Doku Yüzey tensiometresi Agrega Uyum ölçümü

Bu prosedür, agregatlar gibi 3B doku benzeri yapılarda hücre içi kohezyon gücünün nasıl ölçüleceğini göstermektedir. İlk adım, küresel doku benzeri agregatlar oluşturmak ve bunları doku kültürü ortamıyla dolu bir petri kabına aktarmaktır. Ardından, tek tek agregatlar bir pasta pipetle aspire edilir ve tensiometre haznesinin alt kompresyon plakasına yerleştirilir.

Ardından, üst sıkıştırma plakası, onu elektronik teraziye bağlayan ve F sıfır olarak adlandırılan sıfır baz hattı ağırlığını belirleyen bir nikel krom tele bağlanır. Deney, agregat alt ve üst sıkıştırma plakaları arasında sıkışana kadar alt sıkıştırma plakasının yükseltilmesiyle başlatılır ve agregatlar şekil ve kuvvet dengesine veya FEQ'ya ulaştığında sonlandırılır. Prosedürün son adımları; görüntülerin kaydedilmesi, agregat geometrisinin ve direnç kuvvetinin ölçülmesi ve bu ölçümlerin Young-Laplace denklemine girilmesidir.

Nihayetinde, agregat yayılma analizleri veya hücre ayıklama analizleri aracılığıyla, sırasıyla doku kohezyonundaki değişimleri ve bunların tümör dağılımını veya farklı hücre popülasyonları arasındaki uzamsal konumlanmayı nasıl etkileyebileceğini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Dolayısıyla bu yöntem; tümör biyolojisi, embriyonik gelişim ve doku mühendisliği alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Tümör kohezyonu malign invazyonu nasıl etkiler, gastrulasyon sırasında germ tabakalarının stratifikasyonu nasıl gerçekleşir gibi sorulara yanıt aranabilir.

Ya da in vitro ortamda fonksiyonel organ benzeri yapılar oluşturmak için kohezyonu gerçekte nasıl mühendislik yöntemleriyle tasarlayabiliriz? Canlı hücre kültürünü içeren deneysel manipülasyonlar, belirlenmiş bir laminer akışlı kabinde aseptik koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Süreç boyunca steril çözeltiler ve steril laboratuvar ekipmanları kullanılmalıdır. Bu deneye başlamak için, %90 konfluense ulaşmış adezyon hücrelerini hasat edin.

Öncelikle, kültür ortamını aspire edin ve hücre tabakasını iki kez PBS ile durulayın. Ardından PBS'yi aspire edin ve monokatman üzerine iki mililitre %0,05'lik tripsin EDTA çözeltisi pipetleyin. Plakayı 37 °C doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve hücreler ayrılana kadar inkübe edin.

Ardından, plakayı inkübatörden çıkarın ve iki mililitre komple besiyeri ekleyerek işlemi durdurun. Hücreler tamamen süspansiyona girene kadar karışımı trite etmek için beş mililitrelik pipet kullanın. Daha sonra hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Hücre süspansiyonuna 10 mg/mL konsantrasyonunda DNA çözeltisinden 40 µL pipetleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından hücre süspansiyonunu kısa süreliğine vorteksleyin ve ardından 200 ×g kuvvetinde beş dakika santrifüj edin. Santrifüj işlemi tamamlandığında süpernatantı aspire ederek uzaklaştırın. Daha sonra peleti 1 mL tam besiyerinde yeniden süspande edin ve yıkama yapmak için santrifüj işlemini tekrarlayın.

Peleti bir mililitre tam besiyerinde süspanse edin, ardından hücre sayımı gerçekleştirin ve gerekirse hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu mililitre başına altı milyon hücre olacak şekilde tam besiyeri ile ayarlayın. Hücre süspansiyonunun üç mililitresini 10 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir erlene aktarın ve hücreler, birbirlerine yapışarak küçük kümeler oluşturacak şekilde iyonizasyondan kurtulana kadar 37 °C ve %5 karbon dioksit içeren çalkalamalı bir su banyosunda, dakikada 120 rotasyon hızında dört saat boyunca inkübe edin.

Ardından, hücreleri cam yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüj sonrası ince bir tabaka oluşması için 200 ×g kuvvetinde dört dakika boyunca santrifüjleyin. Gaz değişimine izin vermek için tüpün kapağını gevşetin ve ardından tüpü doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Tabakanın koherent hale gelmesi için 24 saat boyunca inkübe edin.

