Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, grip çipi, düşük yoğunluklu mikroarray platformu üzerinde grip viral alt tiplerini tespit etmek ve karakterize etmek için yeni ve hızlı bir sinyal amplifikasyon yöntemi kullanmaktır. Bu, biyotinile DTP'lerin dahil edilmesi ve matris gen segmentini ve influenza RNA ekstraktlarından yapısal olmayan bir gen segmentini amplifiye etmek için beş asal fosfol uçlu primerler kullanılarak elde edilir. PCR'yi, kısa tek sarmallı biyotinillenmiş ve amplifiye edilmiş viral ürün oluşturmak için enzimatik sindirim ve parçalanma takip eder, bu daha sonra hibridizasyondan sonra diziye hibritlenir.

Fox tespiti, hibridizasyonun meydana geldiği büyük polimer lekelerini büyütmek için foto polimerizasyonu kullanır ve influenza viral alt tiplerini tespit etmek için diferansiyel hibridizasyon modelleri kullanılır. Bu tekniğin standart floresan algılama gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, oldukça ucuz olması ve floresansa benzer analitik hassasiyetle çıplak gözle görülebilen hızlı bir sonuç sağlamasıdır. Bu yöntem, evrensel bir tespit yöntemi olduğu için grip çipini kullanarak grip virüslerinin karakterizasyonu hakkında fikir verebilir.

Ampl Fox, diğer DNA ve protein bazlı düşük yoğunluklu mikrodiziler gibi çok çeşitli diğer sistemlere de uygulanabilir. Teorik olarak, herhangi bir biyotinile edilmiş ürün, amox kullanılarak tespit edilebilmelidir. Prosedürü göstermek, her ikisi de son birkaç yıldır Fox cihazının ve algılama kimyasının geliştirilmesinde merkezi olan Endeavor'da bir araştırma görevlisi olan Amber Taylor ve Endeavour'da bir araştırma görevlisi olan Kevin Moulton olacak.

Bir viral RNA ekstraksiyon kiti ve üreticinin protokolünü kullanarak 200 mikrolitre viral izolattan viral RNA'yı çıkarın. 60 mikrolitre nihai hacmi elute edin ve ekstraktları daha sonra kullanmak üzere eksi 70 santigrat derece veya daha düşük bir sıcaklıkta saklayın. Ardından R-T-P-C-R ana karışımını üreticinin protokolüne göre ICE üzerinde hazırlayın.

Bir BİYOTİNİLLENMİŞ DNTP karışımı kullanarak, ana karışıma gösterilen konsantrasyonları içeren grip cipsi astar karışımını ekleyin. Her setten bir primer, enzimatik sindirimi kolaylaştırmak için beş ana foshol grubu içermelidir. Grip a primer seti 1032 baz çifti ürünü üretir ve grip B primer seti 811 baz çifti ürünü üretir.

18 mikrolitre ana karışımı kısaca girdaplayın ve ince duvarlı PCR tüplerine dağıtın. Daha sonra her reaksiyon tüpüne iki mikrolitre RNA şablonu ekleyin. PCR tüplerini bir termal döngüleyiciye aktarın ve uygun bir diz çökme sıcaklığına sahip bir döngü profili kullanın.

Bu tahlilde kullanılan döngü profili burada gösterilmiştir. PCR reaksiyonu başına 2.2 mikrolitre enzim reaksiyon tamponu, 0.8 mikrolitre nükleaz içermeyen su ve 1.0 mikrolitre lambda eksonükleaz enzimini birleştirerek enzimatik sindirim karışımını hazırlayın. Numuneleri termal döngüleyiciden çıkarın ve her bir PCR tüpüne dört mikrolitre ekleyin.

Numuneleri termal döngüleyiciye geri koyun ve termal döngüleyiciyi gösterildiği gibi 37 dakika boyunca 15 santigrat dereceye, ardından 95 dakika boyunca 10 santigrat dereceye programlayın. Ardından, hibridize edilecek mikrodizilerin etrafına tek kullanımlık hibridizasyon kuyuları uygulayın. Daha sonra slaytları 110 mililitre arıtılmış suda orbital bir çalkalayıcı üzerinde beş dakika yıkayın.

Bir mendil mendiline hafifçe dokunarak slaytları kurulayın, kuyunun kenarına silin. 22 mikrolitre iki x hibridizasyon tamponunu, parçalanmış tek sarmallı DNA ürünlerinin her biri ile kısaca karıştırın ve 40 mikrolitreyi mikrodizi kuyucuklarına pipetleyin. Hibridizasyondan sonra slaytların bir nem odasında bir saat boyunca hibritleşmesine izin verin, slaytları nem odasından çıkarın ve her slaytı iki mililitre yıkama tamponu ile kısa bir süre durulayın D. Slaytları bir sürgülü rafa yerleştirin.

Daha sonra, bir orbital çalkalayıcı kullanarak kapları ayırmak için 110 mililitre yıkama tamponu A ve B ekleyin. Sürgülü rafı tampon A'da 60 ila 90 RPM'de, sonraki tüm yıkamalar için kullanılan hızı bir dakika boyunca yıkayın. Ardından sürgülü rafı yıkama tamponu A'dan çıkarın ve yıkama tamponu D ile kısa bir süre durulayın.Kayar rafı yıkama tamponu B'ye aktarın ve orbital çalkalayıcı üzerinde beş dakika yıkayın.

