Name: C in vivo Lazer Axotomy elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Öğrenin C. elegans'ta lazerle in vivo nöron kesme ve rejenerasyon ölçümü yöntemini. Bu maliyet etkin teknik, GABA motor nöronları ve diğer hücre tipleri için hassas kontrol sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Hammarlund laboratuarında İş tarafından finanse edilmektedir: NIH hibe R01 NS066082-01 ve T32GM007223, Beckman Vakfı ve Ellison Tıp Vakfı.

1. Sistem montajı Sisteminin belirli bileşenleri aşağıda özetlenmiştir. Doğru montaj yapıldığında, kullanıcının tek elle mikroskop odaklanmak gerekir, (ya fare, joystick ile) ile sahneye taşımak, ayak pedalı ile lazer etkinleştirin ve üzerinde net bir görüş var ekran görüntüsü. <ol><li> MicroPoint lazer epi-floresans bir bileşik mikroskop bağlantı noktasına monte edilebilir. Biz Nikon 80i kullanabilirsiniz, ancak, herhangi bir araştırma notu Dik veya ters çevrilmiş kapsamı çalışması gerekir. MicroPoint sistemi kesmek istediğiniz hücreleri etiketler fluorofor maç gereken özel bir dikroik içerecektir. Alternatif fluorophores etiketli Kesme hücreleri ek dichroics gerektirir. Ayrıca, bir darbe jeneratörü ve ayak pedalı MicroPoint sistemi ile geliyor. </li><li> 100x, 1.4 NA yağ performans cerrahi ve yenilenme değerlendirilmesi için objektif, artı slayt örnek bulmak için gerekli ek hedefler. Biz ameliyatı için bir Nikon Planı Apo VC ve 4x kaba odaklama ve örnek bulmak için yararlı olduğunu bulmak. </li><li> Joystick ile sahne Motorlu. Sahnede sadece hedefleme için kullanılan bu yana, son derece yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile bir aşamasında, gereksiz. Biz önce OptiScan II (tartışma) kullanın. </li><li> Kamera. Kamera, bilgisayar monitörü görüntü görselleştirme 100x amacı ile etiketlenmiş neurite, odak ve hedef yeterli bir kare hızı sağlamak için ihtiyaç. Biz axotomy prosedürü sırasında aydınlatma ışığı azaltıcı (aşağıda, 1.7 bakınız) foto ağartma veya hasar potansiyel karıştırıcı etkilerini önlemek için tercih ediyor. Böylece, fotoğraf makinesi, bu düşük ışık seviyesini karşılamak için yeterince duyarlı olması gerekir. Biz Hamamatsu Orca 05G kullanımı ve 16.3 Hz görüntüleme yeterli olduğunu bulmak. Eşdeğer kameralar yerine olabilir. </li><li> Kamera sürücü, Bilgisayar, monitör, ve görüntüleme yazılımı. Ayrıca, (tartışma), bir fare ile motorlu sahne işlemek için görüntüleme yazılımı kullanın. </li><li> Hava tablo. Bu gereklilik, yere bağlı olarak değişebilir, fakat cerrahi 100x amacı ile yapılır, titreşim izolasyonu gerekli buluyorum. </li><li> Fluorofor aydınlatan ışık kılavuzu ve obtüratör mekanizması ile Işık kaynağı. Işık kılavuzu MicroPoint eklenecektir. Obtüratör mekanizması bağımsız lazer aydınlatma yoğunluğunu azaltmak için yararlıdır. Biz önce Lümen 200 veya Leica EL6000 kullanımı ve axotomy toplam ışık yoğunluğu% 80 kadar zayıflatır. </li></ol> 2. Lazer kurulum Ayrıntılı bir protokol başlangıçta hizalayın ve lazer odak MicroPoint lazer sistemi ile sağlanmaktadır. Biz ilk kurulum prosedürü üzerine başarılı bir şekilde takip edilmiştir varsayalım. Bu lazer mercek crosshair'i ile hizalayarak içerir. Burada lazer odak ve yoğunluğu düzenli bakım için bir protokol sağlar. MicroPoint kılavuzda belirtildiği gibi, darbeli azot lazer insan gözü ciddi zarar verme yeteneğine sahiptir. Bakım lazer ışını doğrudan bakmak asla alınmalıdır. Kurulduktan sonra, bariyer filtresi güvenle göz mercekleri ile radyasyon engellemeniz gerekir. Bir organizmanın nöronlar Kesme kum tanesi büyüklüğü zor olabilir. Lazer tarafından yapılan hasar alan çok küçük olduğundan, bu örnek tam hedef için üç boyutlu lazer odak konumunu bilmek şarttır. Lazer odak yansıtılmış slayt kullanılarak bulunur. İlk olarak, lazer odak z konumu görüntüleme yolunu odak eşleşen olmadığını kontrol edin. Daha sonra, hasar odak xy konumu görüntüleme yazılımı crosshair'i ile işaretlenir. Z-düzlemi yoğunlaşırken <ol><li> Nötral yoğunluk filtresi ND16 (Şekil 1a) itin. Biz netleme sırasında lazer azaltmak için epi-aydınlatma yolunda nötral yoğunluk filtreleri kullanın. Daha ince odaklanarak, ND16 ve ND4 floresan filtreleri hem itin. </li><li> Anahtarı ile 1 darbe MicroPoint lazer 'Seç' (Şekil 1b), ve daha sonra uygun bir uzun geçiş bariyer filtresi (Şekil 1c) filtre tekerleği hareket döndü. </li><li> Sahneye yansıtılan slayt yerleştirin ve iletilen ışık kullanarak 4X amacı ile içinde iğne deliği odaklanmak. </li><li> Yansıtılmış slayt bir damla immersiyon yağı ekleyin ve 100X amacı ile iğne