Name: Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Öğrenin, siRNA ile gen susturma ve canlı hücre kalsiyum görüntüleme kullanarak ER membran kaçak kanallarının düzenleyici mekanizmalarını inceleyin. Bu yöntem, kalsiyum sinyalinin hücresel işlevlerini anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SL, DFG (Lisansüstü Araştırma Okulu 845) bir burs ile desteklenmiştir. Bu çalışma, DFG (SFB 530/C1 967 İÇİN) hibe ve HOMFOR tarafından desteklenmiştir.

1. Stok çözelti hazırlanması <ol><li> Hazırlayın kalsiyum ücretsiz tampon (140 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES-KOH 10 mM glukoz, (pH 7.35)). </li><li> Çözünür Fura-2 1 mM stok solüsyonu elde etmek için DMSO'daki AM. Bir girdap kullanarak çözüm homojen açık sarı olana kadar karıştırın. Fincan ışıktan koruyun. Sulandırınız Fura-2 stok solüsyonu 1 ml Dulbecco'nun modifiye kartal orta (DMEM) HeLa hücrelerinde yükleme için 4 mcM bir final konsantrasyon% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin içeren içine. </li><li> Distile su (pH 7.0) 12.5 mM puromycin stok solüsyonu hazırlayın. -20 ° C'de saklayın alikot 500 mcM puromycin nihai konsantrasyonu kalsiyum ücretsiz tampon 12,5 mM puromycin stok solüsyonu sulandırınız. </li><li> 1 mM Stok çözelti elde etmek için DMSO'daki thapsigargin eritin. </li><li> 1 mg ophiobolin çözünür 20 ul kloroform ve daha sonra 25 ul DMSO ile karıştırın. Mikrosantrifüj tüp kloroform buharlaşıncaya kadar açık kalır. Böylece son ophiobolin konsantrasyonu 100 mM. -20 ° C'de saklayın alikot Önce, nihai konsantrasyonu 100 mcM kalsiyum ücretsiz tampon stok çözümler sulandırmak kullanmak. Böylece, canlı hücre görüntüleme için son DMSO konsantrasyonu% 0.1 aşmamaktadır. </li><li> -20 ° C'de 10 mM ve mağaza alikotları bir konsantrasyon DMSO'daki trifluoperazin çözülür Kalsiyum ücretsiz tampon kullanmadan önce 10 mcM bir final konsantrasyon stok solüsyonları sulandırınız. Ophiobolin A gibi canlı hücre görüntüleme Böylece son DMSO konsantrasyonu% 0.1 'den değildir. </li><li> 20 mcM stok solüsyonu hazırlamak için RNaz ücretsiz su siRNA'lar (SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR siRNA ve kontrol siRNA) çözülür. Bir vorteks ile karıştırın ve göz çözünürleştirme gözlemlemek. Mağaza 50 ul alikotları -20 ° C'de </li></ol> 2. HeLa hücreleri gen susturma ER Ca 2 + efflux belirli bir protein katkısı incelemek üzere, söz konusu genin iki farklı siRNA'lar (Şekil 1) ile verimli bir şekilde susturulur. Buna ek olarak, susturma etkisi ilgili vahşi tip genin ifade üstesinden gelinmesi gerekir. Genelde biz sırasıyla faiz gen kodlama ve kodlama olmayan (UTR) bölgesinde, yöneltilen siRNA'lar kullanın. UTR yönettiği siRNA istihdam tamamlama için uygun bir yol sağlar. <ol><li> Tohum 5.2 x 25 mm kapak kayma (poli-L-lisin (1 mg / ml) 200 ul 1 saat önceden tedavi) ile 6 cm kültürü çanak, 10 5 HeLa hücrelerinde (ATCC yok. CCL-2 ) Dulbecco'nun modifiye kartal (DMEM) orta,% 5 CO 2 (son hacim 3.9 ml) ile nemlendirilmiş bir ortamda% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 37% 1 penisilin / streptomisin ve inkübe ° C içeren. </li><li> SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR siRNA, ya da üreticinin talimatlarına (20 nM siRNA final konsantrasyon) göre HiPerFect Reaktif kullanarak bir negatif kontrol siRNA hücreleri Transfect . Kısaca, gerçek transfeksiyon prosedürü önce, ayrı bir mikrosantrifüj tüp içinde taze siRNA'lar hazırlayın: OptiMEM 80 ul çözünmüş her siRNA 4 ul (20 mcM) 20 ul HiPerFect transfeksiyon reaktif ekleyin. Bu karışımı hafifçe vortekslenmiş ve 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. SiRNA karışımlar (104 ul) numaralı seribaşı 5.2 x 10 5 HeLa hücreleri (3.9 ml) damla damla ekleyin. </li><li> 24 saat sonra, orta (3,9 ml) ve aynı siRNA karışımı (104 ul) ile ikinci kez hücreleri transfect. </li><li> Western Blot analizi ile susturma değerlendirin. % 80 üzerinde olmalıdır. Hücre kültürü çanak hücreleri yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS) ve DMEM onlara hasat. Kontes Otomatik Hücre Sayıcı istihdam hücreleri saymak. Proteaz inhibitörü (3 mg / ml Pepstatin A, 3 mikrogram / ​​kokteyl ile desteklenmiş (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 3 mM MgCl 2,% 