Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

Bu video, kimyasal veya çevresel ajanların spesifik protein aktivitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için kimyasal kitaplıkların yüksek verimli taraması veya çevresel kirleticilerin tespiti için CL ganların floresan suşlarını kültürlemek ve dağıtmak için bir yöntemi göstermektedir. CL elgan'da bakteri kültürleri ilk olarak solucanlar için besin olarak hazırlanır ve GFP transgeniktir. Senkronize solucanlar kültürlenir.

0,5 ila 2 milyon solucan daha sonra toplanır, yıkanır ve 3 84'e dağıtılır. Solucanlara mikrotitre plakaları, daha sonra bir kimyasal kütüphaneden küçük moleküller veya su, yiyecek veya toprak gibi test örnekleri eklenir. Son olarak, solucanların floresansı bir mikroplaka okuyucu ile ölçülür.

Floresan yoğunluklarının veri analizi, indüklenebilir transkripsiyonel yolları modüle eden veya çevresel kirleticilerin tespitine izin veren küçük molekülleri ortaya çıkarır. Bu tekniğin, in vitro ve hücre kültürü bazlı tahliller gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, in vivo olarak toksik veya inaktif olan bileşikler için zaman harcanmamasıdır. Bu yüksek verimli yöntem, çeşitli indüklenebilir yolları modüle eden küçük moleküllerin tanımlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntemi küçük molekül kütüphanelerinin yüksek verimli taraması için geliştirmiş olsak da, gıda ve çevresel numunelerdeki kirleticilerin biyolojik olarak algılanması için de uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarım için bir teknisyen olan Andrew Dine ve laboratuvarım için bir doktora sonrası olan Q long olacak. Bakteri kurdu yemini önceden hazırlayın.

Beş mililitre doymuş e coli ile mililitre streptomisin başına 50 mikrogram ile desteklenmiş 500 mililitre müthiş et suyu aşılayarak başlayın. OP 50. Kültürü bir çalkalayıcıya yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün.

Ertesi gün, kültürü 10 adet 50 mililitrelik tüplere bölün. Daha sonra tüpleri soğutmalı bir santrifüje koyun ve 20 dakika boyunca 2.500 RCF'de döndürün. Döndürme Resus'u takiben, her bakteri peletini 10 mililitre sıvı nematod büyüme ortamı veya NGM içinde askıya alın.

Süspansiyonları yatay olarak sallayın. Bakterileri yeniden süspanse etmek için 15 dakikalık bir yer çalkalayıcı. Daha sonra, bakteri kültürünü 20 dakika boyunca dört santigrat derecede 2.500 RCF'de santrifüjleyin.

NGM'yi boşaltın ve bakteri peletini tartın. Daha sonra eşit hacimde bir NGM tamponu ekleyin ve peletleri girdaplayarak yeniden süspanse edin. Son olarak, yeniden süspanse edilmiş bakteri kültürünün üç mililitresini 15 mililitrelik tüplere ayırın ve ihtiyaç duyulana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Bu gösterimde, strese neden olan Xeno Duke kredisinin transkripsiyon faktörü Sskn one üzerindeki etkisi örnek olarak ölçülecektir. Sskn one'ın oksidatif ve ksenobi stresi sırasında sitoprotektif genleri aktive ettiği bilinmektedir. İki floresan yapı taşıyan Trenchgenic cgans hattı VP 5 96'nın büyük ölçekli bir kültürü hazırlanmıştır.

VP 5 96 solucanları, transkripsiyon faktörünün aktivitesini izlemek için kullanılan GST dört promotör sürüş GFP'sini ifade eder. Sskn bir ve DOP üç organizatör sürüşü. RFP, solucan sayısı normalleştirmesi için bir standart olarak kullanılır.