24 saat sonra, hücre tabakasını yerinden ayırmak için santrifüj tüpünü hafifçe sallayın. Ardından, kültür tüpünün içeriğini küçük, steril bir cam doku kültürü kabına boşaltın. Hücre tabakasını çeşitli boyutlarda parçalara ayırmak için mikro skalpel kullanın ve ardından bu parçaları, 3 mL doku kültürü ortamı içeren 10 mL'lik yuvarlak tabanlı bir erlene aktarın.

Fragmanları, 37 °C sıcaklıkta, dakikada 120 rotasyon hızındaki çalkalamalı su banyosunda, %5 karbondioksit altında iki ila üç gün boyunca veya küresel hale gelene kadar inkübe edin. Agregat oluşumu, asılı damla yöntemi kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Daha önce yayınlanmış protokole göre, doku yüzey TANSİYOMETRESİ veya TST düzeneği; kompresyon hücresini içeren ana tansiyometre haznesi, hazne sıcaklığını korumak için bir su banyosu, bağlantılı bir CCD kameraya sahip bir diseksiyon mikroskobu, güç kaynağına sahip bir hassas terazi ve bir grafik kaydediciden oluşur.

TST'nin sıkıştırma hücresi, bir dış hazne ve bir iç hazne olmak üzere iki hazneden oluşur. İç hazne, poli iki hidroksietil metakrilat kaplı üst sıkıştırma plakasını ve alt sıkıştırma plakasını barındırır. Öncelikle, sirkülasyonlu su pompasını 37 °C'ye ayarlayın ve boruların dış haznedeki portlara bağlı olduğundan emin olun.

Ardından, agregatı yükselterek sıkıştırmayı başlatmak için kullanılan alt düzeneği iç haznenin tabanına vidalayın. Sonra, önce 15 inç uzunluğundaki bir nikel krom telini bir retort ayağına asıp ucuna küçük bir ataş kıstırarak, alevle düzeltilmiş bir tel parçası hazırlayın. Daha sonra, tel kırmızı akkor hale gelene kadar bir bunsen bekini tel boyunca aşağı yukarı hareket ettirin.

Doğrultulmuş teli uygun uzunlukta kesmek için tel kesici kullanın. Ardından, telin ucundan yaklaşık bir çeyrek inç içeriden küçük bir kanca oluşturmak için iki adet jilet kullanarak teli bükün. Son olarak, TST'nin iç haznesini, 37 °C'de 24 saat inkübe edilerek gazı alınmış, karbondioksitten bağımsız doku kültürü besiyeri ile doldurun.

Alt kompresyon plakası üzerinde oluşmuş olabilecek hava kabarcıklarını gidermek için bir pipet kullanın. TST cihazı artık agregat kompresyon deneyi için hazırdır. Kültür plakasından 200 ila 300 mikron boyutunda bir hücre agregatını aspire etmek için APA pipetini kullanın.

Ardından agregatı, TST cihazının iç haznesindeki alt sıkıştırma plakası üzerine nazikçe boşaltın. Agregatı, ucu küçük bir kıl loop ile donatılmış bir kapiler tüp yardımıyla hafifçe iterek alt sıkıştırma plakasının mümkün olduğunca ortasına konumlandırın. Plaka düzeneğindeki nikel krom teli, can venton Model 2000 kayıtlı elektro terazinin terazi koluna bağlayın.

Üst ve alt sıkıştırma plakaları paralel hale gelene ve doğrudan birbiriyle hizalanana kadar terazinin konumunu ayarlayın. Üst plakanın oturmasını bekleyin. Ardından, grafik kaydediciyi belirlenen temel ağırlık değerine göre sıfırlayın.

Sıkıştırılmamış agregatın görüntüsünü yakalamak için CCD kamera ile donatılmış diseksiyon mikroskobunu kullanın. Ardından, istenen sıkıştırma derecesini kontrol etmek için iç çekirdek düzeneğinin yüksekliğini ayarlayın ve agregat üst sıkıştırma plakasına karşı sıkışana kadar alt sıkıştırma plakasını yükseltin. Sıkıştırmayı izlemek ve burada gösterileninkine benzer agregat görüntüleri yakalamak için CCD kamera ile donatılmış diseksiyon mikroskobunu kullanın.