0,5 NP40) hücrelerin hücre lizis tamponu Lyse ml Leupeptin, 3 mg / ml Antipain, 3 mg / ml Chymastatin) SDS-örnek tamponu (ile karıştırın ve 60 mM Tris-HCl, pH 6.8,% 2 SDS,% 10 gliserol,% 5 β-mercaptoethanol,% 0.01 'mavi bromphenol ) 10.000 hücre / ml son bir konsantrasyon elde etmek için. Isı örnekleri 56 ° C de 15 dakika ve daha sonra, parça DNA bazı cam boncuklar ve 20 dakika için vorteks ekleyin. Laemmli-tipi SDS-PAGE (genellikle ayıran jel polyacrylamid% 15) tarafından her bir numune ayrı ayrı 20 ul. ("Islak-leke") transfer tamponunda 3 saat veya gece boyunca (100 mM Glycin, 12,5 mM Tris-HCl) 400 mA sabit electroblotting PVDF membran ayrılmış proteinler aktarın. Daha sonra, sonra% 5 (w / v) oda sıcaklığında 30 dakika PBS, düşük yağlı kuru süt ve blok tavşan Sec61α C-terminus yöneltilen birincil antikor leke ortaya çıkarmak ve bir anti-β-aktin- fareden antikor. PBS-TritonX-100 (% 0.05) leke yıkayın ve tsırasıyla, 5 dakika süreyle PBS içinde WICE. Primer antikor görselleştirin ECL Plex keçi anti-tavşan IgG-Cy5 veya ECL Plex keçi anti-fare IgG-Cy3-konjuge ve Resim Quant TL yazılımı 7.0 ile birlikte Typhoon-Trio görüntüleme sistemi. SEC61A1 gen durumda, maksimum susturulması etkisi genellikle 96 saat sonra ilk transfeksiyon görülür. Bir temsilci deneyi Şekil. 2. </li></ol> 3. HeLa hücreleri, tamamlama SEC61A1 sessizliğini fenotip kurtarmak için, SEC61A1 cDNA bir pCDNA3 iç ribozomal giriş sitesinin çoklu klonlama sitesi (MCS) (IRES) GFP-vektör sitomegalovirüs (CMV) organizatörü, MCS, içerdiği yerleştirildi IRES, artı, yeşil fluoresan protein (GFP) kodlama dizisinde. <ol><li> Ilk siRNA transfeksiyon sonra 48 saat, döviz ikinci kez orta (3,9 ml) ve üretici protokolü (Fugene HD vektör son oranı olan 4 mg göre Fugene HD kullanarak boş vektör veya plazmid SEC61A1 ifade ya da hücrelere dönüşümü 16 ul Fugene HD vektör). Kısaca, dönüşüm işlemi önce, ayrı bir mikrosantrifüj tüp içinde taze plazmid hazırlamak: OptiMEM 80 ul çözülür her plazmid 4 mg 16 ul Fugene HD dönüşüm reaktif ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında yavaşça girdap bu karışımı ve kuluçkaya yatmaktadır. 5.2 numaralı seribaşı damla damla plazmid karışımı (0.1 ml) x 10 5 HeLa hücreleri (3.9 ml) ekleyin. </li><li> Plazmid ifade, kalsiyum görüntüleme ve hasat öncesi floresan mikroskopi tabi kültür kaplarına 48 saat sonra. Gerekirse daha iyi floresan sinyalleri için PBS tarafından DMEM yerine. Soğutmalı CCD kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop floresan görüntüleri kaydedin. Dönüşüm verimliliği aydınlık modunda sayılır ve% 80 üzerinde olmalıdır hücreleri tarafından GFP floresan görüntüleyen hücrelerinin sayısına bölünmesi ile tespit edilebilir. Tipik bir sonuç Şekil gösterilir. 3. </li></ol> 4. Canlı hücre kalsiyum görüntüleme <ol><li> Ölçümü, önce 3,5 cm ayrı bir kültür çanak transfekte HeLa hücreleri ile kaplı kapak kayma aktarın. Fura-2, 25 ° C karanlık 11,12 45 dakika için 1 ml DMEM AM 4 mcM hücreleri yükleyin . </li><li> Fix iMic metal odası, 25 mm kapak kayma ve hücreleri iki kez yıkayın ve kalsiyum ücretsiz tampon (her seferinde 300 ul) kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Polikrom V ile 340 nm ve 380 nm dönüşümlü heyecan verici bir iMic mikroskop veri toplama ve 510 nm (:; yayıcı, 605/70 nm ışın dağıtıcı, 565 nm Filtre seti) yayılan floresan ölçüm başlayın. Her 3 s. 20-50 hücre / çerçeve içeren örnek resimleri Tutanak Fura-F340 ve F380, sırasıyla 340 ve 380 nm arka plan çıkarılır floresan karşılık oranları F340/F380, 2 sinyal. </li><li> 1 dakika sonra, kalsiyum ücretsiz tampon ya da aynı tamponu ile puromycin ile hücre tedavisi (500 mcM). Alternatif olarak, küçük bir molekül inhibitörü (10 mcM trifluoperazin veya 100 mcM ophibolin A) ile veya kalsiyum ücretsiz tampon ile hücre tedavisi. </li><li> 2 ya da 10 dakika süreyle oranlı metrik ölçümleri gerçekleştirilmektedir sonra, thapsigargin eklemek (1 mcM) ve ölçümler devam etmektedir. </li><li> Sonunda, cytoslic [Ca 2 +] oranı ölçümleri kurulmuş bir kalibrasyon yöntemi ile tahmin edilmektedir. 2 Excel 2007 ve Menşe 6.1 veri analiz. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Şimdiye kadar, SEC61A1 gen susturulması kalsiyum etkileyip etkilemediğini soru (Ca 2 +) ER (Şekil 1) kaçak ele aldı. SEC61A1 gen 96 saat için HeLa hücrelerinde iki farklı siRNA'lar tarafından susturuldu. Hücre büyümesi ve canlılığı pek etkilenmez susturma, yarı-permeabilize hücrelerinin ER içine protein taşıma neredeyse tamamen inhibe olmuştur. Ayrıca, SEC61A1 susturuldu hücreleri ER Ca 2 + kaçağı açısından ciddi etkilendi. SEC61A1 gen ekspresyonu ile gen susturma etkisi tersine dönmüştür. Böylece, tüm çekirdekli hücreleri ER membran bulunan Sec61 kompleksleri Ca 2 + homeostazı çok önemli bir rol oynaması bekleniyor olabilir Ca 2 + kaçak kanal oluşturur. Ancak, ER membran Sec61 kompleksleri oluşan kontrolsüz iyon geçirgenliğini, su dolu geniş gözenekler varlığı, ciddi Ca 2 + ER lümenine sitoplazmada, hücre içi için önemli bir mekanizma içine düzenlenmiş bir sürümü ile müdahale . sinyalizasyon. Biz memeli Sec61α sitozolik N-terminalindeki bir kalmodulin (CAM) bağlayıcı motifi tespit bağlı CaM ama Ca 2 +-nanomolar yakınlık ve sırası özgüllüğü ücretsiz apocalmodulin değil. Hücresel düzeyde, iki farklı CaM antagonistleri Ca uyarılmış (Şekil 4 ve 5) yokluğunda varlığında ER bırakın. İkincisi Sec61 kanallar Sec61α IQ motifi mutasyonlar içerdiği olduğu görülmemiştir. Böylece, Ca 2 +-CaM Ca 2 sınırlayıcı + sızıntı ER (Şekil 6) yer almaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Akış şeması. Ayrıntılar için metne bakınız. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 verimliliği susturmak için veri analizi. Susturma (yükleme) Sec61α ve β-aktin yöneltilen antikorlar kullanılarak Western-blot analizi ile değerlendirildi. Primer antikor ECL Plex sekonder antikorlar ve floresan görüntüleme kullanılarak görüntülendi. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 transfeksiyon verimliliği için Veri analizi. Görüntüler soğutmalı CCD kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop kaydedildi. Dönüşüm verimliliği aydınlık modunda sayılan hücreleri tarafından GFP floresan görüntüleyen hücrelerinin sayısına bölünmesiyle tespit edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> HeLa hücrelerinin canlı hücre kalsiyum görüntüleme veya SEC61A1 siRNA ve CaM-antagonist ophiobolin A. HeLa hücrelerinde varlığı ya da yokluğu varlığı Şekil 4 Ekran görüntüleri SEC61A1 (B) veya yöneltilen siRNA ile tedavi edildi negatif kontrol siRNA (A) 96 saat olarak belirtilmiştir. Bu hücreler, kalsiyum göstergesi Fura-02:00 ile yüklenen ve Ca 2 inkübe + buffer sonra 0.5 mM EGTA, tampon ya da ophiobolin (Ophio A) içeren ücretsiz tampon eklenir ve inkübasyon devam etti. 10 dakika sonra, Ca 2 + serbestleşmesi, dış Ca 2 yokluğunda thapsigargin (TG) uygulanarak başlandı + ve inkübasyon devam edildi. Belirtilen zamanlarda sürekli kalsiyum görüntüleme ekran görüntüleri alınmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5, canlı hücre kalsiyum görüntüleme deneyleri için Veri analizi . (A) Şekil tasvir gibi bir dizi deneyler Kinetik ve kantitatif analiz. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] kurulmuş bir kalibrasyon yöntemi 2 oranı ölçümlerinden tahmin edilmiştir. Thapsigargin etkisi bar diyagram olarak gösterilmiştir. (BD) Hücreler 48 saat süreyle kontrol siRNA veya belirtilen SEC61A1-siRNA ile tedavi edilen ve daha sonra kontrol vektörü (C), ya da plazmid SEC61A1 ifade (C), ya da belirtildiği gibi plazmid mutant SEC61A1 ifade (D) ya ile dönüştürülmüş. Olarak Şekil 4 ve 5a sonra 48 saat, kalsiyum görüntüleme deneyleri yapılmıştır. Sitozolik Ca 2 değişiklik istatistiksel analizi +, A gösterildiği sunulan gibi deneylerde thapsigargin eklenmesinden sonra konsantrasyon . P değerleri &lt;0.001 anlamlı olarak eşleştirilmemiş t testi ile belirlendi ve üç yıldız işaretleri (***), NS, anlamlı değil gösterilir. Incelendi hücrelerin numaraları gösterilir. Ortalama değerler verilmiştir, hata çubukları standart hata (SEM) temsil eder. Biz bu örnekleri ref adapte olduğunu unutmayın. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 Bu veriler Sec61 kompleksi doğmakta olan zincirler serbest bırakılması gerçekten ER ve Sec61 kompleks sitozolik ağız çevresinde bir kalsiyum nanodomain oluşumu kalsiyum salınımını yol açtığını göstermektedir. Bu kalsiyum kalmodulin bağlı ve kalsiyum kalmodulin Sec61 kompleksi kapanır. "