DOP üç, bir dopamin reseptörünün destekleyicisidir ve vücuttaki nöronlarda yapısal olarak eksprese edilir. Örnekte, verilen ksenobi lon, sskn birini güçlü bir şekilde aktive eder ve kültürleri hazırlamak için GS T dört promotöründen eksprese edilen GFP miktarını arttırır, 150 mililitre N NGM tamponu, 1.5 mililitre LB 150, mikrolitre bir molar kolesterol ve 75 mikrolitre mililitre mililitre başına 100 miligram. Streptomisin. LB eklemek, solucanların cam eşyalara ve plastik eşyalara yapışmasını önlemeye yardımcı olur, ancak bu miktar bakteri üremesini desteklemek için yeterli değildir.

Karışımı sterilize etmek için süzün, ardından steril bir litrelik şişeye aktarın ve yumurtaları GR yetişkin solucanlarından serbest bırakmak için şişeyi bir kenara koyun. Bakterileri solucanlardan santrifüj ederek ve supinat berraklaşana kadar NGM ortamını değiştirerek yıkayın. Döndürme işleminden sonra solucanları tekrar steril su santrifüjünde askıya alarak Resus ile ikinci kez yıkayın.

Sırtı çıkarın ve tüpü 3.75 mililitre steril su ile doldurun. Bir mililitre ev tipi çamaşır suyu ve 250 mikrolitre 10 normal sodyum hidroksit ekleyin, hemen beş ila altı kez ters çevirerek karıştırın. Solucanlar dört dakika boyunca ağartıcıya maruz kaldıktan sonra tüpü bir döndürücüye yerleştirin.

Tüpü stereo mikroskop altına yerleştirin. Yetişkinlerin çoğu yalan olmalı. Lizis meydana geldikten sonra kalan yetişkin solucanların toplam beş dakika boyunca yatmasına yardımcı olmak için tüpü 15 ila 20 kez kuvvetlice çalkalayın, tüp dolana kadar steril su ekleyin.

Yumurtaları toplamak için beş ila altı kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü 500 RCF'de bir dakika santrifüjleyin. Yumurtaları Resüs ile üç kez yıkayın, 10 mililitre steril suda bükün, döndürün ve sırtını çıkarın.

Daha sonra, 10 mililitre NGM tamponu ekleyerek yumurtaların 100 mikrolitrelik bir örneğini 100 kat seyreltin. Daha sonra mikroskop altında bir Petri kabı kapağına üç adet beş mikrolitrelik alikot pipetleyin. Yumurta sayısını üç ayrı beş mikrolitrelik alikotta sayın.

Toplam yumurta sayısını tahmin etmek için. NGM tamponlu şişeye 200.000 ila 2 milyon yumurta ekleyin ve kültürü 20 santigrat derecede 100 RPM'de çalkalayın. Yumurtalar şişeye eklendikten en az 16 saat sonra, askıya alınmış solucan kültürünün yaklaşık 0,5 mililitresini çıkarmak için steril serolojik pipet kullanır.

Bir Petri kabının steril kapağına üç beş mikrolitrelik damla pipetleyin. Solucanlar felç olduktan sonra solucanları felç etmek için kapağı eksi 20 derecelik bir dondurucuya bir ila iki dakika koyun. Toplam sayıyı tahmin etmek için bir stereo mikroskop ile beş mikrolitre başına ortalama canlı yumurtadan çıkan solucan sayısını sayın.

Daha önce hazırlanmış olan donmuş OP 50 bakteri kültürünü bir tezgahta birkaç dakika bekleterek çözdürün. Daha sonra 500.000 yumurtadan çıkmış solucan başına üç mililitre% 50 OP 50 ekleyin. Şişeyi 20 santigrat derecede 100 RPM çalkalayın.

Solucanlar yaklaşık 51 saat içinde L dört larva ve genç erişkin aşamalarına dönüşecektir. Görsel inceleme ile inkübasyon boyunca bakteri miktarını izleyin. Ortam berraklaşırsa daha fazla bakteri ekleyin.

