Name: Bakteriyel Patojen İnsan Hücreleri Invasion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Keşfedin, Staphylococcus aureus'un insan endotelyal hücrelerini istila etme yeteneğini ölçmek için bu protokolü. Bu yöntem, bakteriyel invazyon mekanizmalarını anlamak ve potansiyel tedavi hedeflerini belirlemek için araştırmacılara yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Wellcome Trust (WT 0.795.880) tarafından finanse edildi.

Aşağıdaki protokol S. endotel hücre işgali çalışma açıklayacağız aureus ama teorik olarak herhangi bir kültürlenebilen bakteri tarafından hücresel işgali incelemek için de kullanılabilir. S. için özel Aşamaları aureus ve endotel hücreleri gösterilir. 1. Bakterilerin hazırlanması <ol><li> Kültür S. 4-16 saat 37 10 ml Beyin-Kalp İnfüzyon (BHI) suyu (gerekir büyüme aşamasında bağlı olarak) ° C 200 rpm'de sallayarak ile hava aureus suşlarının. Bu büyüme koşulları S. için özel aureus ve diğer bakteriler için adapte edilmesi gerekebilir. </li><li> Oda sıcaklığında (5.000 x g, 10 dakika), DMEM, bir eşdeğer hacmi bakteriyel pelet kültür süpernatant ve tabanda kaybolmasına santrifüj, alternatif tur; bakteri Dulbecco'nun Modifiye Kartal Kullanıcı orta üç kez (Invitrogen DMEM) yıkayın. Bakterilerin gerektiği gibi ayarlanabilir süspansiyon optik yoğunluk ölçülür. S için aureus, ~ 10 9 kob ml -1 karşılık gelen OD 600 = 1, bir süspansiyon hazırlamak. </li></ol> 2. Endotel hücre kültürü <ol><li> 37 ° ve L-glutamin (2 mM) ° C,% 5 CO 2; Kültür DMEM endotel hücre hattı EA.hy926 1 fetal sığır serumu (% 10 FBS) ile desteklenmiştir. Alternatif olarak, havuzlu birincil insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVECs) Lonza (Basel, İsviçre) satın alınmış ve 37% 2 FBS, sığır beyin ekstraktı (heparin dahil), insan endotelyal büyüme faktörü ve hidrokortizon ile desteklenmiş endotel bazal orta kültürlü olabilir ° C,% 5 CO 2, üreticinin talimatlarına (Lonza) göre . Bu büyüme koşulları, bu hücreler için spesifik ve diğer ev sahibi hücre türleri için adapte edilmesi gerekebilir. </li><li> T75 şişeler endotel hücreleri, göz tarafından doğrulanmadı confluency tamamlamak büyütün. </li><li> Lamelleri yerleştirilmesi için 24-iyi bir tabak hazırlayın. Güzel forseps (alev steril) bir opak ve parlak bir yüzeye sahip lamelleri taşımak için ihtiyaç vardır. Lamelleri, hücre tutunmasını sağlar yukarı bakacak şekilde opak yüzeyi ile 24 plaka kuyular yerleştirin. </li><li> 3 ml tripsin-EDTA (% 0.25) ile T75 balon hücreleri özgürleştirmek ve ilgili kültür ortamı 10 ml ekleyin. </li><li> Manox cam lamelleri içeren 24 kuyucuğu yeniden süspanse hücreleri 500 ul ekleyin. Bir T75 konfluent balon hücre yaklaşık 5 × ortalama 10 5 hücreleri (500 inoküle), iki adet 24-kuyucuğu için yeterli hücreleri sağladı . </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi 48 saat süreyle inkübe plakaları, ve ters ışık mikroskobu ile confluency% 100 hücre doğrulamak. </li><li> Dip-yıkama PBS içinde lamelleri ve her biri de% 10 FBS içeren 490 ul DMEM içeren yeni 24 kuyucuğu eklemek. </li><li> Hücre işgali belirli metabolik süreçlerin rolünü incelemek için inhibitörleri saat önce tahlil sırasında tutulan bakteri ve konsantrasyonlarının yanı sıra kültür hücreleri 1 eklenebilir. Örneğin, S. aktin düzenlenmesi rolünü belirlemek için endotel hücreleri aureus işgali, 50 mcM cytochalasin D eklenebilir; veya caveolae, 5 rolü için mM metil-β-siklodekstrin eklenebilir. </li></ol> 3. Invasion Testi <ol><li> Her biri% 10 FBS içeren 490 ul DMEM konfluent