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+physiological+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li>
<li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li>
<li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li>
<li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum%3A+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li>
<li>Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+release+via+the+ER+translocon+activates+store+operated+calcium+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry.</a> Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).</li>
<li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocon+closure+to+Ca2%2B+leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).</li>
<li>Tu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilins+form+ER+Ca2%2B+leak+channels%2C+a+function+disrupted+by+familial+Alzheimer%27s+disease-linked+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations.</a> Cell. 126, 981-993 (2006).</li>
<li>Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiP+maintains+the+permeability+barrier+of+the+ER+membrane+by+sealing+the+lumenal+end+of+the+translocon+pore+before+and+early+in+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation.</a> Cell. 92, 747-758 (1998).</li>
<li>Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li>
<li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Ca2%2B+signalling+by+Na%2B%2FCa2%2B+exchangers+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li>
<li>Gross, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC5+is+a+Ca2%2B-activated+channel+functionally+coupled+to+Ca2%2B-selective+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels.</a> J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).</li>
<li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2%2B+leakage+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li>
</ol>

Memeli hücrelerinde, endoplazmik retikulum (ER), proteinin biyogenezi yanı sıra kalsiyum sinyalizasyonu önemli bir rol oynar. Burada, bize, doğrudan bir potansiyel Ca 2 + kaçak kanal rolü adresi ve varsayılan düzenleyici mekanizmalar 13 karakterize sağlayan deneysel bir sistemi tarif var . Bu deneysel sistem bu pasif Ca 2 + efflux sınırı protein ve mekanizmalar karakterize, çeşitli hücre tipleri, ii ER pasif Ca 2 + efflux farklı ER membran proteinlerinin katkısı) değerlendirmek i) bize eşsiz fırsatlar verir ve iii) ilgili bileşenleri hastalık bağlantılı mutasyonların etkilerini incelemek. Biz sadece canlı hücreler analiz edilmelidir notu ve bu genel canlılığı% 80 üzerinde olmalıdır. Bu nedenle, hücre canlılığı rutin üreticinin protokole göre, Nükleer-ID mavi / yeşil hücre canlılığı reaktifi istihdam değerlendirilir. Ayrıca, değişikliklerin sitozolik Ca 2 + konsantrasyonu istatistiksel analiz zorunludur. Bu nedenle, deneyler en az 20 hücre, her durum için tek bir deneyde analiz edilmesi gereken hücre dört farklı gruplar ve iki lamelleri yapılmalıdır. Biz kapak fişleri tohumlama sonra aynı zamanda çeşitli deneyler yapılmalıdır olduğuna dikkat edin.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> DMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> Nükleer-ID Mavi / Yeşil hücre canlılığı reaktifi </td><td> Enzo Yaşam Bilimleri </td><td> ENZ-53.004 </td></tr><tr><td> Fura-02:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> Ophiobolin A </td><td> Enzo Yaşam Bilimleri </td><td> ALX-270-109 </td></tr><tr><td> Trifluoperazin </td><td> Sigma </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> Kontes ® Otomatik Hücre Sayıcı </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon-Trio görüntüleme sistemi </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> DS-5MC kamera ile TE2000-S mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td></tr><tr><td> polikrom V ile iMic mikroskop </td><td> Fotonik Kadar </td><td></td></tr></tbody></table>

canlı hücre kalsiyum görüntüleme sirna aracılığı ile gen susturma ile birlikte ca tanımlar 2 + er membran kaçak kanallar ve düzenleme mekanizmaları

