C in vivo Lazer Axotomy elegans

Nöronların kesmek için bir protokol

Bu prosedürün genel amacı, CL nöronlarını in vivo bir lazerle hassas bir şekilde kesmektir. Bu, takotomi sisteminin monte edilmesi ve lazerin gücünün hassas bir şekilde odaklanması, hizalanması ve ayarlanmasıyla gerçekleştirilir. Solucanlar bir mikroskop lamı üzerinde hareketsiz hale getirildiğinde, nöronları hassas uzamsal ve zamansal kontrol ile kesilebilir.

Kopmuş nöronların ne ölçüde yenilendiği daha sonra büyüme konileri için puanlama ve/veya nörit uzunlukları izlenerek ölçülür. Bu tekniğin femtosaniye lazer gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, mikro nokta darbeli lazerin kurulumu ve bakımı kolay olan ve çok çeşitli uygulamalar için kolayca uyarlanabilen uygun maliyetli bir sistem olmasıdır, ancak bu yöntemi tipik olarak GABA motor nöronlarının rejenerasyonunu incelemek için uyguluyoruz. Sistem ayrıca cilt kası veya spesifik nöronal sinapsis gibi diğer hücre tiplerini ablate etmek için de kullanılabilir.

Bu yöntem bir mikro nokta lazer sistemi gerektirir. Lazer, bir bileşik mikroskobun epi floresan portuna monte edilir ve kesilecek hücrelerdeki floroforla eşleşen tek bir dikroik, bir darbe üreteci ve lazeri çalıştırmak için bir ayak pedalı içerir. En azından, mikroskop 100 kat 1.4 NA yağ objektifi ve dört katı objektif ile donatılmalıdır.

Joystick ile çalışan motorlu bir sahneye sahip olun ve aydınlatma için bir hava masasına monte edin. Mikro nokta lazerine ışık kılavuzu ve deklanşör mekanizması olan bir ışık kaynağı takılmıştır. Deklanşör mekanizması, aydınlatma yoğunluğunu lazerden bağımsız olarak azaltmak için kullanışlıdır.

Bilgisayara bağlı bir kamera, en az 16 hertz kare hızı gerektirir ve düşük ışıkta iyi çalışmalıdır. Bilgisayar, nöronları görüntülemek, kamerayı sürmek ve motorlu sahneyi manipüle etmek için Nikon öğeleri gibi görüntüleme yazılımlarına ihtiyaç duyar. Tamamen monte edildiğinde, kullanıcı bir eliyle mikroskobu odaklayabilir, diğer eliyle sahneyi hareket ettirebilir, ayak pedalıyla lazeri etkinleştirebilir ve ekrandaki görüntüyü net bir şekilde görebilir.

Bir kum tanesi büyüklüğündeki bir organizmadaki nöronları kesmek zor olabilir. Bunu başarmak için, lazerin her üç boyutta da sıkı bir şekilde odaklanması gerekir. Z düzlemine odaklanarak başlayın.

Daha hassas odaklama için netleme yaparken lazeri zayıflatmak için nötr yoğunluk filtresi ND 16'yı içeri itin ve hem ND 16 hem de ND dört floresan filtresini itin. Ardından, seçmek için anahtar çevrilerek mikro nokta lazerini bir darbeye ayarlayın ve ardından filtre tekerleğini uygun uzun geçişli bariyer filtresine hareket ettirin. Şimdi sahneye aynalı bir slayt yerleştirin ve dört kez objektif ve iletilen ışığı kullanarak içindeki iğne deliklerine odaklanın.

Odaklandıktan sonra, slayta bir damla daldırma yağı ekleyin ve 100 kez objektifle iğne deliklerine yeniden odaklanın. Ardından, kamera deklanşörünü açmak ve lazer deklanşörünü açmak için optik yol değiştirme kolunu kullanın. Doğru oluyorsa, odaklama zordur, iletilen ışık yoğunluğunu azaltın, böylece iğne deliğinin kenarları net olur.

Odağı test etmek için, lazeri ateşlemek için ayak pedalını kullanın. Z düzlemi düzgün bir şekilde odaklanmışsa, aynada küçük bir delik görünmelidir. Şimdi mikroskobu aynalı lam düzleminin biraz üzerine odaklayın ve lazeri çekin. Yine.

Bu, ilk atıştan daha küçük bir delik açmalı veya hiç iz bırakmamalıdır. Yansıtılmış slaytın altına odaklanırken de aynı sonuçlar görülmelidir. Bununla birlikte, daha büyük bir delik oluşursa, odak halkası ablasyon kafası üzerindeyken lazeri yeniden odaklayın.

Son olarak, deliğin göz merceğindeki artı işaretleriyle hala düzgün şekilde hizalandığını doğrulayın. Tutarlı kullanımla, Z düzlemi odağının nadiren ayarlanması gerekir. Lazeri XY düzlemine odaklamak için aynada başka bir delik açın ve ardından Nikon öğelerindeki yazılıma erişin.

Edinme menüsünde canlı çekim modunu başlatın. Hesaplama araç çubuğunda ROI düzenleyicisi'ni seçin, çift çarpı aracını seçin ve artı işaretlerini yeni deliğin merkeziyle hizalamak için sürükleyin. ROI'yi kaydet'e tıklayın ve ardından canlı çekime devam etmek için düzenleyiciden çıkın.