tabaka endotel hücreleri ile yıkanmış lamel içeren yıkanmış bakterilerin 10 ul (yaklaşık 2 × 10 7 kob ml -1 S. aureus) ekleyin . </li><li> 15-90 dakika boyunca 37 ° ° C'de% 5 CO 2. </li><li> Lamelleri bakteri hücreleri (yapışık ve içselleştirilmiş) ile ilgili toplam sayısı ölçmek için, PBS içinde üç kez dip yıkayın ve PBS içinde 500 ul% 0.5 Triton X-100 içeren taze kuyu eklemek. Hücrelerin tam olarak içselleştirilmiş tüm bakteri lyse ve serbest sağlamak için, doğrudan lamel yüzeyinde pipet ucu işaret ederek, birkaç kez pipetle. </li><li> TSA plakaların yüzeyine sıvı süspansiyon (veya bu gerekli dilüsyonları) kaplama ile bakteri numaralandırılamıyor. TX-100 birçok Gram-negatif bakteriler lyse beri, saponin yerine 2 kullanılabilir. </li><li> Içselleştirilmiş bakteri sayısını ölçmek için, her bir kuyunun içeren bağlanmamış bakteri kültürü süpernatant kaldırmak ve 200 mg ml -1 gentamisin ile desteklenen 500% ul DMEM/10 FBS ile değiştirin. Biz rutin olarak daha ucuz olduğu gibi burada oldukça lysostaphin daha gentamisin kullanımı ve bize deneysel protokol değiştirmek zorunda kalmadan, farklı bakteri türleri (örneğin Stafilokok ve Lactococci) kullanarak deneyler arasında geçiş yapmanıza olanak tanır. </li><li> 37 ° plakaları inkübe ° C ekstrasellüler bütün bakterileri öldürmek için 60 dakika süreyle% 5 CO 2. </li><li> Lamelleri PBS içinde 3 kere yıkayınTSA üzerine kaplama lyse ve numaralandırmak yapışma testi için yukarıda anlatılan. </li><li> Bazı durumlarda, görsel ışık mikroskobu kullanılarak bakterilerin sayısını saymak için tercih edilebilir. Bu durumda, özel S. aureus hücre işgali, fiziksel ekstraselüler bakterileri yok etmek için lysostaphin yerine gentamisin (10 mg ml -1) kullanmak. </li><li> 37 20dk için lamelleri inkübe ° C CO 2 lysostaphin çözüm, sonra durulayın ve Cytopath (Cellpath) ile düzeltmek. </li><li> 5min lamelleri kristal viyole (% 0.5 w / v) ile boyayın. </li><li> Su, hava-kuru Dip-durulayın ve cam slayt üzerine monte. Konfluent endotel hücreleri mm 2 başına bakteri sayısı, ışık mikroskobu kullanılarak belirlenebilir . </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: S. yüzey fibronektin bağlayıcı proteinlerin Anlatım (FnBPA ve FnBPB) aureus endotel hücreleri istila yeteneği bahşeder. Son çalışmalar, FnBPA 3 fibronektin bağlayıcı bir etki ortaya koymuştur. Wild-tip (WT), S. aureus 8325,4 yüksek verimlilik ile endotel hücreleri işgal FnBPA ve B (Δ FNB) olmayan bir yük önemli ölçüde azaltılmış internalizasyonunda düzeyleri (Şekil 1A) gösterdi iken. Plazmid bir kodlama FNB mutant tamamlama bir eksi fibronektin bağlayıcı etki alanı (pFnR0) (Şekil 1A) işgali teşvik etmedi . Buna karşılık, mutant bir plazmid kodlama tüm FNB WT düzeyleri (Şekil 1A) işgali restore geni (pFnBA4) ile tamamlama. Endotel hücre işgali FnBPA rolü de heterolog ifade host Lactococcus lactis kullanarak ortaya konabilir. L. plazmid kodlanmış FnBPA Açıklanması lactis (pRM9 9) anlamlı hiçbir FnBPA (KVK) (açık barlar, Şekil 1B) ifade bakterilere göre endotel hücrelerine yapışma geliştirmek vermedi. Buna karşılık, L. FnBPA-ifade lactis olmayan ifade suşu (kapalı bar, Şekil 1B) göre anlamlı derecede yüksek düzeyde endotel hücreleri istila etti. Deneyler, iki nüsha halinde dört kez ve ortalama ± standart sapma sunulmaktadır yapıldı. * WT veya CTL değerleri (p &lt;0.05) istatistiksel olarak anlamlı derecede farklı verileri temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, EA Invasion . S. Hy926 endotel hücreleri aureus (A) veya L. lactis (B).

