Name: Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Öğrenin, yüksek verimli tarama ve çevresel biyoalgılama için C. elegans'ın floresan suşlarını nasıl kültüre edip dağıtacağınızı. Bu yöntem, canlı organizmada gen ifadesi değişikliklerini ölçerek güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C. elegans transgenlerin Caenorhabditis Genetik Merkezi (Minnesota Üniversitesi, Minneapolis, MN) tarafından verilmiştir. Bu çalışma NIH R21 hibe NS0667678 KS-01 tarafından desteklenmiştir. Tüm yazarlar katıldı toplanması, analizi ve verilerin yorumlanması. CKL, KS ve KMG yazının yazımı ve gözden geçirilmesi katıldı.

1. Bakteriyel solucan gıda hazırlanması 1. Gün <ol><li> 5 ml doymuş E. ekle 50 mg / ml streptomisin coli OP50 bakteri kültürü 500 ml Terrific suyu ile desteklenmiş ve sallayarak inkübatör (225 rpm) bir gecede büyümek 37 ° C </li></ol> 2. Gün <ol start="2"><li> 20 dakika boyunca 2500 RCF soğutmalı santrifüj on 50 ml tüpler ve santrifüj bakteri içine Split gecede bakteri kültürü. </li><li> LB suyu kapalı Durusu ve 10 ml sıvı nematod büyüme ortam (NGM) her bakteriyel pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Bakterilerin tekrar süspansiyon 15 dakika boyunca yatay bir zemin çalkalayıcı çalkalayınız. NGM tampon yapmak için 3 gr NaCl, 1 L deiyonize su ve otoklav ekleyin. Serin - 55 ° C ve steril çözümler için aşağıdaki ekleyin: 1 ml 1 M CaCl 2, 1 M MgSO 4 1 ml, 25 ml ve 1 M potasyum fosfat, pH 6.0 . </li><li> 20 dakika boyunca 2500 RCF soğutmalı santrifüj bakteri kültürü santrifüjleyin. </li><li> NGM tampon kapalı Durusu ve bakteriyel pelet tartmak. </li><li> Granül, kısım bakteri 3 ml, 15 ml tüpler ve mağaza içine konsantre -20 ° C tekrar süspansiyon NGM tampon eşit hacimde </li></ol> 2. C. Büyük ölçekli elegans sıvı kültürü Biz bir transgenik satırını kullanın VP596 (dvIs19 [pAF15 (gst-4:: GFP: NLS)]; vsIs33 [dop-3: TÇD) iki floresan yapıları taşıyan SKN-1 izlemek için GFP 14: Pgst: -4 aktivite ve Pdop-3: RFP 17 solucan sayısı normalleşmesi için bir standart olarak hizmet vermektedir. 1. Gün <ol><li> 150 ml, 1.5 ml LB suyu, 5 mg / ml 'kolesterol (etanol) 150 ul, 100 mg / ml streptomisin 75 ul NGM tampon karıştırın. Karışımı Filtre sterilize ve 1 litre steril erlene ekleyin. NOT:% 1 LB suyu NGM tampon ekleme, solucanlar, cam ve plasticware yapışmasını önlemek için yardımcı olur, ancak bu miktar bakteri büyümeyi desteklemek için yeterli değildir. </li><li> Solucanlar standart hipoklorit prosedürü 18 ile senkronize etme. Hipoklorit solüsyonu 5 ml (3.75 ml steril su, 1 ml çamaşır suyu, ve 250 ul 10 N NaOH) ile 0.5 ml gravid solucanlar, tek bir 15 ml tüp içinde işlenebilir. Bırakılan yumurta steril su ile yıkayın ve 10 ml NGM tampon tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Yumurta NGM tampon 100 kat (örneğin, 10 ml 100 ul) bir örnek seyreltilir ve üç ayrı 5 ul alikotları yumurta sayısını. Çoklu 200.000 (100 seyreltme faktörü x 2,000), ortalama toplam yumurta sayısını tahmin etmek. </li><li> NGM tamponu ile şişesi için 200.000 'e 2 milyon yumurta ekleyin ve kültür sallamak 100 rpm'de 20 ° C. </li></ol> 2. Gün <ol start="5"><li> Erlene yumurta ekledikten sonra en az 16 saat asılı bir solucan kültür yaklaşık 0,5 ml kaldırmak için steril bir serolojik pipetlemeyin kullanın. Petri kabı steril kapak üzerine üç pipetleyin 5 ul