C in vivo Lazer Axotomy elegans

Bu prosedürün genel amacı, CL nöronlarını in vivo ortamda bir lazerle hassas bir şekilde kesmektir. Bu işlem, taksotomi sisteminin kurulması ve lazerin gücünün hassas bir şekilde odaklanması, hizalanması ve ayarlanmasıyla gerçekleştirilir. Solucanlar bir mikroskop lamı üzerinde sabitlendiğinde, nöronları hassas uzamsal ve zamansal kontrolle kesilebilir.

Koparılan nöronların ne ölçüde yeniden oluştuğu, büyüme konilerinin puanlanması ve/veya nörit uzunluklarının izlenmesi yoluyla ölçülür. Bu tekniğin femtosaniye lazer gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, mikro nokta darbeli lazerin kurulumu ve bakımı kolay, maliyet etkin bir sistem olması ve çok çeşitli uygulamalara kolayca uyarlanabilmesidir; biz bu yöntemi tipik olarak GABA motor nöronlarının rejenerasyonunu incelemek için uygularız. Sistem ayrıca deri kası veya spesifik nöronal sinapslar gibi diğer hücre tiplerini ablate etmek için de kullanılabilir.

Bu yöntem, mikro nokta lazer sistemine ihtiyaç duyar. Lazer, bir bileşik mikroskobun epi-floresan portuna monte edilir ve hücrelerde kesilecek olan florofor ile eşleşen tek bir dikroik aynanın yanı sıra bir darbe üreteci ve lazeri çalıştırmak için bir ayak pedalı içerir. Mikroskop, en azından 100x 1.4 NA yağlı objektif ve 4x objektif ile donatılmış olmalıdır.

Joystick ile kumanda edilen motorlu bir sahneye sahip olun ve aydınlatma için bu sahneyi bir hava masasına monte edin. Işık kılavuzlu bir ışık kaynağı ve bir shutter mekanizması, mikro nokta lazerine bağlanmıştır. Shutter mekanizması, aydınlatma yoğunluğunu lazerden bağımsız olarak azaltmak için kullanışlıdır.

Bilgisayara bağlı olan bir kameranın en az 16 hertz kare hızına sahip olması ve düşük ışık koşullarında iyi çalışması gerekir. Bilgisayarın; nöronları görüntülemek, kamerayı yönetmek ve motorlu sahneyi kontrol etmek için Nikon elements gibi bir görüntüleme yazılımına ihtiyacı vardır. Sistem tamamen kurulduğunda, kullanıcı bir eliyle mikroskobu odaklayabilir, diğer eliyle sahneyi hareket ettirebilir, ayak pedalıyla lazeri etkinleştirebilir ve ekrandaki görüntüyü net bir şekilde görebilir.

Kum tanesi boyutundaki bir organizmadaki nöronları kesmek zorlayıcı olabilir. Bunu başarmak için lazerin üç boyutta da sıkıca odaklanması gerekir. İşleme Z düzlemini odaklayarak başlayın.

Daha hassas bir odaklama yapabilmek için lazeri zayıflatmak amacıyla nötr yoğunluk filtresi ND 16'yı içeri itin; ardından hem ND 16'yı hem de dört floresan ND filtresini itin. Sonrasında, anahtarı seçme konumuna getirerek mikro nokta lazerini tek darbeye ayarlayın ve ardından filtre tekerleğini uygun uzun geçiren bariyer filtresine getirin. Şimdi sahneye aynalı bir lam yerleştirin ve 4x objektif ile iletilen ışığı kullanarak lam üzerindeki pinhole deliklere odaklanın.

Odaklama yapıldıktan sonra, lama bir damla imersiyon yağı ekleyin ve 100x objektif ile iğne deliklerine yeniden odaklayın. Ardından, kamera şalterini ve lazer şalterini açmak için optik yol değiştirme kolunu kullanın. Hassas odaklama yapmakta zorlanıyorsanız, iğne deliğinin kenarlarının netleşmesi için iletilen ışık şiddetini azaltın.

Odaklamayı test etmek için ayak pedalını kullanarak lazeri ateşleyin. Z düzlemi düzgün şekilde odaklanmışsa, aynada küçük bir delik görünmelidir. Şimdi mikroskobu aynalı lamın düzleminin biraz üzerine odaklayın ve lazeri tekrar ateşleyin.

Bu işlem, ilk atıştan daha küçük bir delik oluşturmalı veya hiç iz bırakmamalıdır. Aynalı lamın altına odaklanıldığında da aynı sonuçlar görülmelidir. Ancak, daha büyük bir delik oluşursa, ablasyon kafasındaki odaklama halkasıyla lazeri yeniden odaklayın.

Son olarak, deliğin okülerdeki artı gösterge çizgileriyle hâlâ düzgün şekilde hizalı olduğunu doğrulayın. Düzenli kullanımda, Z düzlemi odağının ayarlanması nadiren gerekir. Lazeri XY düzleminde odaklamak için aynada başka bir delik açın ve ardından Nikon elements yazılımına erişin.

Edinme menüsünde canlı yakalama modunu başlatın. Ölçüm araç çubuğunda, ROI düzenleyiciyi seçin, çift haçlı araç seçeneğini belirleyin ve artı işaretini yeni deliğin merkeziyle hizalanacak şekilde sürükleyin. ROI'yi kaydet'e tıklayın ve ardından canlı yakalamaya devam etmek için düzenleyiciden çıkın.

