Name: Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Öğrenin embriyonik kök hücrelerde kromatin protein dinamiklerini FRAP ve FLIP fotobeyazlatma yöntemleriyle canlı hücrelerde nasıl ölçebilirsiniz. Bu teknikler kromatin plastisitesini gözlemlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz kritik bir yorum ve sorun giderme günlük bazda photobleaching deneyler için, özellikle Meshorer laboratuar üyeleri, Shai Melcer, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ram, badi Sri Sailaja, Anna Mattout ve Alva Biran teşekkür ederim. EM, Joseph H. ve Belle R. Braun Yaşam Bilimleri Kıdemli Öğretim Üyesi ve İsrail Bilim Vakfı (ISF 943/09), İsrail Sağlık Bakanlığı (6007) Avrupa Birliği (IRG-206.872 ve 238.176) tarafından desteklenen İsrail Kanser Araştırma Vakfı, İbrani Üniversitesi ve İsrail Psikobiyoloji Enstitüsü İç uygulamalı Tıp Hibeler.

1. ES Hücreler Kaplama T = 0 sa MEF kaplama <ol><li> Tabakanın canlı görüntüleme μ-Slaytlar 8-kuyu (ibidi; Münih, Almanya), jelatin veya odacıklı kapak camları (Lab-Tek, Rochester, NY) ile veya cam alt kültür yemekleri (Mattek; Ashland, MA). 5-30 dakika bekletin ve ücretsiz jelatin uzak aspirat. </li><li> Tohum 22.000 MEFS / DMEM 250 ul toplam hacmi [% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş]. Hücreler doku kültürü inkübatör (37 ° C,% 5 CO2) büyümesine izin verin. </li></ol> T = 6 saat ES hücre kaplama <ol start="3"><li> Aspire DMEM. </li><li> Tohum / ES hücre medya 250 ul toplam hacmi 15.000 R1 hücreleri ile kaplı her MEF [% 10 ESC dereceli fetal sığır serumu (FBS), 1 mM sodyum piruvat, 0.1 mM aminoasitlerin, 0.1 mM β-ile takviye merkaptoetanol, ve 1000 U / ml lösemi inhibitör faktör (LIF)], ertesi gün% 30 -% 50 izdiham elde etmek için. </li></ol> 2. ES Hücreler Transfecting T = 24 saat Geçici transfeksiyon <ol><li> 250 ul / kuyu taze ES hücre medya ES hücre ortamı değiştirin. </li><li> 1.5 ml steril test tüpü, 100 ul serum ücretsiz medya [Opti-MEM (Gibco)], serum serbest ortam içine doğrudan 10 ul transit LT1 transfeksiyon reaktifi (Mirus) ekleyin. Nazik pipetleme ile karıştırın ve 5-20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 1.5 mg GFP füzyon plazmid DNA (H1e, H1o veya HP1) seyreltilmiş transit-LT1 reaktif ekleyin. Nazik pipetleme ile karıştırın ve 15-30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 13.5 ul / kuyu transfeksiyon karışımı ekleyin. Swirl μ-Slaytlar 8-hatta dağılma sağlamak için iyi. 24 saat 250 ul taze ES hücre medya ile eski ES hücre medya değiştirdikten sonra. </li></ol> 3. Sıkı bağlamak ve FLIP Sahne T = 48-72 saat <ol><li> Deneyde herhangi bir konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) yapılabilir, ancak normal bir sıkı bağlamak / FLIP deneyde bu yana, birçok üst üste görüntüleri elde toplama hızı sağlayan dönen bir disk konfokal mikroskop kullanmak için önerilen ve sağlar dair hiçbir beyazlatma istenmeyen numune ilk kasıtlı beyazlatma olay meydana gelecektir. Burada, Yokogawa CSU-X dönen disk kafası disk konfokal sistemi (www.Andor.com) Devrim iplik kullanmanızı öneririz. Bu sistem bir nokta tarama sistemi ile özel bir FRAPPA modülü kullanarak photobleach çift kapasiteye sahip ve hızla dönen disk kullanarak görüntü toplamak için ışık geri dönmek. Deneyler photobleaching için kullanılan en yaygın 3 floresan proteinleri GFP, YFP ve Kiraz. GFP veya YFP kullanılırsa, bir ~ 488 nm lazer gereklidir. Kiraz, ~ 560 nm lazer kullanın. Tüm durumlarda, katı hal lazerleri kullanmanızı öneririz. Otomatik bir aşamada olması yararlı ancak gerekli