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Memeli hücrelerinde, endoplazmik retikulum (ER), proteinin biyogenezi yanı sıra kalsiyum 1 sinyalizasyon önemli bir rol oynar . ER membran heterotrimeric Sec61 kompleksi ER lümenine yeni sentezlenmiş polipeptitler için sulu bir yolunu sağlar. Son çalışmalar çeşitli laboratuvarlarda bu heterotrimeric kompleksi de geçici Ca 2 + kaçak kanalları 2-8 oluşabilir önerdi. Bu kavram için en önemli gözlem, doğmakta olan polipeptidlerin bu sürüm puromycin Ca 2 + ER geçici serbest bırakmak için neden ribozom ve Sec61 karmaşık oldu . Ayrıca, ER luminal protein BIP Sec61 karmaşık 9,10 düzeyinde iyon geçirgenliğini önlemede katkısı olduğunu in vitro olarak gözlenmiştir vardı. Biz, bize doğrudan potansiyel Ca 2 + kaçak kanal olarak Sec61 kompleksinin rolü ele almak ve onun varsayılan düzenleyici mekanizmaların 11-13 karakterize sağlar deneysel bir sistem kurduk . Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca 2 + görüntüleme 13 birleştirir. Hücreler, kodlama ve çevrilmemiş bölge (UTR), sırasıyla, SEC61A1 gen ya da negatif kontrol siRNA yöneltilen siRNA&#39;lar ile tedavi edilir . Tamamlama analizde, hücreler wild tip SEC61A1 gen siRNA dayanıklı ifade sağlayan bir IRES-GFP vektör ile ortak transfekte vardır. Ardından hücreler değişiklikleri eşzamanlı olarak sitozolik Ca 2 + konsantrasyonunun bir floresan mikroskop aracılığıyla hücrelerinin sayısı izlemek için oranlı metrik Ca 2 + göstergesi Fura-2 ile yüklenir. Puromycin, küçük molekül inhibitörleri ve thapsigargin gibi çeşitli ajanların etkisi, Ca 2 + kaçak değerlendirilmesi sitozolik Ca 2 +, aynı zamanda sürekli ölçüm sağlar. Bu deneysel sistem bu pasif Ca 2 + efflux sınırı protein ve mekanizmalar karakterize, çeşitli hücre tipleri, ii ER pasif Ca 2 + efflux farklı ER membran proteinlerinin katkısı) değerlendirmek i) bize eşsiz fırsatlar verir ve iii) ilgili bileşenleri hastalık bağlantılı mutasyonların etkilerini incelemek.

Endoplazmik retikulum, protein biyogenezi ve kalsiyum homeostazında önemli bir rol oynar. Biz, bize Ca2 + kaçak kanal rolü ele almak ve kendi varsayılan düzenleyici mekanizmaların karakterize sağlayan deneysel bir sistem kurduk. Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca2 + görüntüleme içerir.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

Memeli hücrelerde, endoplazmik retikulum (ER), kalsiyum sinyallemesinin yanı sıra protein biyogenezinde de temel bir rol oynar1. Heterotrimerik Sec61...