delikleri üzerinde odaklanılması. Ile kamera deklanşör kolu (Şekil 1d) ve lazer çekim hızı (Şekil 1e) anahtarlama optik yol açın. Gerekirse iğne deliği kenarları keskin, bu yüzden iletilen ışık yoğunluğunu azaltmak: Bu tam olarak odaklama yardımcı olacaktır. </li><li> Ayak pedalı basın. Bu ayna lazer düzgün odaklı ise küçük bir delik üretmek gerekir. </li><li> Yansıtılmış slayt düzlemi biraz üstünde mikroskop Focus ve lazer tekrar ateş. Bu daha küçük yapmak gerekirilk atış daha delik, ya da hiç iz bırakmak. Yansıtılmış slayt altında yoğunlaşarak tekrarlayın. </li><li> Bir delik 2.5 veya daha büyük bir delik üretilen ayna yüzeyi altında veya üstünde duruluyor ise, lazer ablasyon baş odak halkası ile tekrar odaklayın. Delik hala düzgün merceğindeki crosshair'i ile uyumlu olduğunu doğrulayın. Tutarlı kullanımı ile, z-düzlemi odak nadiren ayarlanması gerekiyor. </li></ol> Xy düzleminde yoğunlaşırken <ol start="8"><li> Yukarıda 2.3 üzerinden 2.1 adımları izleyin ve küçük bir delik ayna slayt yapmak için ayak pedalına basın. </li><li> Başlatın menüsü Elements 'Acquire' çekim modu 'Canlı'. 'Ölçü' araç 'seçeneğini ROI editörü', sonra 'çift çapraz' aracını seçin ve yeni deliğin merkezi ile hizalamak crosshair'i sürükleyin. Ve daha sonra 'Çıkış editörü' ROI Kaydet 've canlı çekim modu devam tıklayın. </li><li> Fare ile sahne işlemek için Elements 'fare XY' ayarı etkinleştirin. </li><li> Nötral yoğunluk filtresi (ler), orijinal pozisyonuna (lar) geri çekin 10 lazer bakliyat ve yansıtılmış slayt kaldırmak. </li></ol> Lazer güç ayarlama <ol start="12"><li> Lazer güç seçtiğiniz nöron kesmek için gerekli olan minimum gücü ayarlanabilir olmalıdır. Yaşayan solucanlar (aşağıda açıklanmıştır) kesim ise zayıflatıcı plaka (Şekil 1f) hareket ederek güç ayarlayın. Lazer gücü çok yüksek ise, bu çevresel hasara neden olan veya solucan bir delik patlama olacak. Lazer gücü çok düşükse, nöron sever. Sistem kurulduktan sonra, zayıflatıcı pozisyonu nadiren değiştirilmesi gerekir. Lazer zayıflarsa, zayıflatıcı plaka kesme devam taşındı ihtiyacı varsa, boya hücre boya değiştirilmesi gerekir (bakınız tartışma) bir işareti olabilir. </li></ol> 3. Solucanlar hareketsiz <ol><li> % 3 M9 erimiş agaroz, 22mm KH2PO4, 42mm Na2HPO4, 85mm NaCl, 1mm MgSO4 bir çözüm hazırlayın. Erimiş agaroz 5 ml, 15 ml şahin tüp içine koyun. Başka bir tüp su ile doldurun. Modüler bir gözü Yeri tüpler 55 ° C'ye kadar Her tüp için mini su banyoları oluşturmak için gözü su ile doldurun. Not: agaroz büyük miktarlarda önceden hazırlanan ve daha sonraki deneyler için yeniden erimiş olabilir. </li><li> Etiketleme bant her iki slaytlar ve bu slaytları arasında temiz bir slayt iki kat yerleştirin. Temiz slayt ve sonucu agaroz pad (Şekil 2) iki adet bant kalınlığı, böylece ilk yer dik başka bir slayt ortasında plastik bir ampul pipet kullanarak agaroz bir damla koyun. 30 saniye sonra yastık iki slaytları teker teker çıkarın. Durulayın ve plastik pipet sonraki slaytlar ile kullanmak için, su dolu bir şahin tüp içinde saklayın. </li><li> Sonra, yer 3-5 ped merkezinde 0.10 mm veya 0.05 mikron polistiren boncuklar mcL. 5-10 solucanlar ilgi nöronların floresan proteini ifade ekleyin. Ilgi nöronların asimetrik solucanın sağ veya sol tarafında dağıtılan platin alma, solucanlar doğru tarafı yukarı bakacak şekilde çevirmek için kullanın. Worms agaroz pedleri hazırlanması 10 dakika içinde slaytlar konulmalıdır. </li><li> Solucanlar bir kapak kayma dikkatlice yerleştirin. Kapak kayma yerleştirildikten sonra, bu manikür bozabilir ve solucanları yok edecektir agaroz pad göre hareket yok. Mikroskop aşamasında hazırlanan slayt yerleştirin. </li></ol> 4. Kes nöronlar <ol><li> Optik yol geçiş kolu ile göz mercekleri içine doğrudan güneş ışığı. 4X amacı ile kesilebilir solucan odaklanın kapak astar üzerine petrol bir damla yerleştirin ve 100X amacı geçmek. Kamera optik yol dönün. </li><li> Crosshair'i merkezinde altında seçtiğiniz nöron taşımak için fareyi kullanın. Lazer yangın ayak pedalına basın ve nöronal süreci sever. Gerekirse, bakliyat iki takım nöron koparmak için kullanılabilir. İlk başta, bu nöronların sonraki rejenerasyon değerlendirmek için bireysel solucanlar kesilmiş sahip olduğu tam olarak takip etmek için yararlı olur. Doğru yapıldığında, lazer axotomy çevresindeki cilt dokusu veya diğer nöronların (bkz. Şekil 3) önemli bir hasara neden olmadan, nöron küçük bir mola üretir. Bazı durumlarda, küçük bir iz, site çevresinde yaralanma meydana gelebilir. </li><li> Solucanlar