değildir. Canlı hücreler görüntülü olduğundan, (LIS gelen birini kullanıyorsanız, İsviçre) bir kazanı kullanmak için gerekli oksijeni kontrol, nem, CO 2 ve sıcaklık. Sıkı bağlamak gerekli minimal lazer gücü (genellikle% 10 alan, floresan seviyesi yeterli) ile görüntüleme yapılırken maksimum lazer yoğunluğu kullanılarak yapılır. Uygun dalga boyu floresan ışık hücreleri gözlemleyin ve 60X immersiyon yağı lens kullanarak GFP ifade eden bir hücreyi seçin. Doğru hücre içi dağıtım olun. Bazen, ekspresyon düzeyleri çok yüksek, protein lokalizasyonu nükleolus gibi diğer bölmelere 'dökülme'. Bu tür hücreler seçili olmamalıdır. </li><li> Şimdi bir görüntüleme protokolü ayarlayın: ökromatin veya heterokromatin (yoğun GFP odakları olarak görülüyor) sonra, photobleaching önce photobleach 3-5 kare toplamak ve 250-1000 ms aralıklarla, photobleach sonra 90-120 kare toplamak: H1e-GFP, 1000 ms H1o ve HP1-GFP, 250 ms (zaman aralığı değişiklikleri son derece dinamik proteinler, kısa bir zaman aralığı gerektiren protein dinamikleri, göre). Biz normalde 80-100 lazer yoğunluğu% 20-40 μseconds (1-2 tekrarlamalar) bir lazer darbesi ile photobleaching kullanır, ancak bu sayılar, analiz edilen protein ve ekspresyon seviyeleri göre değiştirebilirsiniz. Photobleaching uygun olduğunda, GFP floresan bir "kara delik" gözlemlemek gerekir. Kara delik giderek floresan aşağıdaki kurtarma yeniden doldurulur. Dönen disk, saniyede 60 görüntü (iyi floresan ve tek bir hücre üzerinde yakınlaştırma) elde edebilirsiniz rağmen, biz, düşük görüntü kalitesi ve potansiyel artışı fototoksisite sayesinde yüksek hızlarda sistem kullanmanızı tavsiye etmiyoruz. </li><li> FLIP bir deneme için, farklı bir görüntüleme protokolü kurmak, ağartma önce 3-5 kare toplamak sonra görüntüleri toplarken aynı noktada beyazlatma tekrarlanmalıdır. H1e H1o-GFP, çamaşır suyu, GFP, çamaşır suyu, her 5 saniye, her 2 sn ve HP1-GFP çamaşır suyu her 1 sn için. Bleach bird tüm deney boyunca tekrar tekrar görüntüleri toplamak. </li><li> Her iki teknik için, 20-30 hücreleri üzerinde işlemi tekrarlayın. Istatistiki amaçlar için, tercihen farklı günlerde, deney 3 veya daha fazla kez tekrarlayın. Homojen bir nüfus ve doğru ayarları, standart sapma, genellikle düşük (&lt;% 5). Hem sıkı bağlamak ve FLIP için, ağartılmış bölgenin büyüklüğü ve şekli kurtarma dinamiklerini etkiler ve bir deney içinde sabit kalmalıdır. Ayrıca, iki hücre karşılaştırıldığında, aynı protokolleri kullanılan olmalıdır ve hücrelerin güç lazer ve diğer koşulları dalgalanma gösterebilir ve deney sonucunu etkileyebilecek aynı gün sırayla analiz edilmelidir. </li></ol> 4. Sıkı bağlamak ve FLIP Veri Analizi <ol><li> Tüm sıkı bağlamak kare toplanan, floresan yoğunluğu ölçümü ROI (yatırım getirisi b = ağartılmış alan), arka plan alanı (ROI bg) ve önce zamanın bir fonksiyonu olarak ve ağartma sonra olmayan ağartılmış nükleer alanı (ROI nb). Ağartılmış bölgenin ihmal olduğunda tüm çekirdek normalleşme amaçlar için seçilebilir. </li><li> / (ROI nb - ROI bg) - (ROI bg ROI b) / (pbROI b - pbROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg), pb önceden ağartılmış ifade eder: her zaman noktası için, formüle göre veri normalleştirmek. -Bleach öncesi görüntüleri için yaklaşık 1 bir değer almalısınız. Çamaşır suyu sonra ilk görüntü Bleach Derinlik gösterecektir. Gerçek Bleach Derinlik değeri için 1 değeri çıkarma. Her hücre ve her bir deney ortalama 20-30 hücreleri için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Toplanan tüm FLIP kare, olmayan ağartılmış nükleer