Yıkadıktan sonra, her slayttaki dizileri bir mendil mendiliyle nazikçe kurulayın ve kurumuş slaytları nem odasına yerleştirin. Tilki rengi metrik algılama adımlarına hazırlık olarak, işlenecek her dizi için 10 mikrolitre genlik, 20 mikrolitre iki x genlik tamponu ve 10 mikrolitre arıtılmış suyu birleştirin, her diziye 40 mikrolitre etiket karışımı aktarın ve etiketleme reaksiyonunun kapalı bir nem odasında ilerlemesine izin verin Beş dakika boyunca Hibridizasyon sırasında, bir kapta 110 mililitre yıkama tamponu C hazırlayın. Etiketlemeden sonra, her bir diziyi hemen yıkama tamponu D ile durulayın. Her bir sürgüyü sürgülü rafa yerleştirin ve tampon C'yi tampon deniz yıkamasından sonra beş dakika boyunca orbital çalkalayıcı üzerinde yıkayın ve yıkayın, sürgülü rafı bir saflık kabına üç kez kısa bir süre daldırın.

Tuz kalıntılarını gidermek için, dizileri daha önce gösterildiği gibi kurutun. Dizileri, 24 saat içinde tamamlanması gereken fotoğraf aktivasyonu ve görüntülemeye kadar karanlık bir slayt kutusunda saklayın. Ardından, Amli Fox okuyucuyu açın ve dizi örneği algılamadan önce Amli view yazılımının fotoğraf aktivasyonu için hazır olduğundan emin olun.

İlk olarak, kısa bir kalibrasyon prosedürünü izleyerek tüm numuneler için en uygun fotoğraf aktivasyon süresini belirleyin. Günlük kullanımda bir kez, daha sonra Amplify çözeltisini oda sıcaklığına ısıtın ve pipetlemek, üç mikrolitre amplify arttırıcıyı amplify flakonuna karıştırmak ve iyice girdaplamak için kısa bir süre girdaplayın. 10 saniye boyunca, 40 mikrolitre Amplify solüsyonunu bir seferde yalnızca bir slayta eşit şekilde uygulayın ve kabarcık olmadığından emin olun.

Mikrodizi slaytını Amplify Reader'ın fotoğraf etkinleştirme yuvasına yerleştirin. seçerek fotoğraf aktivasyonunu başlatın, kalibrasyon işleminde belirlenen fotoğraf aktivasyon süresini kullanarak PL view yazılımında başlatın. Tamamlandıktan sonra, fazla amplifiye etmek için mikrodiziyi iki mililitre arıtılmış su ile durulayın, berrak polimer oluşumu şimdi hedef DNA içeren noktalarda meydana gelmiştir, ancak daha iyi görselleştirilmiştir.

Boyamadan sonra, polimer lekelerinin iki dakika kurumasını bekleyin. Daha sonra diziye iki damla bol miktarda kırmızı damlatın ve boyamanın iki dakika devam etmesine izin verin Boyamadan sonra, slaytı arıtılmış suyla hızlı bir şekilde durulayın ve daha önce gösterildiği gibi kurulayın, sonuçları işlemek için amli yazılımını kullanarak bir görüntü toplamak için slaytı Amli Fox okuyucunun görüntüleme bölmesine yerleştirin. Soldaki resim, Amli Fox tarafından 2009 yılında yayınlanan H one N one example adlı romanın tespitini göstermektedir.

Sağdaki görüntü, bir konfokal floresan mikrodizi tarayıcı tarafından oluşturulan geleneksel floresan kullanırken, aynı genel algılama modeli her iki yöntem için de kolayca görülebilir. Bununla birlikte, Amli tilki sonucu çıplak gözle görülebilir. Bu görüntüler, insan kökenli, H üç N iki insan kökenli, H bir N bir, domuz kökenli, H bir N bir ve saptanabilir influenza eksikliği olan negatif bir tilki dizisinden grip çipi sonuçlarını göstermektedir.

Mavi ile özetlenen ikinci ve üçüncü diziler, tüm influenza için sinyal üretir. A alt tipleri gösterilmiştir, ancak sağ altta kırmızı ile özetlenen diziler yalnızca domuz kökeni için sinyal üretir, H bir N bir örnek. Negatif numune, yeşil renkle özetlenen bir dahili kontrol dizisi üzerinde sinyal gösterir, bu da R-T-P-C-R reaksiyonunun herhangi bir inhibisyonunu veya başarısızlığını gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, flakon ekstraksiyonundan amox tespitine ve nihai sonuç yorumlamasına kadar tüm süreç yaklaşık altı saat içinde gerçekleştirilebilir. Cihaz kalibrasyonu da dahil olmak üzere prosedürün Ampl Fox algılama kısmı, bu prosedürü takiben yaklaşık 30 dakika içinde tamamlanabilir. Ek soruları cevaplamak için kısmi veya tam genom dizilimi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu influenza testi, özellikle benzersiz bir hibridizasyon modeli ile sonuçlanan numuneler için bir başlangıç taraması olarak tasarlanmıştır. Algılama genel bir tahlil olduğundan, araştırmacıların algılamanın değer katabileceği yeni ve ilginç düşük yoğunluklu mikrodizi uygulamaları bulacaklarını umuyoruz.