Atılan İnsan Fetal Kortikal Doku Sinir Kök Hücre Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, atık frontal korteks dokusundan insan nöral kök hücrelerini izole etmektir. Bu işlem, öncelikle insan fetal beyinleri diseke etmeden önce solüsyonların ve malzemelerin önceden hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Bunu, izole edilen nöral kök hücrelerin daha ileri genişletilmesi, karakterizasyonu ve deneylerini içeren kültürü takip eder.

Uzun süreli saklama ve progenitorlerin nöronal ve glial hücre tiplerine farklılaşması için subkültürlerin oluşturulması mümkündür. Nihayetinde, normal MSS'den elde edilen hücrelerin farklılaşması karakterize edilebilir ve bilinen nörolojik bozukluklara sahip MSS'den türetilen hücrelerin farklılaşmasıyla karşılaştırılabilir. Bu tekniğin doğurduğu sonuçlar, herhangi bir insan MSS bozukluğunun tedavisi veya teşhisine kadar uzanmaktadır.

Bu teknik, patolojik S'yi değerlendirmek ve belirli bir bozukluk için yeni ilaçların farmakolojik etkinliğini ölçmek amacıyla basit ve güvenilir bir platform sunar. Multipotent hücrelerin sahip olduğu istisnai değer nedeniyle, protokole başlamadan önce tüm malzemelerin hazır olması gerekir. Numunelerin bozulma riskini en aza indirmek için; soğutmalı diseksiyon, 37 °C'ye ısıtılmış kültür ortamı banyosu, kültür ortamı ve uzun süreli saklama için soğutmalı hücre dondurma ortamı hazırlanmıştır.

Diseksiyon için kriyokoruma işlemini gerçekleştirin; hücre disosiasyonu için steril otoklavlanmış pensleri ve saplı bistüri uçlarını hazır bulundurun. Bir pipet tabancası, 10 mililitre transfer pipetleri ve 40 mikromolar hücre süzgeci hazırlayın. Diseksiyon için birkaç adet 10 santimetre kültür kabı ayırın.

Dissosiyasyon için 50 milliliter santrifüj tüpleri. Doku saklama için 1.5 milliliter santrifüj tüpleri ve hücreleri dondurmak için dondurucu viyaller. Başarıyı sağlamak için, 18 ile 22 haftalık canlı dokunun, erişilebilir olduktan sonra iki saat içinde hasat edilmesi gerekir.

İdeal olarak, elektif prosedürler sonrası toplama düzenlemeleri yapılarak, fetal doku mevcut olduktan sonraki dakikalar içinde temin edilebilir. Dokular genellikle fragmante durumdadır, ancak beynin önemli bir kısmı sağlam kalır. Beyni, buz gibi soğuk diseksiyon ortamı ile doldurulmuş 10 mililitrelik bir Petri kabına toplayın.

Korteksin farklı bölgelerini anatomik işaretler yardımıyla belirleyin. Frontal ve parietal oksipital kortekslerin sınırları, merkezi sulkus ile syl fissürünün ekstrapole edilen kesişim noktasına göre yönlendirilir. Merkezi sulkusun önündeki frontal korteksten ve sylvan fissür sınır boyunca cerrahi bıçaklar kullanarak doku diseksiyonu yapın.

Ventrikülün sağlam ve hasarsız kaldığından emin olun. Şimdi, ayrılan frontal korteks bloğundan kalan kanı ve meningesleri temizleyin. Eğer örnek çok parçalanmamışsa ve yeterince büyükse, bir kısmını histoloji ile protein veya mRNA analizleri için ayırmak amacıyla bloğu birkaç daha küçük örneğe bölün.

Şimdi bir beyin bloğunu 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve doku hacminin üç katı kadar buz gibi soğuk diseksiyon ortamı ekleyin. Bir pipet kullanarak, tüm dokular parçalanana kadar dokuyu nazikçe ayrıştırın. Hücreleri tamamen süspansiyona getirmek için, onları 40 mikromolar hücre süzgecinden geçirin.

Şimdi hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve hücre peletini 10 mililitre taze, ılık kültür ortamında yeniden süspande edin. Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve 2 milyon hücre için gerekli hacmi hesaplayın. Şimdi, 2 milyon hücre içeren her bir hacmi 25 santimetrekarelik bir kültür flaskına aktarın.

Beş mililitre ılık kültür ortamı ile hazırlanır. Hücreleri bir hafta boyunca 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit ortamında tutun. Daha uzun süreli kültürler için haftada bir kez ortamın yarısını değiştirin. Kültürde bir ila iki hafta geçtikten sonra, genellikle NSC çapı 200 ile 400 mikron arasında olan nörosferler oluşur.

Nörosferlerin tekil hücrelere ayrıştırılması için; hücreleri Hank's medium içerisindeki EDTA ile 15 dakika boyunca inkübe edin. Süspansiyondaki hücreleri alt kültüre hazırlamak için, hücreleri santrifüjleyin, hanks ile yıkayın ve hücreleri ılık kültür ortamına aktarın.

Diferansiyasyonu başlatmak için, disosiye edilmiş hücreleri poli-D-lisin ve laminin 1 kaplı lamel üzerine, lamel başına 100.000 hücre yoğunluğunda ekin ve 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücreler kolaylıkla oligodendrositlere, nöronlara veya astrositlere diferansiye edilebilir.

Nöronal farklılaşma için hücreleri yedi gün boyunca B 27 içeren ortamda tutun. Astrosit farklılaşma kültürü için hücreleri yedi gün boyunca FBS içeren ortamda tutun. Oligodendrosit farklılaşması için hücreleri iki gün boyunca büyüme faktörleri içeren modifiye ortamda tutun ve iki günün ardından, kök hücreleri muhafaza etmek için aynı modifiye ortamı büyüme faktörleri olmaksızın beş gün daha kullanın.

Disosiye edilmiş hücre süspansiyonları santrifüj edildikten sonra, hücreleri her tüp için 10 milyon hücre konsantrasyonunda dondurma ortamında yeniden süspanse edin. Mililitre başına, hücreleri uzun süreli saklama için -80 °C'de dondurmadan önce -20 °C'de yavaşça dondurun. Ardından sıvı azota aktarın.

Daha sonra hücreler, 37 °C su banyosunda hızlıca çözdürülür ve yeniden süspande edilir. Yıkama işlemi için %10 serum içeren ısıtılmış D-M-E-M-F 12 kullanılır. Isıtılmış hücreler ardından santrifüj edilir, aspire edilir ve ısıtılmış kültür ortamında yeniden süspande edilir.

Normal bir fetüsten alınan orta beyin nöral kök hücreleri, 18 haftalık gestasyonel yaşta nörosferler oluşturacak şekilde kültüre edilmiş ve GFP ile transfekte edilmiştir. Nörosferler, ardından hücre belirteçleri ve rumine ile fikse edilip boyanan çeşitli hücre tiplerini oluşturmak için diferansiye edilmiştir.

Nöronlar, astrositler ve oligodendrositlerin göstergesi olan belirteçlerin ekspresyonu ile çok potansiyellilik gözlemlenir. Bu videoyu izledikten sonra, atık frontal kortikal dokudan insan nöro kök hücrelerinin nasıl izole edileceği, genişletileceği ve manipüle edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu bölgeler, insan kortikal ortam hastalık mekanizmalarını incelemek ve farmakoterapötik ajanların potansiyel etkinliğini test etmek için benzersiz bir fırsat sunar.