Sıkıştırma işlemi boyunca, şekil oluşumu gerçekleşene kadar, şerit grafik kaydedici kullanarak görünür üst sıkıştırma plakası ağırlık değişimini sürekli olarak kaydedin. Denge durumu, kutuların denge voltaj çıkışının düzleşmesi ile belirlenir. Sıkıştırılmış agregatın görüntüsünü yakalamak için CCD kameralı diseksiyon mikroskobunu tekrar kullanın.

Bu görüntü, agrega geometrisini ölçmek için kullanılacaktır. Görüntüyü yakaladıktan sonra, denge durumundaki sıkıştırma kuvvetini ölçmek için sıkıştırma plakasını indirerek agreganın basıncını düşürün. Grafik kaydedici izini, agreganın basıncı düşürülmeden hemen önce ölçülen kuvvet ile belirlenmiş sıfır referans çizgisi arasındaki fark olarak okuyun. Bu kez kuvvet dengesini belirlemek için işlemi farklı bir sıkıştırma derecesi kullanarak tekrarlayın.

Kuvvet dengesindeki sıkıştırma kuvvetini ve geometriyi ölçün ve bu ölçümleri, şekil dengesi ölçümleriyle birlikte görünür doku yüzey geriliminin sayısal değerlerini oluşturmak için Young-Laplace denklemine uygulayın. Yazılı protokoldeki talimatlara göre bu tablo; sıçan prostatı, fibroblastlar ve düz kas hücreleri agregatları için doku yüzey gerilimi ölçümlerini ve agregat likiditesinin onayını göstermektedir. Sıçan prostat fibroblast hücresi agregatları, santimetre başına 22.8 ± 1.1 dine değerinde bir yüzey gerilimine sahiptir.

Ayrıca, birinci sıkıştırma sonrası ve ikinci sıkıştırma sonrası ölçülen ortalama yüzey gerilimi değerleri, eşleştirilmiş T testi ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak özdeş çıkmıştır. Tablo 1'de gösterildiği üzere, bu agregatların elastik katılar gibi davrandıklarında uymaları gereken Hooke yasasına uymadıklarından emin olmak için sigma iki'nin Sigma bir'e oranı ile F iki'nin F1'e oranlarını da karşılaştırdık. Sigma iki'nin Sigma bir'e oranı gerçekten de bire yaklaşmaktadır.

Ayrıca, F iki'nin F1'e oranı sigma iki'nin sigma bir'e oranından anlamlı derecede daha büyüktü. Bu durum, söz konusu agregatların Hooke yasasına uymadığını ve aslında sıvı gibi davrandığını doğrulamaktadır; buna karşılık, tablo bir'de görüldüğü üzere, sıçan prostat düz kas hücrelerinin sigma iki'nin sigma bir'e oranı bir'den anlamlı derecede daha büyüktür ve F iki'nin F1'e oranı ile istatistiksel olarak farklılık göstermemiştir. Sıvı benzeri davranışı daha ayrıntılı göstermek için, burada görülebileceği üzere, yüzey gerilimi ile agregat hacmi arasındaki ilişkiyi inceledik. Kırmızı regresyon çizgisinin gösterdiği üzere, RPF hücreleri için hacim sigma'dan bağımsızdır; oysa mavi regresyon çizgisinin gösterdiği üzere, sıçan prostat düz kas hücreleri için sigma'nın hacme belli bir bağımlılığı olduğu görülmektedir.

Bu veriler, sıçan prostat fibroblast agregatlarının sıvı benzeri bir şekilde davrandığını, sıçan prostat düz kas hücreleri agregatlarının ise daha çok elastik katılar gibi davrandığını daha da doğrulamaktadır. Dolayısıyla, geliştirilmesinin ardından bu teknik; embriyonik gelişim, malign invazyon ve doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların, amfibiler, zebrafish, kanatlılar ve insan modelleri dahil olmak üzere birçok farklı hayvan modelinde; embriyonik germ tabakası gelişimi sırasında, tümör stromal hücre etkileşimi sırasında ve pankreas adacık hücresi yeniden düzenlenmesi sırasında farklı hücre tipleri arasında kompartmanların ve sınırların oluşturulmasında doku kohezyonunun rolünü araştırmalarına olanak sağlamıştır.