Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar ^{2 +} ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

Memeli hücrelerde, endoplazmik retikulum veya ER, protein biyogenezi ve kalsiyum sinyalleşmesinde önemli bir rol oynar. ER membranındaki heterotrimer Sec61 kompleksi, yeni sentezlenen polipeptitlerin ER lümenine girişi için sulu bir yol sağlar. Güncel veriler, Sec61 kompleksinin potansiyel bir kalsiyum sızıntı kanalı olarak rolünü doğrudan ele almak adına, geçici kalsiyum sızıntı kanalları da oluşturabileceğini göstermektedir.

Putatif düzenleyici mekanizmalarını karakterize etmek için hücreler öncelikle sex 61 A one genine yönelik siRNA'lar ile muamele edilir. Komplementasyon analizinde hücreler, vahşi tip sex 61 A one geninin irna'ya dirençli ekspresyonuna izin veren bir iris GFP vektörü ilele birlikte transfekte edilir. Ardından hücreler rasyometrik kalsiyum indikatörü RO two ile yüklenir ve sitozolik kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler floresan mikroskobu aracılığıyla izlenir.

Kalsiyum seviyeleri ölçülürken, kalmodulin antagonistleri ve fablar argon gibi çeşitli ajanların kalsiyum sızıntısı üzerindeki etkisini değerlendirmek için solüsyon değişiklikleri yapılır. Elde edilen görüntülerin kantitatif analizi, sex 61 A one susturulmasının indüklediği kalsiyum F akışındaki değişiklikleri ortaya koymaktadır. Bu videoda, prosedürün gösterimi ve sonuçların sunumunun ardından, sex 61 A one'ın kalsiyum F akışındaki rolüne dair bir model sunulacaktır.

Bu tekniğin, dev lipid biyomembran deneyleri veya tek kanallı ölçümler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, aday membran proteinlerinin doğal ortamlarında, zahmetli saflaştırma işlemlerine ve genellikle verimsiz olan fonksiyonel yeniden yapılandırmaya gerek kalmadan analiz edilebilmesidir. Bu yöntem, kalsiyum sinyalizasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, farklı hücre tiplerinde belirli bir ER membran proteininin ER'den kalsiyum akışına katkısı nedir ve bunlar nasıl kontrol edilir? Prosedürün gösterimini laboratuvarlarımızdan iki yetenekli lisansüstü öğrencimiz gerçekleştirecektir. Bu prosedüre, kullanılacak solüsyonları ve reaktifleri hazırlayarak başlayın. İlk olarak, ekteki yazılı protokoldeki talimatlara uygun olarak kalsiyumsuz tamponu hazırlayın.

Sıradaki adımda, kalsiyum indikatörünün stok çözeltisini seyrelterek hazırlayın. %10 FBS ve %1 penisilin streptomycin içeren bir mililitre DMEM içerisine, dört mikromolar son konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin. Bir milimolar Apso Garin stok çözeltisini, kalsiyum içermeyen tampon içerisinde üç mikromolar son konsantrasyona gelecek şekilde seyreltin; ayrıca 200 mikromolar olein A ve 20 mikromolar çözeltileri de hazır bulundurun. Belirli bir siRNA'nın hedef dışı etkilerinin görülme riskini azaltmak için, her bir genin susturulmasında iki farklı siRNA kullanılarak transfeksiyon prosedürünün olası yan etkileri değerlendirilir.