Askıya alınmış solucan kültürünün yaklaşık 0,5 mililitresini standart bir NGM agar plakasına aktarmak için steril bir serolojik pipet kullanın. Çoğunun parlak alan mikroskobu altında L dört larva ve genç yetişkinler olduğundan emin olmak için solucanları stereo mikroskopla görüntüleyin, L dört larva vücudun ortasında ventral net bir noktaya sahip olacaktır. Genç yetişkinler biraz daha büyük olacak ve net bir noktaya sahip olmayacaklar.

Daha sonra, solucan kültürünü steril 50 mililitrelik tüplere çekin. Tüpleri davlumbazdaki bir test tüpü rafına yerleştirin ve gelişmeyen yumurtadan çıkmamış yumurtaları veya solucanları yerleştirmelerine izin verin. Gelişmiş solucanlardan daha yavaş yerleşir.

10 dakika sonra, her bir pelete yaklaşık 10 mililitre NGM tamponunda aspirasyon yaparak yumurtadan çıkmamış ve gelişmemiş solucanlar içeren supinatı çıkarın ve tüpleri hafifçe döndürerek solucanları askıya alın. Tüm solucanları 50 mililitrelik tek bir tüpte toplayın. Sallanan kova santrifüjünde 500 RCF'de 30 saniye döndürün.

Daha sonra solucanları yıkamak için% 1 lb ile 50 mililitre NGM'de yeniden süspanse edin. Bunu tekrarlayın, yıkadıktan sonra bakterileri uzaklaştırmak için üç ila dört kez yıkayın. Tüpü NGM artı LB tamponu ile 50 mililitreye kadar doldurun.

Bunu bir karıştırma çubuğunda özel bir solucan dağıtma şişesine dökün ve bir karıştırma plakasına yerleştirin. Dağıtım şişesi ve dağıtıcı kasetindeki ölü alanı doldurmak için en az yaklaşık 20 mililitre veya 60.000 solucan gerekir. Solucan sayısını daha önce gösterildiği gibi üç beş mikrolitrelik damla halinde sayın.

NGM artı LB'de beş mikrolitrelik damla başına 12 ila 15 solucan konsantrasyonuna kadar saydıktan sonra, her 3 84 oyuklu plaka yaklaşık 35.000 solucan veya 11.5 mililitre askıya alınmış solucan gerektirir. Dağıtıcıya 10 mikrolitrelik bir dağıtım kaseti yükleyin ve %70 etanol ile astarlayarak sterilize edin. Etanolü steril su ile astarlayarak durulayın.

Dağıtım kasetinin ucunu, hareketini bozmadan karıştırma çubuğunun hemen üzerinde olacak şekilde şişeye yerleştirin. Solucanların şişe boyunca asılı kaldığından emin olun. Dağıtıcıyı, iki ön darbe astarı ile solucanları düşük hızda dağıtacak şekilde programlayın ve en az 10 mililitre asılı solucan çalıştırın.

Solucanların boruya yerleşmesini önlemek için test bileşiklerini içermesi gereken mikrotitre plakalarını hızlı bir şekilde doldurun. Burada, daha önce mikrotitre plakasına yüklenen test bileşiğinin vadesi gelir. Kızdırma. Kuyucuklarda toz birikmesini önlemek için plakaları nefes alabilen bantla kapatın.

Plakaları, tahlil için uygun sıcaklıkta bir inkübatörde çalkalanan bir platform üzerine yerleştirin. Hava akışını kısıtlayabileceğinden plakaları üst üste koymayın. Burada uygun emisyon ve uyarma dalga boyları ile her bir kuyucuğun floresan yoğunluğunu ölçmek için hedef plakayı bir mikroplaka okuyucuya yerleştirin.