alanda floresan ve arka alanı (ROI nb = ağartılmış olmayan alan, YG bg = arka) ölçer. FLIP veri hesaplanması sıkı bağlamak eğrisine benzer, sadece analiz yatırım getirisi (ROI nb) hesaplanmasında kullanılan gerçek beyazlatılmış bölge, farklı olmalıdır: (ROI nb - ROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg) . Normalleştirme amaçlı bir komşu hücre (ROI n = komşu hücre) kullanmak da mümkündür: (ROI nb - ROI bg) / (ROI n - ROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg) / (pbROI n - pbROI bg .) Veri toplama, bilgisayar simülasyonu için deneysel veri sığdırmak mümkün. Bu iyi bir yakınlık, cep fraksiyonu, hareketsiz fraksiyonu ve yarı-maksimum, hesaplama sağlar. Biz burada sıkı bağlamak analizler matematiksel ve istatistiksel yönlerini tartışmak ve diğer mükemmel yayınlar 4-9 okuyucu bakın olmaz. Çamaşır suyu derinliği önceden çamaşır suyu (% 100), sinyal ve çamaşır suyu sonra ilk görüntü arasındaki mesafe (y ekseni) ifade eder; mobil fraksiyonu çamaşır suyu derinliği ve arasındaki mesafe (y ekseni) ifade eder Kurtarılan sinyal kinetik bir platoya ulaşır ve hareketsiz fraksiyonu kurtarılan sinyal ve ön çamaşır suyu (% 100) sinyal arasındaki mesafe (y-ekseni) (bkz. Şekil 1B ve 2B) ifade eder. Bu analizin ötesinde, veri sığdırmak için iyi bir matematiksel modeller vardır. Tek bir üs, denklem için  <img src="/files/ftp_upload/2696/eq0.jpg" alt="Denklem" width="80" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Denklem"> t zaman nerede, A, 1-A mobil fraksiyonu hareketsiz fraksiyonu ve k off sabit ayrışma, veri sığdırmak için kullanılır ve kapalı bağlama oranı doğrudan tahmin edilebilir (k off) yanı sıra, dernek oranı hesaplamak için kullanılan parametre, elde. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 A ve B gösterisi temsilcisi sıkı bağlamak eğrileri HP1 (solda), H1o (orta) ve R1 ES hücrelerinin H1e (sağda). Sadelik ve berraklık Şekil için 1A herhangi bir normalleşme ve hesaplama önce tek bir hücre ham verileri gösterir. Sarı eğrisi ağartılmış bölgeye karşılık, mor eğri olmayan ağartılmış nükleer alanı (ağartılmış bölgenin ihmal olduğunda tüm çekirdeği normalleşme amaçlar için seçilebilir) karşılık, kırmızı çizgi olan eşiğe karşılık gelen Bu durumda minimal. Dikey ok çamaşır suyu temsil eder. Normalize ve ortalama veriler Şekil 1B gösterilmiştir. H1 (mavi) HP1 (kırmızı) ile karşılaştırıldığında daha yavaş iyileşme unutmayın. Ayrıca H1e varyant (koyu mavi) H1o varyant (açık mavi) daha yavaştır. Mobil ve sabit kesirler ve Bleach Derinlik HP1 gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> 2. A ve B ökromatin karşılaştırarak göstermek temsilcisi sıkı bağlamak eğrileri (ŞekilR1 ES hücrelerinin HP1 heterokromatin (sağda) ile birlikte) bıraktı. Benzer şekilde Şekil 1, Şekil 2A, tek bir hücrenin ham verileri gösterir, sarı eğrisi ağartılmış bölgeye karşılık, mor eğri olmayan ağartılmış nükleer alana karşılık, kırmızı çizgi eşiğe karşılık gelir. Dikey ok çamaşır suyu temsil eder. Normalize ve ortalama veriler Şekil 2B gösterilmiştir. Heterokromatin (koyu kırmızı) ökromatin (açık kırmızı) ile karşılaştırıldığında daha yavaş iyileşme unutmayın. Mobil ve sabit kesirler ve Bleach Derinlik ökromatin gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. H1o R1 ES hücreleri tipik bir FLIP deney Şekil 3A (ham, un normalize veri) ve B (normalize ve ortalama veri) gösterilir. Bu deneyde, mor eğri olmayan ağartılmış nükleer alana karşılık, yeşil hat komşu bir hücre çekirdeğine karşılık gelen ve kırmızı çizgi eşiğe karşılık gelir.