Rastgele bir nükleotit diziliminden oluşan negatif kontrol siRNA'lar, deneysel siRNA'lar ile paralel olarak transfekte edilir. siRNA aracılı susturmanın etkisinin, wild type CD NA ekspresyonu ile geri döndürülebilmesi önemlidir. Bu nedenle, deneyde kullanılan siRNA'lar, kurtarma plazmidinin siRNA'lardan etkilenmemesi için spesifik olarak seçilir. Bu deneyde siRNA'lar, ilgili genin hem kodlayan hem de kodlamayan bölgesine veya UTR olarak kısaltılan çevrilmeyen bölgesine yöneltilir.

siRNA'lar UTR kurtarma (rescue) için yönlendirildiğinde, HeLa hücrelerinde transfeksiyona tabi tutmak için endojen UTR içermeyen plazmidler kullanılabilir. Her bir transfeksiyon için altı santimetrelik bir hücre kültürü kabına 25 milimetrelik polilizin kaplı bir lamel yerleştirerek hücreleri transfeksiyona hazırlayın; bir saat sonra, her bir kaba 5,2 × 10⁵ HeLa hücresi ve desteklenmiş DMEM ekleyin. Hücreleri transfekte etmek için bir mikro santrifüj tüpünü etiketleyin.

Her bir transfeksiyon reaksiyonu için her tüpe, 80 µL optimum Opti-MEM içinde çözünmüş 20 µM siRNA'dan dört µL ekleyin; her tüpe SEC61A1, SEC61A1 UTR ve negatif kontrol siRNA'lar hazırlanır. 20 µL Hyperfect transfeksiyon reaktifi ekleyip nazikçe vorteksleyin, ardından reaksiyonları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hücreleri transfekte etmek için, toplamda 104 µL siRNA karışımını çökmüş HeLa hücrelerine damla damla ekleyin ve transfeksiyon komplekslerinin homojen dağılımını sağlamak için kabı nazikçe dairesel hareketlerle sallayın.

%5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir ortamda, 37 °C'de inkübe edilmiştir. 24 saat sonra, besiyeri 3,9 mL taze besiyeri ile değiştirilir. Ardından, transfeksiyon verimliliğini artırmak için transfeksiyon işlemi ikinci kez gerçekleştirilir; susturmayı değerlendirmek için aynı irna karışımı kullanılarak western blot analizi yapılır.

Sessizleştirme oranı, burada sex 61 A one için gösterildiği gibi %80'in üzerinde olmalıdır. Maksimum sessizleştirme etkisi tipik olarak ilk transfeksiyondan 96 saat sonra görülür; sex 61 sessizleştirmesinden kaynaklanan fenotipi kurtarmak için ilk transfeksiyondan 48 saat sonra hazırlık yapılır. Yeni bir mikro santrifüj tüpünü etiketleyerek başlayın.

Her bir reaksiyon için, hücreler şimdi ya boş vektör ya da wild type sex 61 A one ekspresyon plazmidi ile transfekte edilecektir. Burada kullanılan wild type ekspresyon plazmidi, sex 61 A one cDNA'sinin bir pcd'nin çoklu klonlama bölgesine yerleştirilmesiyle oluşturulmuştur.

Sitomegalovirüs promotörü, iris ve yeşil floresan protein kaplama dizisini içeren üçlü internal ribozomal giriş GFP vektörü. Her bir tüpe optimum içerisinde çözünmüş her bir plazmidden dört mikrogram ekleyerek transfeksiyon reaktifini hazırlayın. Ardından buna 16 mikrolitre FU gene HD transfeksiyon reaktifi ekleyin, bu solüsyonu nazikçe vorteksleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, besiyeri değişiminden sonra, plasmid karışımını ekilmiş olan 5.2 × 10⁵ HEK293 hücrelerine damla damla ekleyin ve transfeksiyon komplekslerinin homojen dağılımını sağlamak için tabağı nazikçe çalkalayın. Hücreleri 37 °C ve %5 CO₂ koşullarında 48 saat daha inkübe edin. Transfeksiyon verimliliğini belirlemek için, floresan mikroskobu ile GFP ekspresyonunu değerlendirin.

48 saat sonra, hücrelerin en az %80'i transfekte edilmiş olmalıdır. Görüntüleme öncesinde, transfekte edilmiş hela hücrelerini içeren lamelleri bir pens yardımıyla yeni bir 3,5 santimetre hücre kültür kabına aktarın ve dört mikromolar içeren bir mililitre DMEM ekleyin.