Sahneyi fare ile kontrol etmek için fare XY ayarını etkinleştirin. Artık lazer odaklanmış durumdadır. Nötr yoğunluk filtrelerini orijinal konumlarına getirin ve gelecekteki kullanımlar için lazer darbelerini birden 10'a ayarlayın.

İlk olarak, M nine solüsyonu içerisinde %3'lük eritilmiş aros solüsyonu hazırlayın ve yaklaşık beş mililitresini 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü 55 ila 65 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve geri kalanını gelecekteki kullanımlar için saklayın. Şimdi, etiketlenmiş iki lam kullanın.

Solucanların yerleştirilebileceği bir tabla oluşturmak için bir çift temiz lamı bantla sabitleyin ve üzerine bir damla agaroz damlatın. 30 saniye sonra agaroz katılaştığında, tablanın üzerine pipetle 3 ile 5 µL arasında 0,05 ile 0,1 µm boyutunda polistiren boncuk ekleyin; 10 dakika içerisinde, etiketli nöronları kolayca görülebilecek şekilde 5 ile 10 adet transgenik solucanı platin bir iğne yardımıyla hızlıca boncukların üzerine yerleştirin. Solucanlara zarar vermemek için standart bir lamelle solucanların üzerini dikkatlice kapatın.

Sürükleyerek hareket ettirin. Solucan lamı artık taksonomik incelemelerin gerçekleştirilmesi için hazırdır. Oküler yardımıyla, dört kat güç altında solucanları bulun; 100 kat objektif ile yeniden odaklayın, iletilmiş ışığı kapatın, floresan ışığını açın ve optik yolu kameraya yönlendirin.

Nöronu artı işaretinin merkezine getirmek için fareyi kullanın. Şimdi ayak pedalıyla lazeri ateşleyin. Doğru lazer gücü, nöronu bir veya iki darbede kesecektir.

Çok yüksek lazer gücü, çevresel hasara yol açacak veya solucanda bir delik açacaktır; lazerin gücünü ayarlamak için atenüatör plakasını hareket ettirin. Lazer zayıflarsa, kesme işlemine devam edebilmek için atenüatör plakasının konumu ayarlanabilir. Ancak bu durum, genellikle lazerin D hücresindeki Kumar in four 40'ın değiştirilmesi gerektiğinin bir göstergesidir; işlem doğru şekilde gerçekleştirildiğinde.

Lazer taksotomisi, nöronda küçük bir kopuş oluşturur. Bazı durumlarda, yaralanma bölgesinin etrafında küçük bir skar oluşabilir. Pratik olarak hayvan başına bir ila üç nöron kesilmektedir, ancak teorik bir sınır yoktur.

İşlem tamamlandığında, kapak camını doğrudan yukarı doğru hareketle kaldırarak solucanları geri kazanın; solucanların agaroz ped üzerinde kaldığından emin olun. Kapak camını kaydırarak çıkarmayın. Solucanların etrafındaki pedi kesip çıkarmak için sivri uçlu pens kullanın.

Pedin, OP 50 içeren taze ekilmiş bir NGM plakasına yerleştirin ve solucanları 10 µL steril M9 ile serbest bırakın. Eksotomiden sonraki sekiz ila 48 saat arasında rejenerasyon değerlendirilebilir; bunun için sağlıklı solucanları üç ila beş µL polistiren boncuklar üzerine yeniden monte edin ve nöronları ile kesilmiş nöronları görüntüleyin. Kesim bölgesinin distalinde bir nöron kütüğü kalacaktır. Hem distal hem de proksimal kütükler kesildikten sonra başlangıçta geri çekilir, ancak proksimal kütükten rejenerasyon beklenir.

Rejenerasyon, büyüme konisi oluşumuna göre skorlanabilir. Alternatif olarak, nörit uzunluğu izlenebilir ve karşılaştırılabilir; tipik olarak GABA nöronlarının %60 ila %70'i kesildikten sonraki 24 saat içinde büyüme konileri oluşturur. Eğer lazer düzgün kesmiyorsa, bunun nedeni muhtemelen lazerin odak dışında olması veya boya hücresindeki boyanın değiştirilmesi gerekmesidir.

Ayrıca, solucanların hareket ettiğini fark ederseniz, bunun nedeni muhtemelen agroz pedinin çok nemli olmasıdır. Bu sorunu önlemek için solucanlar yerleştirilmeden önce pedlerin yaklaşık 30 saniye boyunca bekletilmesi gerektiğini saptadık. Ek olarak, solucanları hareketsiz hale getirmek için daha küçük boyutlu mikroboncuklar kullanmayı deneyebilirsiniz.

Son olarak, aksonların boncuklu bir görünüme sahip olduğunu fark ederseniz, bunun nedeni muhtemelen agar pedinin çok kuru olmasıdır. Bu videoyu izledikten sonra, mikro nokta lazer sisteminin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Taksonomi için solucanları sabitleyebilir, bireysel nöronları kesebilir ve sonrasındaki rejenerasyonu değerlendirebilirsiniz.