<ol><li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).</li>
<li>Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+variation+of+the+opacity+outer+membrane+protein+controls+invasion+by+Neisseria+gonorrhoeae+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells.</a> EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).</li>
<li>Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+attach+to+human+fibronectin+through+a+tandem+beta-zipper%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper.</a> Nature. 423, 177-181 (2003).</li>
<li>Magoffin, R. L., Spink, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protection+of+intracellular+Brucella+against+streptomycin+alone+and+in+combination+with+other+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics.</a> J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).</li>
<li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+intraleukocytic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Interaction of intraleukocytic bacteria.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).</li>
<li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22+Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).</li>
<li>De Melo, M. A., Pechere, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mucin+on+Campylobacter+jejuni+association+and+invasion+on+HEp-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells.</a> Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).</li>
<li>Shaw, J. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+invasion+of+human+tissue+culture+cells+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).</li>
<li>Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Host+Cell+Invasion+and+Virulence+in+Sepsis+is+Facilitated+by+the+Multiple+Repeats+within+FnBPA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).</li>
<li>Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+invasion+of+a+human+oral+cell+line+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans.</a> Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).</li>
<li>Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusobacterium+nucleatum+transports+noninvasive+Streptococcus+cristatus+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).</li>
<li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun.%22%5BJournal%5D)">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).</li>
<li>Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+fibronectin+binding+protein-A+induces+motile+attachment+sites+and+complex+actin+remodeling+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).</li>
<li>Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li>
<li>Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pyogenes+serotype+M1+encodes+multiple+pathways+for+entry+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li>
<li>Eiff, C. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+small+colony+variants%3A+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li>
<li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li>
<li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li>
</ol>