Karanlıkta, 25 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin. Görüntüleme yapmak için, en az iki yüklü hücrenin bulunduğu lameli metal bir kayıt haznesine aktarın ve haznenin iki kısmını birbirine vidalayarak sabitleyin. Hücreleri yıkamak için bir pipet kullanarak 300 µL kalsiyumsuz tampon ekleyin ve ardından geri çekin.

Ardından, kayıt odasını polikrom beş krematörlü bir I MIC mikroskobuna yerleştirin. FU A iki'nin kalsiyumdan bağımsız floresanını tahmin etmek için URA iki için uygun bir filtre seti kullanarak, en az 20 hücre içeren bir alan bulun. Bu adımda kullanılan eksitasyon dalga boyu 360 nanometredir.

Uygun bir alan seçildikten sonra, görüntüleme yazılımını 340 nanometre ve 380 nanometrede uyaracak ve yayılan floresanışı her üç saniyede bir 510 nanometrede ölçecek şekilde ayarlayın; burada gösterilen düzenek için floresan yoğunluklarını yaklaşık 1000 keyfi birim üretecek şekilde pozlama süresini belirleyin. Beş milisaniyelik bir pozlama süresi ayarlanmıştır. Ek olarak, hücre içermeyen bir arka plan bölgesi ve 20 adede kadar hücre konturu için ilgi bölgelerini veya ROI'leri işaretleyin.

Deney devam ederken canlı hücre görüntülemesini başlatın; sistem, iki sinyal için rasyometrik görüntülerin yanı sıra, her bir işaretlenmiş ROI için gerçek zamanlı F340/F380 oranlarını bir çizgi grafik olarak sunacaktır; burada F340 ve F380 sırasıyla 340 ve 380 nanometredeki ROI'ler içindeki floresan yoğunluğunu temsil eder. Bir dakika sonra, farklı deneysel parametreleri test etmek için görüntüleme haznesine test çözeltileri ekleyin. Bu deneylerde, 10 dakika boyunca ek rasyometrik ölçümler yapıldıktan sonra Calmodulin antagonisti trifluorin ve bollin A test edilir.

CAL modüler antagonistleri için DSA gargan ekleyin ve ölçümlere devam edin. Deney başına 400 eşleştirilmiş görüntü kaydedin. Görüntüler toplandıktan sonra, görüntüleri inceleyin ve her bir görüş alanı için en az 20 hücre için ROI'leri işaretleyin.

Ardından, arka planı çıkarılmış oran görüntüleri dizisi ve arka planı çıkarılmış kalsiyum oran kinetiğini gösteren bir grafik oluşturmak için yazılımdaki kinetik analiz seçeneğini kullanın. Son olarak, her bir ROI için verileri yerleşik bir kalibrasyon yöntemi kullanarak excel ve origin'e aktarın. sex 61 A1 geninin ER'den kalsiyum sızıntısını etkileyip etkilemediğini incelemek için sitozol kalsiyum konsantrasyonu oran ölçümlerinden hesaplanabilir.

Sex 61 A1 geni, iki farklı RNA kullanılarak HeLa hücrelerinde 96 saat boyunca susturulmuştur. Susturma işlemi, burada gösterildiği gibi benzer sayıda hücrenin üç paralel örnekte Western blot analizi ile değerlendirilmiştir; birinci ile üçüncü şeritler arasında güçlü bir Sex 61 alpha sinyali görülürken, Sex 61 A1 susturulmuş hücrelere karşılık gelen dördüncü ile altıncı ve yedinciden dokuzuncu şeritler arasında anlamlı derecede daha zayıf bir sinyal görülmektedir. Sonuçları nicelleştirmek için Sex 61 alpha sinyalleri beta aktin sinyallerine göre normalize edilmiş ve ER kalsiyum F akışında kalmodulinin rolünü test etmek için %80'ten fazla susturma sağlanmıştır.