agaroz pad üzerinde kalmasını dikkatli olmak, doğrudan yukarı doğru hareketi kapak kayma kaldırarak solucanlar kurtarın. Lamel kapalı slayt yapmayın. Sonra, iğne burun forseps ile solucanlar etrafında ped kesmek ve OP50 8 içeren taze bir numaralı seribaşı NGM plaka agaroz bölümüne yerleştirin . Boncuk solucanlar ücretsiz ve agaroz kaldırmak için steril M9 10 mcL pad üzerinde yerleştirin. </li></ol> 5. Puan nöron rejenerasyonu için <ol><li> Agaroz adım 2.2 'de belirtildiği gibi, dolgusunu hazırlayın. </li><li> 3-5 ve Yeri solucanlarmu; polistiren boncuklar L. Lamel uygulayın. Slaytlar sırayla hazırlıklı olmak, ya da alternatif tüm solucanlar, avans ve 10 cm kültür yemekleri, her agaroz nemli tutmak için nemli bir Kimwipe içeren muhafaza slaytlar hazırlanmış olabilir. </li><li> 100X amacı kopmuş nöronlar görselleştirmek için kullanın. Birçok nöronlar, kesme sitesi distal nöronal güdük kalacaktır. Biz bu kalıntının varlığı gerçekten nöron (Şekil 4) kopmuş olduğunu bir göstergesi olarak kullanırlar. Bu güdük varlığı kesmeyin kesilen ve yeniden bir nöron ayırt etmek mümkün kılar. Not: her iki distal ve proksimal kütükleri başlangıçta kesildikten sonra geri çekin. </li><li> Rejenerasyon değerlendirin. Çeşitli parametreler tespit edilebilir. Bir basit test yaralı nöron bir büyüme konisi oluşmuş (Şekil 4a) ve (Şekil 4b) rejenere olup olmadığını, ya da. Alternatif olarak, neurite süresini izlenebilir ve karşılaştırılabilir. </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları Bir örnek olarak, γ-amino butirik asit (GABA), motor nöronların yenilenme karakterizasyonu açıklar. Bu nöronlar ventral sinir kablosunu ikamet ve dorsal sinir kablosu dairesel süreçleri uzatmak, 9 doğru hareketlilik için gereklidir. GABA nöronlar unc -47 veya unc -25 rehberleri (C. elegans Genetik Merkezi'nden suşlar sırasıyla EG1285 ve CZ1200, kontrol altında, yeşil floresan proteininin (GFP), genetik olarak kodlanmış bir florofor ifade ederek görüntülenebilmekte .) Dağı L4-aşamada solucanlar açıklandığı gibi, solucanlar, sağ tarafta GABA nöronlar bakacak şekilde çevirin ve kapağı kayma bir yer. Dorsal ve ventral kabloları arasında her solucan, yarıda arka commissures 1-3 kesin. Ile çapraz veya bu gibi diğer commissures, salkımlı sonra puanı zor olduğunu commissures kesme kaçının. Açıklandığı gibi solucanlar kurtarın. Başarılı axotomy 18 ila 24 saat sonra, solucanlar, ameliyat sonrası iyileşti ve normal lokomotor ve yumurtlama davranışlar sergilemek olacaktır. Ölü ya da hasta olan solucanlar atın. Açıklandığı gibi kalan remount ve yenilenme değerlendirmek. Biz genellikle başına en az 30 kesilmiş nöronlar deneysel durumu değerlendirmek üzere hedefliyoruz. OxIs12 hayvanlarda genellikle kopmuş L4 GABA nöronların% 60-70 oranında bir büyüme konisi yapısı, bir ucu ve birkaç neurite şube uzantısı membran genişletilmesi ve kesme sitesi (Şekil 4a) göç kanıtladığı başlatmışlardır. Birçok durumda, büyüme konileri, dorsal sinir kablosu, bir komşu nöronal komissür ya da distal güdük yeniden göç etmiş. Nöron Geriye kalan% 30 ya axotomy site proksimal güdük oluşturan büyüme başlattık, ya da sadece küçük filopodia (Şekil 4b) genişletilmiş olacak. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. UV lazer axotomy sistemi darbeli. Özgül bileşenleri şunlardır: (a) ND filtre, (b) darbe seçici (c) filtre tekerleği kolu (d), kolu (e) lazer deklanşör ve (f) zayıflatıcı plaka geçiş optik yol. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Agaroz ped hazırlanması. Istenilen kalınlıkta bir agaroz yastık hazırlamak için, iki kat bant (yeşil) iki slaytlar üzerine yerleştirilir. Bir slayt ilk iki arasına yerleştirilir ve agaroz bir damla, sonra temiz bir slayt eklenir. Son olarak, dördüncü bir slayt, iki adet bant kalınlığı, bir yastık içinde ilk üç dik olarak yerleştirilir. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Temsilcisi GABA nöron axotomies. Tipik bir deneyde, GABA nöron commissures solucanın lateral ortasında kesilmiş. Hemen önce (sol panel) ve (sağ panel) axotomy sonra kopmuş komissür gösterilmiştir. Tüm görüntüler 100X petrol amacı ile alınmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. GABA nöron axotomies Temsilcisi sonuçlar. 24 saat sonrası axotomy kopmuş aksonların rejenerasyonu için attı. (A) olmayan rejenere akson (b) (ok) proksimal güdük olarak görülür bir büyüme konisi (ok) ile rejenere akson gösterilmiştir. Her kesim aksonun distal güdük her paneli (ok ucu) gösterilir ve akson kopmuş olduğunu bir göstergesidir.