<html> Tarif tahlil ana hücreleri bakteriler tarafından işgali incelemek için yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır gentamisin koruma testi dayanmaktadır. Gentamisin ve diğer hücre içi bakteri öldürmek için antibiyotik edememe Gözlemler bakteri 4-8 ev sahibi hücrelerin işgali erken çalışmalarında kullanılmıştır. 24, 48 hatta 96-kuyucuğu kullanılması büyük miktarda zaman ve nispeten düşük maliyetle kısa bir süre içinde nicel ve tekrarlanabilir veri üretimi sağlar. Hiç uzman ekipman gerektirir, çeşitli bakteri ve hücreleri ile çalışmak için uygun olabilir, ve işgali 9 hem bakteri ve konak hücre süreçlerinin rolünü araştırmak için kullanılabilir çünkü tahlil de çekici. Gerçekten de, ilk deneylerde bu yana, gentamisin koruma testinin yaygın konak hücre işgali ölçmek için bir dizi farklı bakteri veya bakteri 10,11 bile kombinasyonları istihdam edilmiştir. Temel ilkeler, yöntem aynı, çok ince varyasyonların olsa bildirilmiştir. Bu yazıda bizim sürümü açıklanan ve değişiklikler diğer bakteri veya konak hücreler için gerekli olabilir göstermiştir. Konak hücre işgali, dikkate alınması gereken önemli noktalar vardır bu yaklaşım kullanarak ölçmek için bir deney tasarımı: Gentamisine Bakteriyel hassasiyet. Bu apaçık ortada, ama çalışılan bakteri konsantrasyonu, sıcaklık ve süre boyunca kullanılmak üzere gentamisin duyarlı olmasını sağlamak için önemlidir. Duyarsızlık söz konusu olduğunda, diğer antibiyotiklere 5 kullanmak mümkün olabilir. Parçalayıcı enzimler (lysostaphin, mutanolysin, lizozim) 12 kullanmak için alternatif bir yaklaşım olabilir. Kuluçka ve inokulum ilk kez bu testte yaparken kullanılacak en uygun inkübasyon sürelerinde ve bakteriyel inokulum kurmak için önemlidir. Bu nedenle, ilk deneylerde, zaman içinde yapışma ve invazyon (6 saat 5 dakika) hem de incelemek gerekir. Bu işgali enfeksiyon çokluğu tarafından nasıl etkilendiğini değerlendirmek için de önemlidir (İçişleri Bakanlığı; hücre başına bakteri sayısı). Genel olarak bu kültür hücrelerinin hasarı azaltacaktır mümkün olan en az sayıda bakteri kullanmak en iyisidir. Uzun kuluçka dönemleri veya büyük inocula 9,13 kullanılması halinde suşlar arasında önemli farklılıklar kaçırmış olabilir. Hücresel hasar kullanmadan önce bakterileri yıkamak önemlidir. Ancak, hücresel hasar toksin üretimi ile sınırlı değildir. Bakteriyel işgali, apoptoz ve normal hücresel işlevlerin bozulması indüksiyon hücre hasarına neden olabilir. Bu içselleştirilmiş bakterileri öldürerek ve işgali 14 oluştu olduğu izlenimi veren, gentamisin hücre içine nüfuz etmesine yol açabilir. İnkübasyon koşulları, sıcaklık ve kültür ortamı bileşimi işgali üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir . Örneğin, HeLa hücrelerinde Streptococcus pyogenes tarafından işgali, genellikle serum 15 çözünür fibronektin, varlığı bağlıdır . Diğer bir önemli husus, kültür ortamında deney seyri sırasında bakteriyel büyüme. Kültür ve hücre içi bakteri ölçümü. TX-100 hücre içi bakterileri öldürmek olsa da, onların büyüme inhibe edebilir. Gibi, katı ortam üzerinde deterjan varlığında bakteriyel çoğaltma kontrol etmek için önemlidir. Etkilenen nerede, deterjan düşük konsantrasyonlarda kullanmak veya böyle bir saponin alternatif olarak kullanmak mümkün olabilir. Kristal viyole boyama ve mikroskopi tahlil üzerinden gentamisin koruma testinin bir yararı da, yoğun daha az emek olduğunu ve bu algılama ve içselleştirilmiş bakteriler alt popülasyonlarının farklılaşma sağlar. Örneğin, S. aureus (NCT) ya da normal bir koloni tipi veya bireysel bakteri hücrelerinin mikroskobu ile ayırt edilebilir olmayacaktır küçük koloni varyant (SCV) 16, üretebilir. 17 &#39;yaşayabilir ama olmayan kültürlenebilen&#39; devlet tespit edilecektir girmek hücre içi bakteri ve hücre topaklanma muhasebeleştirilir gentamisin koruma tahlil üzerinde kristal viyole boyama ve mikroskopi tahlil bir yararı olabilir. Bakteri istilası konak hücre süreçlerinin rolü incelenmesi. Birçok çalışma, aktin düzenlenmesi ile müdahale cytochalasin D, konak hücre fonksiyonu inhibitörleri istihdam var. Bu tür çalışmalar da antikorlar içerebilir hedef hücre yüzey reseptörleri ve belirli genlerin 18 siRNA demonte . Bu tedaviler kültür hücreleri canlılığını veya ek etkiler veya bakteriler üzerinde toksik etkilere sahip olduğunu sağlamak için hayati önem taşımaktadır. Gelecekteki yönelimler: Bu testte genellikle çok iyi hücre kültürü plakaları yapılır ontent &quot;&gt; Çünkü bu potansiyel hücre fonksiyonu inhibitörlerinin kütüphanelerin incelenmesi, enfeksiyonlar ya da ilgili olabilir, yüksek verimli bir tarama çalışma için uyarlamak için teorik olarak mümkün. hücre içi bakteri hedef için tasarlanmış antibiyotikler. Alternatif olarak, böyle bir yaklaşımın mutant kütüphaneler ekrana yapışma, işgal ya da hücre içi sağkalım ilgili genleri tanımlamak için kullanılan olabilir, bazı durumlarda model sistem kesme kuvvetleri (akış) de istenebilir Örneğin endotel modelleme zaman daha yakından in vivo ortamda taklit etmek için akış hücreleri ve mikroakışkan hücre kültürü sistemleri tasarımı ve üretimi, güncel gelişmeler, kesme kuvvetleri dahil konak-patojen modelleri gentamisin koruma tahlil istihdam imkanı da sağlar . Özetle, burada açıklanan protokol uzun yıllardır kullanılan benzer yaklaşımlar üzerine kuruludur. Bu yaygın kültür hücreleri ve bakteri türlerinin birçok türleri için geçerli olup, hızlı ve nispeten daha az maliyetle büyük miktarda veri oluşturabilir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>Beyin kalp infüzyonu</td><td>BioChemika</td><td>53286</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;tal sığır serumu</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC'ler</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2519</td><td></td></tr><tr><td>Endotelyal bazal besiyeri</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3121</td><td></td></tr><tr><td>Sığır beyin ekstresi (heparin dahil)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092</td><td></td></tr><tr><td>İnsan endotelyal büyüme faktörü</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4017C</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4035C</td><td></td></tr><tr><td>GA-1000</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092C</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Invitrogen</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Lizostafin</td><td>AMBI</td><td>LSPN-50</td><td></td></tr><tr><td>Thermanox lamel</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TKT-210-330P</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Sitopat</td><td>TCS Biosciences</td><td>HC8595</td><td></td></tr><tr><td>Kristal viyole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>T75 flasklar</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Sitoşalazin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2618</td><td></td></tr><tr><td>Metil-B-siklodextrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>332615</td><td></td></tr></tbody></table>