Memeli hücrelerde, endoplazmik retikulum veya ER, protein biyogenezi ve kalsiyum sinyal yolaklarında önemli bir rol oynar. ER membranındaki heterotrimerik Sec61 kompleksi, yeni sentezlenen polipeptitlerin ER lümenine girmesi için sulu bir yol sağlar. Güncel veriler, Sec61 kompleksinin potansiyel bir kalsiyum sızıntı kanalı olarak rolünü doğrudan incelemek adına, geçici kalsiyum sızıntı kanalları da oluşturabileceğini göstermektedir.Tahmini düzenleyici mekanizmalarını karakterize etmek için hücreler, öncelikle sex 61 A one genine yönelik siRNA'lar ile işleme tabi tutulur. Komplementasyon analizinde hücreler, wild type sex 61 A one geninin siRNA'ya dirençli ekspresyonuna olanak tanıen bir iris GFP vektörü ile birlikte transfekte edilir. Ardından hücreler, rasyometrik kalsiyum indikatörü RO two ile yüklenir ve sitozolik kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler floresan mikroskobu aracılığıyla izlenir.Kalsiyum seviyeleri ölçülürken, kalmodulin antagonistleri ve fablar argon gibi çeşitli ajanların kalsiyum sızıntısı üzerindeki etkisini değerlendirmek için solüsyon değişimleri gerçekleştirilir. Elde edilen görüntülerin kantitatif analizi, sex 61 A one susturulmasının tetiklediği kalsiyum F akışındaki değişimleri ortaya koymaktadır. Bu videoda, prosedürün gösterilmesi ve sonuçların sunulmasının ardından, sex 61 A one'ın kalsiyum F akışındaki rolüne ilişkin bir model sunulacaktır.Bu tekniğin, düzlem lipid biyomembran deneyleri veya tek kanallı ölçümler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, aday membran proteinlerinin doğal ortamında ve zahmetli saflaştırma ile genellikle verimsiz olan fonksiyonel yeniden yapılandırma işlemlerine gerek kalmadan analiz edilebilmesidir. Bu yöntem, kalsiyum sinyalizasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, farklı hücre tiplerinde belirli bir ER membran proteininin ER'den kalsiyum akışına katkısı nedir ve bunlar nasıl kontrol edilir? Prosedürü uygulamak için laboratuvarlarımızdan iki yetenekli lisansüstü öğrenci olan sway long ve NICO görev alacaktır. Kullanılacak solüsyonları ve reaktifleri hazırlayarak işleme başlayın. İlk olarak, beraberindeki yazılı protokoldeki talimatlara uygun olarak kalsiyum içermeyen tamponu hazırlayın.Ardından, kalsiyum indikatörünün stok çözeltisini seyreltin. %10 FBS ve %1 penisilin streptomisin içeren bir mililitre DMEM içinde nihai konsantrasyonu dört mikromolar olacak şekilde seyreltin; kalsiyumsuz tampon içinde bir milimolar Apso Garin stok çözeltisini nihai konsantrasyonu üç mikromolar olacak şekilde seyreltin. Ayrıca, belirli bir siRNA'nın hedef dışı etkilerini inceleme riskini azaltmak için 200 mikromolar olein A ve 20 mikromolar hazır bulundurun. Transfeksiyon prosedürünün olası yan etkilerini değerlendirmek için her geni susturmak amacıyla iki farklı siRNA kullanılır.Rastgele nükleotid dizilerinden oluşan negatif kontrol siRNA'lar, deneysel siRNA'lar ile paralel olarak transfekte edilir. siRNA aracılı susturmanın etkisinin, vahşi tip CD NA ekspresyonu ile geri döndürülebilmesi önemlidir. Bu nedenle, deneyde kullanılan siRNA'lar, kurtarma plazmidinin siRNA'lardan etkilenmeyeceği şekilde özel olarak seçilir. Bu deneyde siRNA'lar, ilgilenilen genin hem kodlayan hem de kodlamayan bölgesine veya UTR olarak kısaltılan çevrilmeyen bölgesine yöneliktir.siRNA'lar UTR kurtarma işlemine yönlendirildiğinde, HeLa hücrelerinde transfeksiyona gerçekleştirmek için endojen UTR içermeyen plazmitler kullanılabilir. Her bir transfeksiyon için altı santimetrelik bir hücre kültürü kabına 25 milimetrelik poli-L-lizin kaplı bir lam yerleştirerek hücreleri transfeksiyona hazırlayın; bir saat sonra, her bir kaba 5,2 × 10⁵ HeLa hücresi ve takviye edilmiş DMEM ekleyin. Hücreleri transfekte etmek için bir mikro santrifüj tüpünü etiketleyin.Her bir transfeksiyon reaksiyonu için her tüpe, 80 µL optimum medium içerisinde çözünmüş 20 µM S irna'dan dört µL ekleyin; SEC61A1, SEC61A1 UTR ve negatif kontrol irna her tüp için hazırlanır. 20 µL hyperfect transfeksiyon reaktifi ekleyip hafifçe vorteksleyin, ardından reaksiyonları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hücreleri transfekte etmek için, toplam 104 µL olan irna karışımını çökmüş HeLa hücrelerine damla damla ekleyin ve transfeksiyon komplekslerinin homojen dağılımını sağlamak için kabı hafifçe dairesel hareketlerle sallayın.%5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir ortamda 37 derece Celsius'ta inkübe edin. 24 saat sonra, medyumu 3,9 mililitre taze medyum ile değiştirin. Ardından, transfeksiyon verimliliğini artırmak için transfeksiyonu ikinci kez gerçekleştirin; susturmayı değerlendirmek için aynı irna karışımını kullanarak western blot analizi yapın.Susturma oranı, burada sex 61 A bir için gösterildiği gibi %80'in üzerinde olmalıdır. Maksimum susturma etkisi tipik olarak ilk transfeksiyondan 96 saat sonra görülür; sex 61 susturulması sonucu ortaya çıkan fenotipi kurtarmaya yönelik hazırlıklar ilk transfeksiyondan 48 saat sonra yapılır. Yeni bir mikro santrifüj tüpünü etiketleyerek başlayın.Her bir reaksiyon için hücreler, boş vektör veya wild type sex. 61 A one ekspresyon plazmidi ile transfekte edilecektir. Burada kullanılan wild type ekspresyon plazmidi, sex 61 A one cDNA'sının bir pcd'nin çoklu klonlama bölgesine yerleştirilmesiyle oluşturulmuştur.Sitomegalovirüs promotörünü, iris'i ve yeşil floresan protein kodlayan diziyi içeren üçlü internal ribozomal giriş GFP vektörü. Her tüpe 80 µL optimum içinde çözünmüş her bir plazmidden 4 µg ekleyerek transfeksiyon reaktifini hazırlayın. Ardından buna 16 µL FU gene HD transfeksiyon reaktifi ekleyin, bu solüsyonu hafifçe vorteksleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.Ardından besiyeri değişimini yaptıktan sonra, plasmid karışımını ekilmiş 5.2 × 10⁵ HELI hücrelerine damla damla ekleyin ve transfeksiyon komplekslerinin homojen dağılımını sağlamak için kabı nazikçe dairesel hareketlerle sallayın. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2 ortamına yerleştirin ve 48 saat daha inkübe edin. Transfeksiyon verimliliğini belirlemek için GFP ekspresyonunu floresan mikroskobu ile değerlendirin.48 saat sonra, hücrelerin en az %80'i transfekte edilmiş olmalıdır. Görüntüleme öncesinde, transfekte edilmiş HeLa hücrelerini içeren lamelleri bir pens yardımıyla yeni bir 3,5 centimeter hücre kültürü kabına aktarın ve üzerine dört micromolar içeren bir milliliter DMEM ekleyin.Karanlıkta, 25 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin. Görüntüleme yapmak için, en az iki yüklü hücre içeren lamelini metal bir kayıt odasına aktarın ve odanın iki parçasını birbirine vidalayarak sabitleyin. Hücreleri yıkamak için bir pipet kullanarak üzerlerine 300 µL kalsiyumsuz tampon ekleyip geri alın.Ardından işlemi tekrarlayın ve kayıt haznesini polikrom beş krematörlü bir I MIC mikroskobuna yerleştirin. FU A iki'nin kalsiyumdan bağımsız floresansını tahmin etmek amacıyla, URA iki için uygun bir filtre seti kullanarak en az 20 hücre içeren bir alan bulun. Bu adımda kullanılan eksitasyon dalga boyu 360 nanometredir.Uygun bir alan seçildikten sonra, görüntüleme yazılımını 340 nanometre ve 380 nanometre dalga boylarında uyaracak ve her üç saniyede bir 510 nanometre dalga boyundaki emisyon floresansını ölçecek şekilde ayarlayın; burada gösterilen düzenek için floresans yoğunluklarını yaklaşık 1000 keyfi birim üretecek şekilde pozlama süresini belirleyin. Beş milisaniyelik bir pozlama süresi ayarlanmıştır. Ayrıca, hücre içermeyen bir arka plan bölgesi ve 20 adede kadar hücre konturu için ilgi bölgelerini veya ROI'leri işaretleyin.Deney devam ederken canlı hücre görüntülemeyi başlatın; sistem, en az iki sinyal için rasyometrik görüntülerin yanı sıra, her bir işaretli ROI için gerçek zamanlı F340/F380 oranlarını bir çizgi grafik olarak sunacaktır; burada F340 ve F380, sırasıyla 340 ve 380 nanometrelerdeki ROI'ler içindeki floresan yoğunluklarına karşılık gelmektedir. Bir dakika sonra, farklı deneysel parametreleri test etmek için görüntüleme haznesine test çözeltileri ekleyin. Bu deneylerde, rasyometrik ölçümler ek olarak 10 dakika boyunca gerçekleştirildikten sonra Calmodulin antagonisti trifluorin ve bollin A test edilir.CAL modüler antagonistleri için DSA gargan ekleyin ve ölçümlere devam edin. Deney başına 400 çift görüntü kaydedin. Görüntüler toplandıktan sonra, görüntüleri inceleyin ve her görüş alanı için en az 20 hücrenin ROI'lerini işaretleyin.Ardından, bir dizi arka planı çıkarılmış oran görüntüsü ve arka planı çıkarılmış kalsiyum oran kinetiğini gösteren bir grafik oluşturmak için yazılımdaki kinetik analiz seçeneğini kullanın. Son olarak, her bir ROI için verileri yerleşik bir kalibrasyon yöntemi kullanarak Excel ve Origin'e aktarın. sex 61 A one geninin ER'den kalsiyum sızıntısını etkileyip etkilemediğini incelemek için sitozol kalsiyum konsantrasyonu oran ölçümlerinden hesaplanabilir.Sex 61 A1 geni, iki farklı RNA ile susturulmuş ve HeLa hücrelerinde 96 saat boyunca tutulmuştur. Susturma işlemi, burada gösterildiği gibi benzer hücre sayılarının üç tekrarlı Western blot analizi ile değerlendirilmiştir; birinci şeritten üçüncü şeride kadar güçlü bir 61 alfa sinyali görülürken, 61 A1 susturulmuş hücrelere karşılık gelen dördüncü şeritten altıncı şeride ve yedinci şeritten dokuzuncu şeride kadar olan bölümlerde belirgin şekilde daha zayıf bir sinyal görülmektedir. Sonuçları nicelleştirmek için sex 61 alfa sinyalleri beta aktin sinyallerine göre normalize edilmiş ve ER kalsiyum akısındaki kalmodulin rolünü test etmek için %80'in üzerinde susturma sağlanmıştır.Calmodulin antagonisti Bollin A'nın varlığında veya yokluğunda, Bollin A ile işlem görmüş HeLa hücrelerinin URA iki görüntülemesi gerçekleştirilmiştir. Bu video, Bollin A ile işlem görmüş kontrol hücrelerini göstermektedir; kalsiyum salınımı, Bollin A uygulamasından 10 dakika sonra, burada görülebileceği gibi dış kalsiyum yokluğunda ER'den kalsiyum salınımını açığa çıkaran bir SERCA inhibitörü olan thapsigargin uygulanarak başlatılmıştır.FSA argon eklenmesi, er'den kalsiyum F akışına işaret eden geçici ancak anlamlı bir floresans artışına yol açmıştır. Buna karşılık, PHE kemiğinde, A ile işlem görmüş cins 61 A bir sessiz hücrelerde FSO garin eklenmesini takiben gerçekleşen kalsiyum F akışı, burada görülebileceği üzere çok daha az belirgindir. Bu fark, bir dizi filmde zamanla tahmini sitozol kalsiyumunu gösteren bu diyagramda açıkça görülebilir; burada gösterilen kantitatif sonuçlar, bu sütun diyagramında görülebileceği üzere, offi bolin A varlığında thic argon yanıtı olarak kontrol hücrelerinde artan kalsiyum flx değerlerini doğrulamaktadır.Aynı fenomen, ikinci bir cam antagonisti triazin için de gözlemlenmiştir. Bununla birlikte, hücrelerden iki sex. 61 A one spesifik siRNA'larından herhangi biriyle sex 61 kompleksi tüketildiğinde, cam antagonistlerinin etkileri görülmemiştir. sex 61 A one susturulmuş hücreler sex ile transfekte edildiğinde, bu fenotipin kısmi bir kurtarılması görülebilir.Burada görülebileceği üzere, 61 a one ekspresyon plazmidi kullanılmıştır. Cal Modin agonistlerine yanıt olarak gelişen kalsiyum akışı, irna duyarsız yabanıl tip plazmid transfeksiyonu ile kısmen geri kazanılmıştır. Bu sonuçlar, hücrelerdeki ER kalsiyum akışının kısıtlanmasında Cal Modlin'in sex 61 kompleksi düzeyinde rol oynadığını göstermektedir.Eğer öyleyse, Calmodulin bağlanma bölgesinde çift mutasyona sahip Sec61$\alpha$1 geninin transfeksiyonu, siRNA ile indüklenen fenotipi düzeltmemelidir. Nitekim, hücreler IQ motifinde çift mutasyon içeren bir Sec61$\alpha$1 ekspresyon plazmidi kullanılarak transfekte edildiğinde, fenotipte herhangi bir düzelme görülmemiştir. Bu veriler, yeni sentezlenen zincirlerin Sec61 kompleksinden salınmasının gerçekten de ER'den kalsiyum salınımına ve Sec61 kompleksinin sitozolik ağzı çevresinde bir kalsiyum nano alanının oluşumuna yol açtığını göstermektedir.Bu kalsiyum Cal Moulin tarafından bağlanır ve kalsiyum Cal Moulin, sex 61 kompleksini kapatır. Bu videoyu izledikten sonra, bu prosedürü takip ederek insan hücrelerinde siRNA aracılığıyla gen susturmanın yaşam süreli kalsiyum görüntüleme ile nasıl birleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İlgili bileşenlerdeki hastalıkla ilişkili mutasyonların potansiyel etkisi gibi ek soruları yanıtlamak için, hastalıkla ilişkili mutasyonlar içeren cDNA'ların ekspresyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Ve tekrar belirtelim ki, tap gibi ilaçlarla çalışmak son derece tehlikeli olabilir; bu nedenle, bu prosedür gerçekleştirilirken eldiven kullanımı gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

