Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, retinal ugal projeksiyonların gelişimini incelemek için doğum sonrası farelerde in vivo elektroporasyon kullanarak tek veya küçük retinal ganglion hücresi gruplarını transfekte etmektir. Bu, göz küresinin cerrahi olarak açığa çıkarılması ve küçük bir hacim plazma DNA çözeltisinin doğrudan retinaya enjekte edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, elektrotlar doğrudan enjeksiyon bölgesinin üzerinden göz küresine yerleştirilir ve plazma DNA'sının retinal nöronlara aktarılmasına izin veren elektrik darbeleri uygulanır.

Daha sonra, istenen yaşta, transfekte retinal ganglion hücrelerini görselleştirmek için elektroporasyonlu retinalar ve beyinler toplanır ve bunların CNS'ye projeksiyonları, çeşitli subkortikal hedef yapılarında etiketli retinal ganglion hücrelerinin hem dendritlerinin hem de aksonal ARB'lerinin floresan etiketlemesini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin in-utero retinal elektroporasyon gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu tekniğin daha az invaziv olması ve optik kiazmada geçme gibi erken akson kılavuzlama olaylarına müdahale etmemesidir. Ayrıca, doğum sonrası farelerde küçük bir popülasyonu veya tek retinal ganglion hücrelerini hassas uzamsal ve zamansal kontrol ile etiketlememize izin verir.

Elektroporasyon için elektrotlar yapmak için, bir çift dumont numaralı beş forsepsten bir uç koparın ve ardından her bir ucun tabanına bir tel lehimleyin. Tabanı yalıtımlı, bantlı tellere sarın ve yay hareketi sağlamak için tırnaklar arasına plastik bir ara parça yerleştirin. Elektrotlar bir araya getirildikten sonra, kabloyu bir çataldan gelen ve elektrik stimülatörüne seri olarak bağlanan ayak pedalına bağlayın.

Ayak pedalına basıldığında, akım elektrotlardan geçer. Ardından, diğer uçtan gelen kabloyu elektrik stimülatörüne bağlayın. Ve son olarak, elektrik stimülatörünü osiloskopa ve ses monitörüne bağlayın.

Enjektör sistemini, bir pipet çektirme kullanarak tezgahtaki üç eksenli bir mikro manipülatöre monte edin. Nano Inject two ile birlikte verilen bir iğneyi kullanarak uzun bir konik ve küçük bir ucu olan çekilmiş cam pipetler yapın. Çekilmiş bir pipeti mineral yağ ile doldurun ve mikro enjektöre sabitleyin.

Keskin mikrodiseksiyon makası kullanarak. İki ila üç mikrometrelik bir açıklık oluşturmak için monte edilen pipetin ucunu kesin. Pipeti açık uçtan yukarı çekerek enjeksiyon solüsyonu ile doldurun.

Anestezi yapan fare, hipotermi ile doğumdan dört ila beş gün sonra H'de ortaya çıkar. Ve bir ayak parmağı tutamını kullanarak anestezi durumunu onaylayın. Anestezi uygulanmış fareyi bir diseksiyon dürbünü altına yerleştirin ve mikrodiseksiyon makası ile gelecekteki göz kapağı Açıklığının uzunluğu boyunca keserek göz kapağını cerrahi olarak açın, bir çift forseps ile göz yuvasının etrafına hafifçe baskı uygulayarak göz küresini dışarı çıkarın.

Mikro manipülatörü ayarlayarak pipeti göz küresinin yakınına yerleştirin. Pipet ucunun tek elinizle tıkanmadığından emin olmak için mikroenjeksiyon sisteminin ayak pedalına basın. Çıkıntılı göz küresini, diğer elinizle forseps ile göz yuvasının etrafındaki cildi sıkıştırarak sabitleyin.

Mikro manipülatörü, pipet retina pigmentini, epitelini delecek ve retinaya girecek şekilde hareket ettirin. Ayak pedalına basarak istenen miktarda çözelti dağıtın, pipeti geri çekin ve elektrot uçlarını doğrudan enjeksiyon bölgesinin üzerine yerleştirin. Göz küresinin her iki tarafında, sadece yüzeye temas ederek, devreyi tamamlamak ve göz küresini elektro geçit töreni yapmak için stimülatöre bağlı ayak pedalına basın.

Göz küresini nazikçe yuvasına geri itin ve kesiğin üzerine oftalmik merhem sürün. Fareleri, bilinçlerini geri kazanana kadar 36 santigrat derecede tutulan bir ısıtma yastığına yerleştirin ve onları sadece RG CS transfekte edilmiş annelerine geri koyun. Hem plazmid hem de Cree Rekombinaz kodlaması ile EGFP ve flok durdurucu EGFP eksprese edebilmektedir.

EGFP tek hücreli etiketleme, EGFP etiketli tek retinal ganglion kullanılan nispeten düşük Cree plazmid konsantrasyonu sayesinde elde edilir, hücre dendritleri ve aksonlar düz montajlı bir retinada görselleştirilebilir. Yıldız patlaması omikron hücreleri gibi diğer retina hücre tipleri de bu teknikle etiketlenebilir. Burada, doğum sonrası 14. günde düz montajlı bir retinada RG CS ve omikron hücreleri dahil olmak üzere EGFP etiketli retinal nöronların bir örneğini görüyoruz.

Bu tekniği kullanarak, RG CS'nin retina konu hedeflemesini, aynı faredeki dört ana retina koordinatının tümünden bütün bir üst kolusta analiz edebiliriz. Bu teknik, uygun şekilde yapılırsa dört ila beş dakika içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, plazma DNA gibi solüsyonların doğum sonrası retinaya fokal enjeksiyonlarının nasıl yapılacağını ve elektroporasyon kullanılarak retina nöronlarının in vivo transfeksiyonunun nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.