bakteriyel patojen İnsan hücreleri invasion

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

İşte biz insan endotel hücreleri istila bakteriyel patojen Staphylococcus aureus çalışmanın nasıl anlatacağız. Genel protokol, hemen hemen her kültürlenebilen bakterinin hücre işgali çalışma yapılabilir. Örneğin aktin düzenlenmesi veya caveolae rolü işgali belirli yönlerini ele olabilir hangi aşamaları, vurgulanır. Konak hücrelerine şişeler yetişen ve kullanıma hazır manox lamelleri içeren 24 kuyucuğu içine numaralı seribaşı. Lamelleri kullanarak, kuyulardan (S. aureus eklemek için) tarafı üzerine yatırılır serum proteinlerinin kuyulardan hücrelerinin sonraki kaldırma girişimi azaltılması sağlanır . Bakteriler gerekli yoğunluğu büyüdü ve herhangi bir salgılanan proteinler (örneğin toksinler) uzaklaştırmak için yıkanır. Endotel hücreleri konfluent katmanları ile lameller bakteri eklenmesi önce taze kültür ortamı içeren yeni 24-kuyucuğu aktarılır. Bakteri ve hücreler daha sonra 37 o zaman gerekli miktarı için% 5 CO 2 birlikte inkübe edilir ° C S için aureus bu genellikle 15-90 dakika arasında. Manox lamelleri her kuyudan çıkarılmış ve unattached bakterileri kaldırmak için PBS daldırma yıkanır. Toplam ilişkili bakteriler (yapışık ve içselleştirilmiş) sayısal edilecekse, lamelleri sonra PBS içinde X-100% 0.5 Triton içeren yeni bir kuyu yerleştirilir. Nazik pipetleme hücre parçalama tamamlamak ve bakteriler agara seri seyreltme ve kaplama tarafından numaralandırılan açar. Hücreleri istila bakteri sayısı gerekli ise, tüm dış bakterileri öldürecektir gentamisin ve inkübasyon ile desteklenen 500 ul doku kültür ortamı içeren kuyu 1 saat boyunca devam etti, lamelleri eklenir. Lameller sonra yıkanabilir, parçalanmış hücreler ve yukarıda açıklandığı gibi bakteriler agara kaplama ile numaralandırılan. Deney doğrudan görselleştirme gerektiriyorsa, lamelleri sabit ve lekeli, ışık, floresan veya konfokal mikroskobu veya elektron mikroskobu için hazırlanmış olabilir.