live-cell-calcium-imaging-combined-with-sirna-mediated-gene-silencing

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme (TED) floresan görüntüleme ile hücre içi kalsiyum deposu dinamiklerinin analizini destekler. Yöntem sentetik düşük afinite Ca yerel maskesinin geliştirir endoplazmik retikulum (ER), bir rekombinant karboksilesteraz hedeflenmesi...

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Burada, Ca2+ göstergeleri ile yüklü sağlam memeli hücrelerinde floresan mikroskobu kullanarak yerel IP3 aracılı Ca2+ olaylarını görüntüleme tekniklerini ve bu olayların tanımlanmasını ve analizini otomatikleştiren bir algoritma sunuyoruz.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Endoplazmik retikulum kalsiyum homeostazı çeşitli patolojilerde bozulur.  ER kalsiyum deposundaki bozulmaları tespit etmek için salgılanan bir ER kalsiyum izleme proteini (SERCaMP) raportörü kullanılabilir.   Bu protokol, ER kalsiyum homeostazını in vitro ve in vivo olarak incelemek için bir Gaussia lusiferaz SERCaMP'nin kullanımını açıklar.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

HEK293'ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + 'ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır.

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensör Catcher<sup&gt; +</sup

Bu yöntem çift optogenetik ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri görüntü bazal sitosolik kalsiyum düzeyleri ve model organizma C. elegansvücut duvarı kasları uyarılmış kalsiyum geçici değişiklikler için bir yol sağlar.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

Burada bir iletişim kuralı için Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon sağlayan Ca2 + düşsel nöronlar ve gliyal hücreler, mevcut. Bu işleme genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri ifade izin tüm hücre tipleri için geçerlidir.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Bu protokol, virüsle enfekte insan bağırsak organoidlerinde kalsiyum görüntüleme yapmak için bir yaklaşımı açıklar ve analize bir yaklaşım sunar.

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Bu makale, Fura-2/boyası ile tek hücreli Ca2+ görüntüleme kullanılarak hücrelerde kalsiyum iyonu (Ca 2+) konsantrasyonlarının gerçek zamanlı, kantitatif izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, floresan yoğunluk oranları aracılığıyla verimli boya yüklemesi ve Ca2+ seviyelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir.

Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Öğrenin, siRNA ile gen susturma ve canlı hücre kalsiyum görüntüleme kullanarak ER membran kaçak kanallarının düzenleyici mekanizmalarını inceleyin. Bu yöntem, kalsiyum sinyalinin hücresel işlevlerini anlamaya katkı sağlar.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları (Video) | JoVE Journal

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar^{2 +} ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

Daha fazla video keşfet