<ol><li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li>
<li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage%2C+ephrin+signaling%2C+and+synaptic+branchi+ng%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branchi ng.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 15132-15137 (2007).</li>
<li>Yan, D., Wu, Z., Chisholm, A. D., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DLK-1+Kinase+Promotes+mRNA+Stability+and+Local+Translation+in+C.+elegans+Synapses+and+Axon+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The DLK-1 Kinase Promotes mRNA Stability and Local Translation in C. elegans Synapses and Axon Regeneration.</a> Cell. 138, 1005-1018 (2009).</li>
<li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgery%3A+Functional+regeneration+after+laser+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosurgery: Functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li>
<li>Gabel, C. V., Antoine, F., Chuang, C., Samuel, A. D. T., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nanosecond+laser+axotomy%3A+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li>
<li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nanosecond+laser+axotomy%3A+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li>
<li>Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1988).</li>
<li>McLntire, S. L., Jorgensen, E., Kaplan, J., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GABAergic+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The GABAergic nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364, 337-341 (1993).</li>
<li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in.</a> C. elegans. Optics Express. 15, 8521-8531 (2007).</li>
<li>Chung, S., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+A%3A+Materials+Science+%26+Processing%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Applied Physics A: Materials Science & Processing. 96, 335-341 (2009).</li>
<li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature Protocols. 5, 395-407 (2010).</li>
<li>Wang, Z., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+axon+regeneration.+Current+Opinion+in+Neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of axon regeneration. Current Opinion in Neurobiology.</a> , Forthcoming (2010).</li>
<li>Huang, X., Cheng, H. -J., Tessier-Lavigne, M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAX-1%2C+a+Novel+PH%2FMyTH4%2FFERM+Domain+Cytoplasmic+Protein+Implicated+in+Netrin-Mediated+Axon+Repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">MAX-1, a Novel PH/MyTH4/FERM Domain Cytoplasmic Protein Implicated in Netrin-Mediated Axon Repulsion.</a> Neuron. 34, 563-576 (2002).</li>
<li>McIntire, S. L., Reimer, R. J., Schuske, K., Edwards, R. H., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+vesicular+GABA+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the vesicular GABA transporter.</a> Nature. 389, 870-876 (1997).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFang-Yen%2C+C+%22Laser+microsurgery+in+C.+elegans+in+Methods+in+Cell+Biology%3A+Caenorhabditis+elegans%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Laser microsurgery in C. elegans in Methods in Cell Biology: Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. , Elsevier Academic Press. Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Guo, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5, 531-533 (2008).</li>
<li>Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+precision+on-chip+small-animal+immobilization%2C+multi-photon+imaging+and+femtosecond-laser+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation.</a> Lab on a Chip. 8, 653-656 (2008).</li>
<li>Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+on-chip+high-throughput+whole-animal+sorting+and+screening+at+subcellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 13891-13895 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li>
<li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior%2C+nerve+regeneration%2C+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 561-567 (2009).</li>
<li>Samara, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+in+vivo+femtosecond+laser+neurosurgery+screen+reveals+small-molecule+enhancer+of+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Large-scale in vivo femtosecond laser neurosurgery screen reveals small-molecule enhancer of regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).</li>
<li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> Journal of Experimental Zoology. 231, 45-56 (1984).</li>
<li>Sulston, J. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+cell+autonomy+during+postembryonic+development+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 78, 577-597 (1980).</li>
<li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 87, 286-300 (1981).</li>
<li>Allen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173, 20-26 (2008).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Innate+Immune+Responses+to+Infection+and+Wounding+in+the+C.+elegans+Epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Innate Immune Responses to Infection and Wounding in the C. elegans Epidermis.</a> Current biology. CB 18, 481-489 (2008).</li>
</ol>