Odaklanan bir bakteriyel patojen tarafından işgalinin ana hücrelerinin çalışma için genel bir protokol,<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Ve insan endotel hücreleri.

Bakteriyel Patojen İnsan Hücreleri Invasion

Burada, bakteriyel patojen Staphylococcus aureus'un insan endotel hücrelerini istilasını nasıl incelediğimizi açıklayacağız. Genel protokol...

Bu deneyin genel amacı, bakteriyel suşların konak hücrelere invaze olma yeteneğini ölçmektir. Kültürdeki konak hücreler, 24 kuyucuklu bir plakadaki cam lameller üzerine aktarılır ve konfluense ulaşana kadar inkübe edilir. Lameller daha sonra yıkanır ve yeni bir plakaya aktarılır.Standart bir besiyeri kültüründen toplanan bakteriler santrifüj ile yıkanır ve ardından konak hücre kültürüne eklenir. İnvazyon gerçekleştikten sonra, hücre dışı bakteriler Gentamycin kullanılarak öldürülür, lamel camlar yıkanır ve yeni bir plakaya aktarılır. Son olarak, konak hücreler lizlenir ve hücre içi bakteri sayısını belirlemek amacıyla lizatlar agar plaklarına ekilir.Nihayetinde, spesifik bakterilerin invaziv yeteneğini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, bakterilerin konak hücrelere invazyonunun hastalığa nasıl yol açtığı gibi mikrobiyal patogenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, konak-patojen etkileşimlerinde rol oynayan bakteriyel proteinlerin tanımlanmasını ve karakterizasyonunu kolaylaştırabilir.Bu prosedürü, bir laboratuvardan doktora sonrası araştırmacı Dr. Andrew Edwards uygulamalı olarak gösterecektir. Bu analiz için, 37 °C'de T 75 flasklarda kültüre edilmiş insan endotel EAHY 9 26 hücreleri kullanıyoruz. Hücreler yaklaşık %95 konfluens düzeyine ulaştığında hasat edin.Büyüme ortamını uzaklaştırmak için hücreleri 10 milliliters PBS ile yıkayın. Hücreleri beş dakika boyunca tripsin EDTA çözeltisi içinde inkübe ederek ayırın. Ardından bir chronicle tüpüne aktarın.Ardından hücreleri santrifüjleyin ve steril pensler kullanarak yaklaşık 25 mililitre komple DMEM besiyerinde veya mililitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağının her bir kuyucuğuna bir termon lamel yerleştirin. Hücrelerin yapışabileceği opak tarafın yukarı bakacak şekilde yerleştirildiğinden emin olun.Ardından, her kuyucuğa 500 µL hücre ekleyin ve plakayı 37 °C'de 48 saat boyunca veya hücreler konfluens seviyesine ulaşana kadar inkübe edin. İnkübasyonun ardından, temiz bir pens kullanarak her bir lamelini dikkatlice çıkarın ve çözünür salgı proteinlerini uzaklaştırmak için DMEM'e batırın. Yıkanmış lamelleri, her kuyucuğunda 490 µL komple DMEM bulunan yeni bir 24 kuyucuklu plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın.Hücrelerin yukarı bakacak şekilde lamel yönleminin korunmasına dikkat edin. Brain heart infusion broth içerisinde 10 mililitre staphylococcus aureus kültürü hazırlayın. Bakteri kültürünü konik bir tüpe aktarın ve bakterileri 5, 000 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Hücreler pellet haline getirildikten sonra, süpernatantı uzaklaştırın ve pelleti yeniden süspande edin. Hücreleri yıkamak için pelleti 10 mililitre steril DMEM içinde süspande edin, hücreleri bir kez daha santrifüjleyin ve yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Bakterileri DMEM içinde yeniden süspande edin ve süspansiyonun optik yoğunluğunu ölçün.Konsantrasyonu, mililitrede yaklaşık 10⁹ koloni oluşturan birime tekabül eden 1,0 OD 600 değerini elde edecek şekilde ayarlayın. Bakteriyel süspansiyon hazır olduğunda, lamine camlar içeren 24 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 10 µL bakteri ekleyin.Bakterilerin hücrelere yapışmasını ve hücreleri istila etmesini sağlamak için plakayı 37 °C'de 15 ila 90 dakika inkübe edin. Bu inkübasyonun ardından, bağlanmamış bakterileri içeren her kuyucuktaki süpernatantı aspire edin ve yerine Gentamycin ile desteklenmiş %10 FBS-DMEM ekleyin. Hücre dışı bakterileri öldürmek için plakayı 37 °C'de 60 dakika inkübe edin.Bu inkübasyonun ardından, antibiyotiği uzaklaştırmak için her bir lamel DMEM ile üç kez yıkayın. Daha sonra bunları, kuyuk başına PBS içinde %0,5 Triton X 100 içeren 500 microliters bulunan yeni bir 24 kuyucuklu plakaya aktarın.Daha önce olduğu gibi, hücrenin kapalı tarafının yukarı bakmasına dikkat ederek; tüm hücrelerin lizize olduğundan ve hücre içi bakterilerin salındığından emin olmak için, sıvıyı kuyucuk içinde doğrudan lamelin üzerine aşağı yukarı pipetleyerek her bir lameli Triton çözeltisiyle kuvvetlice durulayın. Enfekte eden bakteri sayısını belirlemek için lizatın seri dilüsyonlarını yapın. Lizatı toplayın ve seri dilüsyonları TSA plaklarına ekin.Koloni oluşturan birimler, bu plakalarda 37 °C'de 24 saatlik inkübasyonun ardından belirlenebilir. Bu grafik, insan endotel hücrelerine invaze olan yabanıl tip veya fibronektin bağlayıcı protein eksikliğindeki staphylococcus aureus sayısını, yabanıl tip bakterilerle karşılaştırarak göstermektedir. Fibronektin bağlayıcı protein eksikliği olan staphylococcus aureus'ların endotel hücrelerini invaze etme yetenekleri önemli ölçüde bozulmuştur.Mutantın, fibronectin bağlama proteininin fibronectin bağlama alanı hariç kısmını kodlayan bir plazmid ile komplementasyonu invazyonu teşvik etmedi. Buna karşılık, mutantın tüm fibronectin bağlama proteinini kodlayan bir plazmid ile komplementasyonu, invazyonu vahşi tip seviyelerine geri döndürdü. Bu deneyde, fibronectin bağlama proteinini eksprese eden lactococcus Lactus'un konak hücrelere invaze olabildiği gösterilmiştir.Proteini eksprese etmeyen bakteriler hücrelere tutunma yeteneğine sahip değilken, her iki suş için tutunma kapasitesi aynıydı. Uzmanlaşıldığında, bu teknik üç saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre invazyonunu incelemek için bakterilerin ve konak hücrelerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Ayrıca, hastalığın bu yönüne dair anlayışınızı artırmak için ek soruların sorulabileceği aşamaları da belirleyebilmelisiniz.