Sahneyi fare ile değiştirmek için, farenin XY ayarını etkinleştirin. Şimdi lazer odaklanmıştır. Nötr yoğunluk filtrelerini orijinal konumlarına sıfırlayın ve ileride kullanmak üzere lazer darbelerini bir ile 10 arasında ayarlayın.

İlk olarak, M dokuz çözeltisinde% 3 erimiş aros çözeltisi hazırlayın ve yaklaşık beş mililitreyi 50 mililitrelik bir tüpe koyun. Tüpü 55 ila 65 santigrat derece su banyosuna yerleştirin ve kalanını ileride kullanmak üzere saklayın. Şimdi etiketleme ile kaplı iki slayt kullanın.

Solucanların yerleştirilebileceği bir ped yapmak için bir çift temiz slayt ve bir damla agaroz bantlayın. 30 saniye sonra, aros, 10 dakika içinde pedin üzerine üç ila beş mikrolitre 0.05 ila 0.1 mikrometre polistiren boncuk pipetine sahip olacak ve platin bir pena ile boncukların üzerine hızlı bir şekilde beş ila 10 transgenik solucan yerleştirecektir, böylece etiketli nöronları kolayca görülebilir. Solucanlara zarar vermemek için, solucanların üzerine dikkatlice standart bir örtü kayışı yerleştirin.

Etrafta kaydırmak. Solucan slaydı artık taksonomileri gerçekleştirmek için hazırlanmıştır. Göz merceğini kullanarak, 100 kez objektif ile dört kat güç yeniden odaklama altında solucanları bulun, iletilen ışığı kapatın, floresansı açın ve kameraya giden optik yolu değiştirin.

Nöronu artı işaretlerinin üzerinde ortalamak için fareyi kullanın. Şimdi lazeri ayak pedalıyla ateşleyin. Doğru miktarda lazer gücü, nöronu bir veya iki darbede kesecektir.

Çok fazla lazer gücü, lazerin gücünü ayarlamak, zayıflatıcı plakayı hareket ettirmek için çevresel hasara neden olur veya solucanda bir delik açar. Lazer zayıflarsa, zayıflatıcı plaka konumu kesmeye devam edecek şekilde ayarlanabilir. Bununla birlikte, bu muhtemelen lazerin D hücresindeki dört 40'taki Kumar'ın doğru şekilde yapıldığında değiştirilmesi gerektiğinin bir göstergesidir.

Lazer taksotomisi, nöronda küçük bir kırılma oluşturur. Bazı durumlarda, yaralanma bölgesinin çevresinde küçük bir yara izi oluşabilir. Pratik olarak hayvan başına bir ila üç nöron kesilir, ancak teorik bir sınır yoktur.

Bittiğinde, solucanların agro gül pedi üzerinde kalmasına dikkat ederek, örtü kızağını doğrudan yukarı doğru hareketle çıkararak solucanları kurtarın. Kapak kaymasını kaydırarak çıkarmayın. Solucanların etrafındaki pedi kesmek için iğne burunlu forseps kullanın.

Pedi OP 50 içeren taze tohumlanmış bir NGM plakasına yerleştirin ve solucanları 10 mikrolitre steril M nine ile serbest bırakın. Ex otomy rejenerasyonundan sekiz ila 48 saat sonra bunu yapmak için değerlendirilebilir, sağlıklı solucanları üç ila beş mikrolitre polistiren boncuk üzerine yeniden monte edin ve nöronlarını kopmuş nöronlarda görselleştirin. Kesilen yerin distalinde bir nöronal güdük kalacaktır Hem distal hem de proksimal güdükler kesildikten sonra başlangıçta geri çekilir, ancak proksimal güdükten rejenerasyon beklenir.

Bir büyüme konisinin oluşumu için rejenerasyon puanlanabilir. Alternatif olarak, nörit uzunluğu izlenebilir ve tipik olarak GABA nöronlarının %60 ila %70'i arasında karşılaştırılabilir, kesildikten sonraki 24 saat içinde büyüme tarakları oluşturur. Lazer düzgün kesmiyorsa, bunun nedeni muhtemelen lazerin odak dışında olması veya boya hücresindeki boyanın değiştirilmesi gerekmesidir.

Ayrıca, solucanların hareket ettiğini fark ederseniz, bunun nedeni muhtemelen agros pedinin çok nemli olmasıdır. Bu sorunu aşmak için üzerlerine solucanlar yerleştirilmeden önce pedlerin yaklaşık 30 saniye bırakılması gerektiğini bulduk. Ek olarak, solucanları hareketsiz hale getirmek için daha küçük boyutlu mikro boncuklar kullanmayı deneyebilirsiniz.

Son olarak, aksonların boncuklu bir görünüme sahip olduğunu fark ederseniz, bunun nedeni muhtemelen agros pedinin çok kuru olmasıdır. Bu videoyu izledikten sonra, mikro nokta lazer sisteminin nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız. Taksotomi için solucanları monte edin, tek tek nöronları kesin ve sonraki rejenerasyonu değerlendirin.