Çeşitli lazer sistemleri neurites C ile kesmek için kullanılır elegans ve birçok çalışmalar ayrıntılı 3,7,10,11 onların performansını inceledik. Protokolünde kullanılan MicroPoint lazer anahtar teslimi bir sistemi kurmak ve sürdürmek için kolay ve araştırmacılar için bir Ti-Safir lazer sistemi ile karşılaştırıldığında oldukça düşük bir maliyetle kullanılabilir. Ancak, Ti-Safir sistemi ile karşılaştırıldığında, bazı uygulamalar için dezavantaj olabilir daha geniş bir alana zarar vermek MicroPoint lazer bekleniyor. Ti-Safir sistemi istenirse, böyle bir sistem inşa mükemmel bir protokol 12 kullanılabilir. Geçerli protokol C. nöronların çeşitli yapılabilir elegans, ancak biz farklı türleri arasındaki nöronların rejeneratif kabiliyetleri farklılıklar 13 beklenen unutmayın. Ayrıca, farklı transgenik kökenden rejeneratif başarısını etkileyebilir. Yenileyici GABA nöron yüzdesi farklı transgenik marker suşları arasında oldukça tutarlı olmasına rağmen, biz oxIs12 15 solucanlar vs juIs76 14 rejenerasyon genel bir hafif bir artış kaydetti var. Dokunmatik nöronlar belirteçleri arasındaki farklar da 2 tarif edilmiştir. Boncuk, daha hızlı ve daha tutarlı immobilizasyon 16 sonuç olarak anestezikler daha ziyade mikro solucanlar hareketsiz tercih ediyor . Rejenerasyon anestezi 17 nedeniyle olası karıştırıcı etkileri, ücretsiz gözlemlemek mümkün olduğu gibi, bu da avantajlıdır . Immobilizasyon için alternatif bir anestezi gerektirmeyen yöntem mikroakışkan cihazların kullanımı. Axotomy için Mikroakiskan kullanımı yaygın 17-22 tarif edilmiştir. Biz her hafta MicroPoint kılavuzda belirtilen prosedürü izleyerek bir kez tutarlı kullanımı ile, en iyi Kumarin boya hücrede 440 lazer fonksiyonları değişmiş olduğunu bulabilirsiniz. Gerekirse, zayıflama sürgüsünü gücünü artırmak için kullanılır, ancak bu eski boya veya lazer hiza bir göstergesi olabilir. Ayrıca, boya hücre sınırlı bir ömrü vardır ve bir süre sonunda (Bkz Sorun Giderme) yeniden inşa edilecek veya değiştirilecek gerekecektir. Bu hayvan eksik felç olur, özellikle lazer odak işareti crosshair&#39;i altında hedef neurite manevra zor olabilir. Biz kesinlikle kullanışlı olmasına rağmen manuel bir aşamada, bu amaç için en uygun olduğunu bulabilirsiniz. Joystick kontrollü motorlu aşamasında daha hassas ve motorlu sahne taşımak için fare ile sürükleyerek görüntü destekleyen yazılım kullanarak en iyi olduğunu bulmak. Nikon Elements bu özelliği sağlar ve bu protokolü açıklanan, ancak ücretsiz micromanager paketi gibi diğer görüntüleme yazılımı, benzer işlevlere sahip olabilir. Ince hedefleme farklı bir şekilde hayvan yerine, lazer odağı taşımak için. Galvanometre ışın direksiyon mekanizması olarak kullanılabilir MicroPoint lazer add-on, bu yaklaşım tercih edilir. Nöronal rejenerasyon çalışması için uygulama yanı sıra, lazer ablasyon diğer hücre tipleri, cilt, kas, ya da özel hücreler gibi, ya da belirli nöron sinaps 23-27 bozmaya kullanılabilir . Ayrıca bu sistem ile, yaralanma ya da hastalık eşlik nöronların dejenerasyonu düzenleyen yollar araştırılmalıdır olabilir. Darbeli lazerler kullanmak gibi nöronal rejenerasyon ve diğer ilgili işlemleri kolaylaştırmak, genetik faktörler ve hücre biyolojik değişiklikler ışık tutmaya devam edecektir. Sorun Giderme: Bazı ortak sorunları ve bunlarla ilişkili çözümleri burada nitelendirdi. <ol type="a"><li> Lazer düzgün kesme değildir. Ya lazer odak dışında (bkz. Bölüm 2) Bunun nedeni, büyük olasılıkla, ya da boya hücreye boya değiştirilmesi gerekir (MicroPoint el kitabına bakın). Alternatif olarak, boya hücre değiştirilmesi veya yeniden inşa edilmesi gerekebilir. </li><li> Solucanlar agaroz pad üzerinde hareket ediyor. Bu genellikle agaroz pedi çok nemli olduğunu bir göstergesidir. Biz pedleri, solucanlar, bu sorunu aşmak için, üzerlerine yerleştirilen önce yaklaşık 30 saniye boyunca bırakılamayacak gerektiğini bulabilirsiniz. Ayrıca, daha küçük boyutlu (0.05 mikron) mikro kullanmayı deneyebilirsiniz. </li><li> Solucanlar kurtarma, zor ve verimsiz . Bu yanlış lamel kaldırma veya kuru bir agaroz ped neden olabilir. Pad çok kuru ise, aksonlar boncuklu görünüm geliştirmek olduğunu fark edebilirsiniz. Bazı durumlarda, solucanlar yakında sonra yapıldı pad üzerinde yer verilmemesi nedeniyle bu. Alternatif olarak, eski bir stok agaroz çözüm tekrarlanan erime sonra% 3 daha yüksek konsantrasyon olabilir. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> 0.05 mikron Polistiren Boncuk </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 08691 </td><td></td></tr><tr><td> 0.10 mikron Polistiren Boncuk </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agaroz GPG / LE </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> 00972 </td><td> Ultra saf </td></tr><tr><td> Falcon 14 ml Polistiren Yuvarlak Tabanlı Tüp </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> 17 x 100 mm tarzı, nonpyrogenic </td></tr><tr><td> Thermo Scientific Düz precleaned mikroskop slaytlar </td><td> Erie Bilimsel Şirketi </td><td> 420-004T </td><td> 3 &quot;x 1&quot; x 1 mm </td></tr><tr><td> Kapak Fiş </td><td> VWR </td><td> 48366 205 </td><td> 18 mm x 18 mm No 1 1 / 2 </td></tr><tr><td> KIMTECH Bilim Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 34155 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 100 x 15mm Stil Petri Dish </td><td> BD Biosciences </td><td> 351029 </td><td></td></tr><tr><td> Teyp boş 3/4w x 500L </td><td> TimeMed </td><td> T-512 </td><td></td></tr><tr><td> Immersiyon </td><td> Nikon </td><td></td><td> A nd = 1.515 yazın </td></tr><tr><td> EG1285 veya CZ1200 </td><td> C. elegans Genetik Merkezi </td><td> http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ </td><td></td></tr><tr><td> OptiScan II. </td><td> ÖNCE Bilimsel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS-Elements Ar veya Br </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MicroPoint Ablasyon Lazer Sistemi </td><td> Bilimsel Fotonik </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bileşik mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse 80i </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Kamera </td><td> Photonics </td><td> Model C8484-05G01 </td><td></td></tr><tr><td> Intel Core 2 Duo işlemcili Dell Precision T3400 PC </td><td> Vadi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Windows XP Professional </td><td></td><td> Microsoft </td><td> Sürüm 2002, Seri Pack 3 </td></tr><tr><td> Çift kuru banyo İnkübatör </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Analog kontroller </td></tr><tr><td> 4X Planı Fluor objektif </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100X Planı Apo VC yağlı objektif </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 / 45 forseps </td><td> Dumont </td><td> 11251-35 </td><td> Dumoxel standart ipuçları # 7 de kullanabilirsiniz </td></tr><tr><td> Diseksiyon Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ800 </td><td> NI-150, Yüksek Yoğunluklu aydınlatıcısı ile </td></tr></tbody></table>