invasion-of-human-cells-by-a-bacterial-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, anaerobik patojenik bir bakteri olan Porphyromonas gingivalis'in insan göbek damarı endotel hücrelerine (HUVEC'ler) yapışma ve istila etme yeteneğini değerlendirmek için bir teknik gösterilmektedir. Konakçı hücreleri bakterilerle enfekte ettikten sonra, konakçı hücreler hem yapışmış hem de içselleştirilmiş bakterileri serbest bırakmak için parçalanır. Lizat uygun bir ortamda kaplandığında, kolonilerin varlığı başarılı bakteri-konak hücre etkileşimlerini gösterir.

Anaerobik Bakteri-Konak Hücre Etkileşimlerini İncelemek İçin Bir Bakteriyel Enfeksiyon Testi

Aerobik koşullarda bakteri yapışma ve işgali araştırmak için hücre kültürü deneyleri Sahne genellikle temsil edici...

Bağırsak Epitel Hücreleri Of Enterik Bakteriyel Invasion<em&gt; In Vitro</em&gt; Dramatik bir Dikey Difüzyon Odası Modeli Geliştirilmiş mı

Listeria monocytogenes sıklıkla hücre içi asalaklığın çalışma için büyük bir model olarak kullanılan bir Gram pozitif bakteri patojendir. Geç L. Görüntüleme küçük müdahale edici RNA ekranlar bağlamında enfeksiyon aşamaları monocytogenes, hedef konakçı hücrelerin bakteriyel bir enfeksiyon için gerekli hücresel yolların küresel çalışma sağlar.