<ol><li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo%3A+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li>
<li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeshorer%2C+E+%22Imaging+chromatin+in+embyonic+stem+cells+in+StemBook%22">Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook</a>. Girard, L. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge. (2008).</li>
<li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBancaud%2C+A+%22Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells%3A+FRAP%2C+photoactivation%2C+photo+conversion%2C+and+FLIP%22">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP</a>. , Cold Spring Harbor Press. (2009).</li>
<li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li>
<li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells%3A+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li>
<li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li>
<li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics%3A+what+do+we+really+know%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li>
<li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li>
<li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+TransgeneOmics%3A+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li>
<li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li>
<li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li>
</ol>

Hücre popülasyonlarının veya sabit hücreleri, sıkı bağlamak deneyler saflaştırılmış kromatin içeren en uygun teknikler, aksine, canlı hücrelerde kromatin protein dinamikleri değişiklikler izleyin. Kromatin protein dinamiği kromatin plastisite için iyi bir gösterge olarak bulundu. Ancak, bu fırınlama, GFP ilgi geninin gerektirdiğinden, floresan etiketinin yanı sıra protein fonksiyonu ile karışabilir. Bu nedenle, sıkı bağlamak geçmeden önce, füzyon proteini titizlikle kendi doğal muhatabı olarak aynı özellikleri ve işlevi...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5671 </td></tr><tr><td> Jelâtin </td><td> Merck </td><td> 1,04078 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> Transit LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> Μ-Slaytlar 8-iyi </td><td> ibidi </td><td> 80826 </td></tr></tbody></table>

embriyonik kök hücreler yaşayan kromatin protein dynamics tedbir tahliller (sıkı bağlamak ve flip) photobleaching