c in vivo lazer axotomy elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Nöronlar akson ve dendritler üzerinden diğer hücrelere, ön ya da post-sinaptik uzmanlık içeren ince zarı uzantıları ile iletişim kurmak. Bir nöron, yaralanma ya da hastalık hasar görmüşse, yeniden olabilir. Hücre iç ve dış faktörleri fonksiyonunu yeniden ve yeniden bir nöronun yeteneğini etkiler. Son zamanlarda, nematod C. elegans genleri tanımlamak için mükemmel bir model organizma olarak ortaya çıkan ve nöronlar 1-6 rejenerasyon etkisi sinyal yolakları. C. nöronal rejenerasyon başlatmak için ana yol elegans, lazer aracılı kesim, ya da axotomy . Axotomy sırasında, bir floresan etiketli nöronal süreç, yüksek enerjili darbeler kullanarak kopmuş. Başlangıçta, C ile nöronal rejenerasyon elegans güçlendirilmiş bir femtosaniye lazer 5 kullanılarak incelenmiştir. Ancak, daha sonraki rejenerasyon çalışmaları pulsed lazer doğru in vivo nöronlar sever ve benzer bir rejeneratif cevap 1,3,7 ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini göstermiştir. Biz MicroPoint darbeli lazer, hazır ve yaygın hedeflenen hücre ablasyon için kullanılan anahtar teslimi bir sistem kullanarak solucan in vivo lazer axotomy gerçekleştirmek için bir protokol mevcut. Biz, lazer hizalayarak, solucanlar montaj, özel nöronların kesim ve sonraki rejenerasyon değerlendirilmesi tarif. Sistem, bir deney sırasında birden fazla solucan nöron çok sayıda kesmek için yeteneği sağlar. Bu nedenle, burada açıklanan lazer axotomy yenilenme sürecini başlatmak ve analiz etmek için etkin bir sistem.