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes gebelerde fetal enfeksiyonlara ve duyarlı popülasyonlarda menenjite neden olur.  Bakterilerin subpopulasyonları kalp dokusunu kolonize ederek hastalarda ve laboratuvar hayvanlarında miyokarditlere neden olabilir.  Burada L. monocytogenes kardiyak hücre invazyonunun in vitro ve enfekte hayvanlarda kardiyak kolonizasyonun nasıl değerlendirileceğini açıklayan bir protokol sunuyoruz.

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Burada bir protokol, önceden enfekte edilmiş dendritik hücreler (DC) transinfection ile antijen sunumu sırasında ortaya çıkan, CD4 + T hücreleri tarafından bakteriyel yakalama ölçmek için sunulmuştur. Birincil hücreler, DC, DC / T hücre konjuge oluşumu enfeksiyon ve bakteri T hücre transfeksiyon ölçüm izolasyon: Biz gerekli adımları gerçekleştirmek için nasıl gösterir.

T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama

Koroid pleksusun (CP) epitel hücreleri kan-beyin omurilik sıvısı bariyerini (BCSFB) oluşturur. BCSFB'nin in vitro modeli, insan koroid pleksus papilloma (HIBCPP) hücrelerini kullanır. Bu makale, bir hücre kültürü filtre ekleme sistemi kullanılarak HIBCPP hücrelerinin kültürlenmesini ve bazolateral enfeksiyonunu açıklamaktadır.

İnsan Kan BOS Bariyer A Koroid Pleksus Epitel Hücre bazlı Modeli bazolateral Side Bakteriyel Enfeksiyon Eğitim için

Biz faktörler ana bilgisayar kodlama faaliyetlerini analiz için kullanılan her iki tüp bebek ve içinde vivo enfeksiyonu deneyleri tarif.

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

Çalışma, doku kök hücresinden türetilen bağırsak organoidleri kullanılarak bakteriyel enfeksiyonun in vitro incelenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Protokol, organoidlerin iki boyutta nasıl kültürleneceğini ve farklılaştırılacağını, onları yapışkan-invaziv Escherichia coli ile enfekte edeceğini ve epitel bariyer sızıntısı, enfeksiyon görüntüleme ve epitel RNA yanıtı gibi önemli okumaları nasıl değerlendireceğini açıklar.

Konak-bakteri etkileşimlerini incelemek için invazin veya bazal zar ekstraktı üzerine iki boyutlu organoid kültürü

Wormsorter floresan gazetecilere ifadeye göre solucanlar sıralayarak Caenorhabditis elegans genetik ekranları kolaylaştırır. Burada, yeni bir kullanımını tanımlamak: GFP-ifade patojen tarafından kolonizasyon göre sıralama, ve biz bağışıklık tepkilerini başlatarak patojen tanıma anlaşılamamıştır rolünü incelemek için istihdam.

Otomatik Ayırma<em&gt; C. elegans</em&gt; Değişken derecelerde Bakteriyel Patojen tarafından kolonileştirildiğini

Hücre içermeyen HİV-1 parçacıklarına farklı olarak, enfekte olmuş CD4 + T hücrelerinin etkili bir plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) ile algılanır. Bu yazıda tip I IFN serbest bırakılması ile değerlendirilen periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ya da izole edilmiş bir PDC pDC'lerde ile doğuştan gelen algılamayı değerlendirmek için, HIV-1 ile enfekte edilmiş T hücreleri ile birlikte-kültür, bir yöntem tarif eder.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

Keşfedin, Staphylococcus aureus'un insan endotelyal hücrelerini istila etme yeteneğini ölçmek için bu protokolü. Bu yöntem, bakteriyel invazyon mekanizmalarını anlamak ve potansiyel tedavi hedeflerini belirlemek için araştırmacılara yardımcı olur.

Bakteriyel Patojen İnsan Hücreleri Invasion

Daha fazla video keşfet