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak) ve Photobleaching olarak Floresan Kaybı (FLIP) iyi mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip canlı hücrelerin protein dinamikleri çalışma sağlar. Burada sıkı bağlamak ve kromatin proteinleri, H1 ve HP1, fare embriyonik kök (ES) hücreleri de dahil olmak üzere FLIP deneyleri gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Sıkı bağlamak deneyde, hücreler, yeşil floresan protein (GFP) veya bunların türevleri (YFP, CFP, Kiraz, vb.) Ile kaynaşmış bir ilgi protein, ya geçici ya da stabil bir şekilde, transfekte vardır. Transfekte floresanlama hücreleri, yoğun bir ilgi odaklı lazer ışını nispeten küçük bir bölge (ROI) beyazlatıcılar. Lazer dalga boyu, füzyon için kullanılan floresan protein göre seçilir. Geri dönüşümsüz yatırım getirisini lazer ışığı floresan sinyal moleküllerin beyazlatıcılar ve hemen beyazlatma aşağıdaki ağartılmış alan floresan sinyal kurtarma ağartılmamış molekülleri ile ağartılmış moleküllerin yedek aracılık zaman atlamalı görüntüleme ile izlenir. Üretilen floresan kurtarma eğrileri protein hareketlilik hakkında bilgi sağlar. Floresan moleküller hareketsiz iseniz, herhangi bir floresan iyileşme görülecektir. Tamamlayıcı bir yaklaşım, Photobleaching içinde Floresan Kaybı (FLIP), lazer ışını aynı noktaya tekrar tekrar beyazlatıcılar ve başka floresanlama hücre sinyal yoğunluğu ölçülür. Bu nedenle FLIP deneyler yerine floresan kurtarma ölçmek ve sinyal çürümesi, hücresel bölmeleri arasında mekik protein hareketlilik gibi, protein belirlemek için yararlıdır. Geçici bağlanma kromatin ile ilişkili proteinlerin ortak bir özelliği. Her kromatin protein kararlı durum herhangi bir anda büyük bir bölümü kromatin bağlı olmasına rağmen, bağlama, geçici ve en kromatin proteinleri saniye sırasına göre bir ikamet süresi, kromatin üzerinde yüksek bir ciroya sahip. Bu özellikler, yüksek plastisite genom ifade 1 üretmek için çok önemlidir . Photobleaching deneyler kromatin proteinleri (heterokromatinin protein 1 (HP1), bağlayıcı histon H1 ve çekirdek histon dahil) dinamik değişimi yüksek olduğu, bu nedenle özellikle ES hücrelerinin kromatin plastisite, kromatin yapısal proteinleri, GFP-füzyon sürümlerini kullanan belirlemek için özellikle yararlı 2,3 farklılaşmış hücrelerin daha.

Biz Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak) ve embriyonik kök hücreleri (ES) kromatin protein dinamiklerini izlemek için (FLIP) Photobleaching Floresan kaybı da dahil olmak üzere photobleaching yöntemleri açıklanmaktadır. Kromatin plastisite çalışma araçlarının biri olarak kabul edilir Kromatin protein dinamiği, pluripotent hücreler geliştirilmiş.

Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

Fotobeyazlatma Sonrası Floresan İyileşmesi (FRAP) ve Fotobeyazlatma ile Floresan Kaybı (FLIP), canlı hücrelerdeki protein dinamiklerinin ... ile incelenmesine olanak tanır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, embriyonik kök hücrelerdeki kromatin proteini dinamiklerini izlemektir. Bu işlem, transfekte edilen hücrelerde floresan işaretli kromatin proteini ekspres etmek için e ESL'nin GFP füzyon plazmid DNA ile transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir; ardından geri kazanımı veya kaybı ölçmek için frap veya flip uygulanır. Fotobleykleme sonrası proteinin dinamik davranışı izlenir ve mobil ile immobil protein fraksiyonları belirlenir.FRAP ve FLIP analizlerine dayanarak, kromatin protein dinamiklerinde farklılıklar olduğunu gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu tekniğin, salsa deterjanları kullanılarak kromatin proteinlerinin ekstre edilmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tekil canlı hücrelere uygulanabiliyor olmasıdır. Bu sayede, kromatin ile kromatin proteinleri arasındaki etkileşim canlı olarak gözlemlenebilir ve belirli bir popülasyon içindeki heterojenlik belirlenebilir.Steril teknik kullanarak fare embriyonik fibroblastlarını veya meth hücrelerini ekerek başlayın. Bir kültür kabininde, canlı görüntüleme sekiz kuyucuklu mikro slaytları jelatin kaplaması ile hazırlayın. Jelatin kaplamasının oda sıcaklığında 5 ila 30 dakika boyunca sabitlenmesini

photobleaching-assays-frap-flip-to-measure-chromatin-protein-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sıkı bağlamak, Yeşil Floresan Protein (GFP) etiketli kültür hücreleri proteinlerin hareketliliği ölçmek için kullanılır olmuştur. Biz photobleaching sonra floresan kurtarma yüzdesi analiz ederek, GFP mobil / hareketsiz kesirler inceledi. Bu çalışmada, sıkı bağlamak hipokampal nöronlar, dikenler yapıldı.