Nöronların kesmek için bir protokol<em&gt; C. elegans</em&gt; MicroPoint darbeli lazer sunulmaktadır. Biz solucanlar hareketsizleştirir, sistem kurma ve etiketli nöronlar kesilmesinin tarif. Avantajları nispeten düşük maliyetli bir sistem ve nöronal süreçleri veya ablasyon hücreleri sever yeteneği<em&gt; In vivo</em&gt;.

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Nöronlar, pre- veya post-sinaptik özelleşmeler içeren ince membran uzantıları olan aksonlar ve dendritler aracılığıyla diğer hücrelerle iletişim kurarlar. Eğer bir nöron...

Bu prosedürün genel amacı, CL nöronlarını in vivo ortamda bir lazerle hassas bir şekilde kesmektir. Bu işlem, taksotomi sisteminin kurulması ve lazerin gücünün hassas bir şekilde odaklanması, hizalanması ve ayarlanmasıyla gerçekleştirilir. Solucanlar bir mikroskop lamı üzerinde sabitlendiğinde, nöronları hassas uzamsal ve zamansal kontrolle kesilebilir.Koparılan nöronların ne ölçüde yeniden oluştuğu, büyüme konilerinin puanlanması ve/veya nörit uzunluklarının izlenmesi yoluyla ölçülür. Bu tekniğin femtosaniye lazer gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, mikro nokta darbeli lazerin kurulumu ve bakımı kolay, maliyet etkin bir sistem olması ve çok çeşitli uygulamalara kolayca uyarlanabilmesidir; biz bu yöntemi tipik olarak GABA motor nöronlarının rejenerasyonunu incelemek için uygularız. Sistem ayrıca deri kası veya spesifik nöronal sinapslar gibi diğer hücre tiplerini ablate etmek için de kullanılabilir.Bu yöntem, mikro nokta lazer sistemine ihtiyaç duyar. Lazer, bir bileşik mikroskobun epi-floresan portuna monte edilir ve hücrelerde kesilecek olan florofor ile eşleşen tek bir dikroik aynanın yanı sıra bir darbe üreteci ve lazeri çalıştırmak için bir ayak pedalı içerir. Mikroskop, en azından 100x 1.4 NA yağlı objektif ve 4x objektif ile donatılmış olmalıdır.Joystick ile kumanda edilen motorlu bir sahneye sahip olun ve aydınlatma için bu sahneyi bir hava masasına monte edin. Işık kılavuzlu bir ışık kaynağı ve bir shutter mekanizması, mikro nokta lazerine bağlanmıştır. Shutter mekanizması, aydınlatma yoğunluğunu lazerden bağımsız olarak azaltmak için kullanışlıdır.Bilgisayara bağlı olan bir kameranın en az 16 hertz kare hızına sahip olması ve düşük ışık koşullarında iyi çalışması gerekir. Bilgisayarın; nöronları görüntülemek, kamerayı yönetmek ve motorlu sahneyi kontrol etmek için Nikon elements gibi bir görüntüleme yazılımına ihtiyacı vardır. Sistem tamamen kurulduğunda, kullanıcı bir eliyle mikroskobu odaklayabilir, diğer eliyle sahneyi hareket ettirebilir, ayak pedalıyla lazeri etkinleştirebilir ve ekrandaki görüntüyü net bir şekilde görebilir.Kum tanesi boyutundaki bir organizmadaki nöronları kesmek zorlayıcı olabilir. Bunu başarmak için lazerin üç boyutta da sıkıca odaklanması gerekir. İşleme Z düzlemini odaklayarak başlayın.Daha hassas bir odaklama yapabilmek için lazeri zayıflatmak amacıyla nötr yoğunluk filtresi ND 16'yı içeri itin; ardından hem ND 16'yı hem de dört floresan ND filtresini itin. Sonrasında, anahtarı seçme konumuna getirerek mikro nokta lazerini tek darbeye ayarlayın ve ardından filtre tekerleğini uygun uzun geçiren bariyer filtresine getirin. Şimdi sahneye aynalı bir lam yerleştirin ve 4x objektif ile iletilen ışığı kullanarak lam üzerindeki pinhole deliklere odaklanın.Odaklama yapıldıktan sonra, lama bir damla imersiyon yağı ekleyin ve 100x objektif ile iğne deliklerine yeniden odaklayın. Ardından, kamera şalterini ve lazer şalterini açmak için optik yol değiştirme kolunu kullanın. Hassas odaklama yapmakta zorlanıyorsanız, iğne deliğinin kenarlarının netleşmesi için iletilen ışık şiddetini azaltın.Odaklamayı test etmek için ayak pedalını kullanarak lazeri ateşleyin. Z düzlemi düzgün şekilde odaklanmışsa, aynada küçük bir delik görünmelidir. Şimdi mikroskobu aynalı lamın düzleminin biraz üzerine odaklayın ve lazeri tekrar ateşleyin.Bu işlem, ilk atıştan daha küçük bir delik oluşturmalı veya hiç iz bırakmamalıdır. Aynalı lamın altına odaklanıldığında da aynı sonuçlar görülmelidir. Ancak, daha büyük bir delik oluşursa, ablasyon kafasındaki odaklama halkasıyla lazeri yeniden odaklayın.Son olarak, deliğin okülerdeki artı gösterge çizgileriyle hâlâ düzgün şekilde hizalı olduğunu doğrulayın. Düzenli kullanımda, Z düzlemi odağının ayarlanması nadiren gerekir. Lazeri XY düzleminde odaklamak için aynada başka bir delik açın ve ardından Nikon elements yazılımına erişin.Edinme menüsünde canlı yakalama modunu başlatın. Ölçüm araç çubuğunda, ROI düzenleyiciyi seçin, çift haçlı araç seçeneğini belirleyin ve artı işaretini yeni deliğin merkeziyle hizalanacak şekilde sürükleyin. ROI'yi kaydet'e tıklayın ve ardından canlı yakalamaya devam etmek için düzenleyiciden çıkın.Sahneyi fare ile kontrol etmek için fare XY ayarını etkinleştirin. Artık lazer odaklanmış durumdadır. Nötr yoğunluk filtrelerini orijinal konumlarına getirin ve gelecekteki kullanımlar için lazer darbelerini birden 10'a ayarlayın.İlk olarak, M nine solüsyonu içerisinde %3'lük eritilmiş aros solüsyonu hazırlayın ve yaklaşık beş mililitresini 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü 55 ila 65 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve geri kalanını gelecekteki kullanımlar için saklayın. Şimdi, etiketlenmiş iki lam kullanın.Solucanların yerleştirilebileceği bir tabla oluşturmak için bir çift temiz lamı bantla sabitleyin ve üzerine bir damla agaroz damlatın. 30 saniye sonra agaroz katılaştığında, tablanın üzerine pipetle 3 ile 5 µL arasında 0,05 ile 0,1 µm boyutunda polistiren boncuk ekleyin; 10 dakika içerisinde, etiketli nöronları kolayca görülebilecek şekilde 5 ile 10 adet transgenik solucanı platin bir iğne yardımıyla hızlıca boncukların üzerine yerleştirin. Solucanlara zarar vermemek için standart bir lamelle solucanların üzerini dikkatlice kapatın.Sürükleyerek hareket ettirin. Solucan lamı artık taksonomik incelemelerin gerçekleştirilmesi için hazırdır. Oküler yardımıyla, dört kat güç altında solucanları bulun; 100 kat objektif ile yeniden odaklayın, iletilmiş ışığı kapatın, floresan ışığını açın ve optik yolu kameraya yönlendirin.Nöronu artı işaretinin merkezine getirmek için fareyi kullanın. Şimdi ayak pedalıyla lazeri ateşleyin. Doğru lazer gücü, nöronu bir veya iki darbede kesecektir.Çok yüksek lazer gücü, çevresel hasara yol açacak veya solucanda bir delik açacaktır; lazerin gücünü ayarlamak için atenüatör plakasını hareket ettirin. Lazer zayıflarsa, kesme işlemine devam edebilmek için atenüatör plakasının konumu ayarlanabilir. Ancak bu durum, genellikle lazerin D hücresindeki Kumar in four 40'ın değiştirilmesi gerektiğinin bir göstergesidir; işlem doğru şekilde gerçekleştirildiğinde.Lazer taksotomisi, nöronda küçük bir kopuş oluşturur. Bazı durumlarda, yaralanma bölgesinin etrafında küçük bir skar oluşabilir. Pratik olarak hayvan başına bir ila üç nöron kesilmektedir, ancak teorik bir sınır yoktur.İşlem tamamlandığında, kapak camını doğrudan yukarı doğru hareketle kaldırarak solucanları geri kazanın; solucanların agaroz ped üzerinde kaldığından emin olun. Kapak camını kaydırarak çıkarmayın. Solucanların etrafındaki pedi kesip çıkarmak için sivri uçlu pens kullanın.Pedin, OP 50 içeren taze ekilmiş bir NGM plakasına yerleştirin ve solucanları 10 µL steril M9 ile serbest bırakın. Eksotomiden sonraki sekiz ila 48 saat arasında rejenerasyon değerlendirilebilir; bunun için sağlıklı solucanları üç ila beş µL polistiren boncuklar üzerine yeniden monte edin ve nöronları ile kesilmiş nöronları görüntüleyin. Kesim bölgesinin distalinde bir nöron kütüğü kalacaktır. Hem distal hem de proksimal kütükler kesildikten sonra başlangıçta geri çekilir, ancak proksimal kütükten rejenerasyon beklenir.Rejenerasyon, büyüme konisi oluşumuna göre skorlanabilir. Alternatif olarak, nörit uzunluğu izlenebilir ve karşılaştırılabilir; tipik olarak GABA nöronlarının %60 ila %70'i kesildikten sonraki 24 saat içinde büyüme konileri oluşturur. Eğer lazer düzgün kesmiyorsa, bunun nedeni muhtemelen lazerin odak dışında olması veya boya hücresindeki boyanın değiştirilmesi gerekmesidir.Ayrıca, solucanların hareket ettiğini fark ederseniz, bunun nedeni muhtemelen agroz pedinin çok nemli olmasıdır. Bu sorunu önlemek için solucanlar yerleştirilmeden önce pedlerin yaklaşık 30 saniye boyunca bekletilmesi gerektiğini saptadık. Ek olarak, solucanları hareketsiz hale getirmek için daha küçük boyutlu mikroboncuklar kullanmayı deneyebilirsiniz.Son olarak, aksonların boncuklu bir görünüme sahip olduğunu fark ederseniz, bunun nedeni muhtemelen agar pedinin çok kuru olmasıdır. Bu videoyu izledikten sonra, mikro nokta lazer sisteminin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Taksonomi için solucanları sabitleyebilir, bireysel nöronları kesebilir ve sonrasındaki rejenerasyonu değerlendirebilirsiniz.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Lazer axotomy time-lapse görüntüleme mutasyonların etkileri de tahlil için hassas bir...