Calmodulin antagonisti Bollin A varlığında veya yokluğunda, Bollin A ile muamele edilmiş HeLa hücrelerinin URA iki görüntülemesi gerçekleştirilmiştir. Bu video, Bollin A ile 10 dakika boyunca muamele edilmiş kontrol hücrelerini göstermektedir. Kalsiyum salınımı, burada görülebileceği gibi, dışsal kalsiyum yokluğunda ER'den kalsiyum salınımını tetikleyen bir SERCA inhibitörü olan FSO Gargan uygulanarak başlatılmıştır.

FSA argon eklenmesi, ER'den kalsiyum F akışına işaret eden geçici ancak belirgin bir floresans artışına yol açmıştır. Buna karşılık, PHE kemiğinde, A ile işlem görmüş seks 61 A tek sessiz hücrelerde FSO garin eklemesini takiben meydana gelen kalsiyum F akışı, burada görülebileceği üzere çok daha az belirgindir. Bu fark, bir dizi filmde zamanla tahmini sitozol kalsiyumunu gösteren bu diyagramda açıkça görülebilir; burada sunulan kantitatif sonuçlar, bu sütun diyagramında görülebileceği gibi, ofi bolin A varlığında thic argon yanıtı olarak kontrol hücrelerinde artan kalsiyum flx değerlerini doğrulamaktadır.

Aynı fenomen, ikinci bir cam antagonisti triazin için de gözlemlenmiştir. Bununla birlikte, iki sex 61 A spesifik siRNA'dan herhangi biri kullanılarak hücrelerdeki sex 61 kompleksinin tükenmişliği durumunda, cam antagonistlerinin etkileri görülmemiştir. Sex 61 A sessizleştirilmiş hücrelere sex ile transfeksiyon yapıldığında, bu fenotipin kısmi bir kurtarılması görülebilir.

Burada görülebileceği üzere, 61 a tek bir ekspresyon plazmididir. Cal Modin agonistlerine yanıt olarak gelişen Kalsiyum flüksi, irna duyarsız vahşi tip plazmidin transfeksiyonu ile kısmen geri kazanılmıştır. Bu sonuçlar, hücrelerde Cal Modlin'in ER kalsiyum flüksünü sex 61 kompleksi düzeyinde sınırlamada rol oynadığını göstermektedir.

Eğer öyleyse, Calmodulin bağlanma bölgesinde çift mutasyon bulunan Sec61$\alpha$1 geninin transfeksiyonu, siRNA tarafından indüklenen fenotipi kurtarmamalıdır. Nitekim, hücreler IQ motifinde çift mutasyon içeren bir Sec61$\alpha$1 ekspresyon plazmidi kullanılarak transfekte edildiğinde, fenotipte herhangi bir düzelme gözlenmemiştir. Bu veriler, yeni sentezlenen zincirlerin Sec61 kompleksinden salınmasının gerçekten de ER'den kalsiyum salınımına ve Sec61 kompleksinin sitozolik ağzı çevresinde bir kalsiyum nano alanının oluşumuna yol açtığını göstermektedir.

Bu kalsiyum Cal Moulin tarafından bağlanır ve kalsiyum Cal Moulin, sex 61 kompleksini kapatır. Bu videoyu izledikten sonra, bu prosedürü takip ederek insan hücrelerinde siRNA aracılı gen susturmanın canlı kalsiyum görüntüleme ile nasıl birleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Hastalıkla ilişkili mutasyonlara sahip cDNA'ların ekspresyonu gibi diğer yöntemler, ilgili olmayan bileşenlerdeki hastalıkla ilişkili mutasyonların potansiyel etkisi gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla uygulanabilir.

Ve tekrar hatırlatmak gerekir ki, tap gibi ilaçlarla çalışmak son derece tehlikeli olabilir ve bu prosedür gerçekleştirilirken eldiven kullanımı gibi önlemler her zaman alınmalıdır.