kaya quick spin kolonundaki silika membran ile DNA absorbsiyonunu optimize etmek için 600 µL qg tamponu ekleyerek başlayın ve ardından kolonu doldurmadan önce 200 µL isopropanol ekleyin. Herhangi bir SDS çökeleğinin mevcut olup olmadığını belirlemek için karışımı kontrol edin.

SDS çökelmesi meydana gelmişse, örnekler çökelek kaybolana kadar 42 °C'lik bir su banyosunda ısıtılmalıdır. Ardından örnekler kolonlara uygulanmalı ve DNA, üretici talimatlarına göre elüe edilmelidir. SDS, PCRT polimeraz aktivitesini etkileyebileceğinden, PCR gerçekleştirilmeden önce tamamen uzaklaştırılmalıdır.

Kalıntı SDS'yi çöktürmek için her bir DNA örneğini buz üzerinde inkübe edin ve 4 °C'de bir dakika boyunca 14,000 G'de santrifüjleyin. SANE'yi yeni eppendorf tüplerine aktarın. DNA EIT'leri, geleneksel PCR veya her bir analiz edilecek diziye özgü primerler ile kantitatif gerçek zamanlı PCR veya QPCR kullanılarak tespit edilebilir. Bir PCR veya QPCR reaksiyonu için, toplam DNA IIT'den 5 ila 10 µL kullanın; PCR ve QPCR koşulları değişkenlik gösterecektir.

Bununla birlikte, başlangıç materyalinin sınırlı miktarı, geleneksel PCR tespiti için ek PCR döngüleri gerektirir; 40 döngü ile başlayın ve gerektiği şekilde ayarlayın. Bu protokol kullanılarak, hem E 8.5 hem de E 9.5 embriyolarından çipler gerçekleştirilmiştir. Çip ile saflaştırılan DNA'lar, geleneksel PCR ve kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz edilmiştir.

Sonuçlar, miyojenik ve düzenleyici faktörün E 8.5 ve E 9.5 embriyolarındaki miyojenik ve promotör üzerinde mevcut olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, miyojenikle ifadenin gerçekleşmediği meşe kesesinde, miyojenik ve miyojenik promotöre bağlanmaya dair herhangi bir belirti saptanmamıştır. Miyojenik bağlanma bölgesine uygun diziler içeren interferon gamma promotörü, beklendiği üzere negatif dizi kontrolü olarak kullanılmıştır. Test edilen doku örneklerinin hiçbirinde miyojenik, interferon gamma promotörüne bağlanmamıştır.

Sonuçlar, myo Genin bu evrelerde somitlerde spesifik olarak ekspresyon gösterdiğinden, Myogenic'in E 8.5 ve E 9.5 embriyolarının somitlerindeki Myogenic promotörüne bağlandığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, gelişmekte olan dokularda dokuya özgü genlerde bulunan düzenleyici faktörleri belirleyecek olan kromatin çöktürme analizleri için EA 0.5 fare embriyolarının nasıl izole edileceği ve hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.