Axon Rejenerasyon Eğitim Düşük bütçeli Lazer Axotomy Sistemi oluşturulması C. elegans</em

Bu video, solucan epidermisinde çok hassas yaralanmalara neden olmak için kullanılan bir lazer yaralama yöntemini tanıtmaktadır. Örnek protokol, yara tepkisi ve onarımı üzerine yapılan bir çalışmadan alınmıştır.

Epidermal Lazer Yarası: C. elegans'ta Onarım Süreçlerini İncelemek İçin Lokalize Hasara İndükleme

Bu video, iki foton lazer aksotomi kullanarak ve yaralanmadan aksonal iyileşmeyi gözlemleyerek zebra balığı embriyolarında aksonları yaralama yöntemini açıklamaktadır.

İki Fotonlu Lazer Aksotomi: Zebra Balığı Embriyolarında Aksonları Yaralamak ve Aksonal İyileşmeyi Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi...

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

Lazer nanodissection bağlanmış iki foton görüntüleme, hücre içi çözünürlük ile merkezi sinir sisteminin dejeneratif ve rejeneratif işlemlerini incelemek için yararlı araçlardır. Bu protokol, etiket görüntü ve in vivo serebellar korteks bir tırmanma lifleri incelemek için gösterilmiştir.

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Yetişkin C. elegans derisi, yara kapanması, yara oluşumu ve doğuştan gelen bağışıklık dahil olmak üzere epitelyal yara tepkileri çalışmaları için izlenebilir bir modeldir.

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler ° C. elegans

Lazer ablasyon biyolojik sistemlerde rejenerasyon eğitimi için yaygın olarak uygulanan bir teknolojidir. Sunulan protokol, lazer ablasyon için standart bir lazer tarama konfokal mikroskobu ve zebrabalığı lateral hattında ki internöromast hücrelerinin yenilenmesinin daha sonra zaman atlamalı görüntülemesini açıklar.

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

RNA dizilimi için bireysel nematod dokularını izole etmek için lazer mikrodiseksiyonu kullanan bir protokol tanımlanmıştır. Protokol, türe özgü genetik araç setleri gerektirmez ve gen ekspresyon profillerinin tek doku örnekleri düzeyinde farklı türler arasında karşılaştırılmasına izin verir.

Türlerden Agnostik Tek Doku Uygulamaları için Lazer Mikrodiseksiyonu

Öğrenin C. elegans'ta lazerle in vivo nöron kesme ve rejenerasyon ölçümü yöntemini. Bu maliyet etkin teknik, GABA motor nöronları ve diğer hücre tipleri için hassas kontrol sağlar.

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Daha fazla video keşfet