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

RNA polimeraz II transkripsiyonel kinetiği canlı hücrelerin belirli genlerin ölçülür. ilgi gen transkripsiyonu mRNA'ların floresan etiketli ve (sıkı bağlamak) in vivo kinetiği transkripsiyonel uzama elde edilir Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak.

Tek Yaşayan Hücreler mRNA Transkripsiyon Kinetik Ölçüm

Hücre yüzeyindeki akson kılavuz reseptörlerinin mekansal-zamansal dinamiklerini incelemek için pH'a duyarlı yeşil floresan protein varyantı pHluorin'in kullanımını burada açıklıyoruz. pHluorin etiketli reseptör hem hücre kültüründe hem de in vivoolarak ifade edilir Civciv embriyosunun elektroporasyonunu kullanarak.

Hücre Kültüründe ve Civciv Embriyosunda Akson Kılavuz Reseptörlerinin Dinamiklerini Değerlendirmek için pHluorin Kullanımı

nasıl kromatin düzenleyiciler ve kromatin devletlerin soru in vivo genom hücre kaderi kararları gelişen embriyonun yapılır ne kadar erken anlayışımıza önemli olduğunu etkileyebilir. ChIP-Seq-küresel düzey bir Xenopus embriyolar için burada özetlenen kromotin özelliklerini araştırmak için en popüler yaklaşım.

Kromatin Regülatörleri ve Devletleri&#39;nde genom Anlık<em&gt; Ksenopus</emChIP-Sıra tarafından&gt; Embriyolar

Işık levha bazlı floresan mikroskobu ile böcek embriyonlarından morfojenezini Görüntüleme tekniğin durumu haline gelmiştir. Bu protokol ana hatlarıyla ve Tribolium castaneum embriyolar için uygun üç montaj teknikleri karşılaştırır, canlı görüntüleme için uygun iki yeni ısmarlama transjenik çizgileri sunar, önemli bir kalite kontrol anlatılır ve mevcut deney sınırlamaları gösterir.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Kromatin gevşeklik blastomeres gelişim potansiyelini yer gibi görünüyor. Ancak, kromatin gevşekliği güvenilir bir dizin olarak embriyoların gelişim potansiyeli için kullanılıp kullanılamayacağını bilinmemektedir. Burada, kromatin gevşekliği tarafından değerlendirilmiş zigotları tam dönem için gelişebilir bir deneysel sistem tarif edilmiştir.

Zygotic floresan kurtarma fotoğraf ağartma sonra analiz için tam dönemlik geliştirme sağlar kromatin gevşeklik

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Biz bıldırcın embriyo modeli sistemde çoklu proteinlerin hızlı ve verimli ifade izin veren bir yöntem olarak haberci RNA (mRNA) elektroporasyonu rapor. Bu yöntem floresan hücreler için kullanılabilir ve Elektroporasyon kısa bir süre sonra zaman atlamalı mikroskopinin in vivo hareketlerini kaydetmek.

MRNA Electroporation kullanarak Avian embriyoları çoklu proteinlerin hızlı ve verimli Ifade

Bu süreç, Arabidopsis thaliana'da floresan etiketlenmiş çekirdek ve kromatin işaretleyici çizgisi ile birlikte konfokal mikroskopi kullanarak Arabidopsis köklerinde çekirdek ve kromatin dinamiklerini aynı anda kaydeder ve gelişimsel ile çevresel ipuçlarına yanıt olarak bu dinamiklerdeki değişiklikleri araştırır.

Arabidopsis thaliana Kökünde Gelişim Sırasında Nükleer Şekil ve Kromatin Dinamiklerinin Nicel Canlı Hücre Görüntülemesi ve Çevresel Stres

Öğrenin embriyonik kök hücrelerde kromatin protein dinamiklerini FRAP ve FLIP fotobeyazlatma yöntemleriyle canlı hücrelerde nasıl ölçebilirsiniz. Bu teknikler kromatin plastisitesini gözlemlemenizi sağlar.

Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

Daha fazla video keşfet