GFP için kullanılan filtreler 4: 85'te uyarma ve 5: 28'de emisyondur. RFP için filtreler beş 40'ta uyarılır ve beş 90'da emisyondur. Plakayı okuduktan sonra, GFP'nin RFP'ye oranını hesaplayın ve bireysel işlemlerden elde edilen floresan yoğunluğunun tam kat farkını belirlemek için aktive edici bileşik içermeyen kontrol kuyularının okumaları ile normalleştirin.

Burada gösterilen SSKN bir tahlili, solucanların bir stereo mikroskopla manuel olarak sayıldığı bir suş olan kromozomal olarak entegre edilmiş bir ikili rapor kullanır. Solucan sayısı, 0.94'lük bir R kare değeri ve 0.0001'den küçük bir p değeri ile dağıtılan hacim ile ilişkilidir. Bu, her bir kuyucuğa dağıtılan solucan sayısının, dağıtılan hacmin ayarlanmasıyla kontrol edilebileceğini gösterir.

Solda gösterilen kuyucuk başına toplam GFP floresansı ve sağda gösterilen kuyu başına RFP floresansı, bu şekillerde 3 84 oyuklu bir plaka boyunca kuyudan kuyuya yüksek oranda tekrarlanabilir. XS, her bir oyukta ölçülen nispi floresansı gösterir. Düz çizgiler ortalamaları gösterir ve kesik çizgiler, tüm kuyucukların ortalama floresansının üstünde veya altında üç standart sapmayı gösterir %9'un altında bir varyasyon katsayısına sahiptiBu şekilde gösterildiği gibi, GST dört promotöründen gelen GFP floresansı, 0,62 R kare değeri ve 0,0001'den düşük bir p değeri olan 3 84 kuyu boyunca DOP üç promotöründen gelen RFP floresansı ile doğrusal olarak ilişkilidir.

Bu nedenle, indüklenemeyen RFP raporlayıcısı, indüklenebilir olanı normalleştirmek için kullanılabilir. GFP muhabiri. RFP'ye göre GFP'nin bir oranını ifade ettiğinde, floresan 3 84 oyuklu bir plaka boyunca kuyudan kuyuya yüksek oranda tekrarlanabilir hale gelir.

GFP'nin RFP'ye oranının hesaplanması, varyasyon katsayısını %6'nın altına düşürdü ve DOP üç destekleyici, RFP raportörünün burada gösterildiği gibi değişkenliği azaltma yeteneğini gösterdi. GFP'nin RFP'ye göre bir SK N bir aktive edici kseno biyotik ile indüksiyonu sağlamdır ve 3 84 oyuklu bir plaka boyunca yüksek oranda tekrarlanabilir, tüm kontrolün ve GLO kuyularının ortalama nispi floresan oranları katı çizgilerle işaretlenmiştir. Kontrol ortalamasının üstünde ve dlo ortalamasının altında üç standart sapma kesik çizgilerle işaretlenir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bir solucan kültürüne başlamak, birinci günde yaklaşık bir saat ve toplama ve dağıtma yapılabilir. Düzgün yapılırsa yaklaşık iki saat boyunca bir solucan yapılabilir. Bu prosedürü denemek, en az 60.000 solucanla başlamayı ve dağıtım sırasında onları askıya almayı hatırlamak önemlidir, bu prosedürü takiben, örneğin, diğer indüklenebilir yollar için rapor dizileri ile ekranlar, diğer yollar için modülatörler geliştirmek amacıyla gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, küçük molekül yolu modülatörlerini hızlı bir şekilde tanımlamak veya çevresel kirleticileri tespit etmek için yüksek verimli tarama ve biyo-algılama alanlarındaki araştırmacıların önünü açabilir. Bu videoyu izledikten sonra, indüklenebilir transkripsiyonel yollar varsa veya çevresel kirleticiler için birden fazla numuneyi test ediyorsa yüksek verimli tarama için floresan elegan suşlarının nasıl kültürleneceğini, dağıtılacağını ve ölçüleceğini iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.