damla. Solucanlar felç için 1-2 dakika boyunca -20 ° C derin dondurucu kapağı yerleştirin. Yumurtadan solucanlar toplam sayısını tahmin etmek için ortalama sayısı 30.000 (150 ml / 5 ul) 5 ul ve sonra birden başına canlı yumurtadan solucanlar güvenin. </li><li> Dondurulmuş OP50 bakteri kültürü (Protokol 1.6) bir tüp çözülme ve 500.000 yumurtadan solucanlar başına solucan kültürü içine 3 ml% 50 OP50 ekleyin. Şişeyi çalkalayın 100 rpm'de 20 ° C. Worms L4 larva ve genç erişkinlerde yaklaşık 51 saat içinde dönüşecek. Bakteri OD600 başında 2.200 hakkında olmalıdır. Absorbans bakteri miktarı Monitör ve daha eklemek OD 600 aşağıdaki 0.900 düşerse. </li></ol> 3. Solucan toplama ve dağıtım 4. Gün <ol><li> Standart bir NGM agar plaka askıya solucan kültür yaklaşık 0.5 ml transfer etmek için steril bir serolojik pipetlemeyin kullanın. En L4 larva veya genç erişkinlerde olduğunu emin olmak için bir stereomikroskopta solucanlar. L4 larvaları ventral vücut ortasında bir açık nokta olacaktır. Genç yetişkinler, biraz daha büyük ve net bir nokta olmayacaktır olacak. </li><li> Solucan kültürü steril 50 ml tüpler içine dökün ve bir test tüpü rakı benchtop tüpler. Solucanlar, yaklaşık 10 dakika boyunca yerleşmek için izin verin. Aspirasyonu veya pipetleme süpernatantı. NOT: Bu adım, L4 larva ve genç erişkinlerde daha yavaş yerleşmeye çünkü çıkmamış yumurta veya geliştirmek değil solucanları kaldırmak için önemli olabilir. </li><li> NGM tamponu ile 1% LB suyu (NGM + LB) bakteriler kaldırmak için 3-4 kez 50 ml tek bir tüp ve yıkama tüm solucanları toplayın. NOT: Bu en iyi 30 saniye için 500 RCF solucanlar toplama ve taze NGM + LB tampon ile süpernatantı yerine bir sallanan kovası santrifüj yapılır. </li><li> Yıkadıktan sonra, 50 ml + NGM LB tampon tüp doldurmak ve özel bir solucan dağıtımı şişesi içine dökünüz. Küçük bir heyecan çubuğuna ekleyin ve solucanlar askıda tutmak için karıştırın. Kasım Sayısıüç 5 ul damla solucanlar e numarası yukarıda da belirtildiği gibi. 5 ul damla (~ 2,5-3,0 solucanlar / ml) ortalama 12-15 solucanlar kadar NGM + LB ile sulandırınız. NOT: yaklaşık 20 ml (60.000 solucanlar) en az dağıtım şişesi ve dağıtıcı kaset ölü boşluğu doldurmak için gereklidir. Her 384 plaka yaklaşık 35.000 solucan veya askıya solucanlar 11.5 ml gerektirir. </li><li> 10 ul dağıtım kaset Yük ve% 70 etanol ile astarlanırsa ile sterilize edin. Steril su ile astarlanırsa etanol durulayın. </li><li> Sadece hareketini bozmadan heyecan bar üstünde olduğunu balona dağıtım kaset takın. Solucanlar tüm şişesi boyunca askıda kalır emin olun. Program, dağıtıcı, 2 pre-bakliyat ile düşük hızda dağıtmak için. Başbakan ve askıya solucanlar en az 10 ml çalıştırın. Plakalar, tüp yerleşen solucanları önlemek için hızlı bir şekilde gerektiği gibi doldurun. </li><li> Nefes bant ile plakaları. </li><li> Tayini için uygun sıcaklıkta bir inkübatör sallayarak platformu tabak koyun. Plakalar koymayın. </li></ol> 4. Floresans analizi <ol><li> Uygun emisyon ve dalgaboyu (:; RFP 540/25ex 590/35em GFP 485/20ex 528/20em tayini için Filtreler) ile her bir kuyunun floresan yoğunluğu ölçmek için bir mikroplaka okuyucu hedef plakası yerleştirin. </li><li> GFP / RFP oranını hesaplayın ve bireysel tedavi edilen floresan yoğunluğu tam kat farkı belirlemek için kontrol kuyuları (aktive bileşik olmadan) okuma normalleştirmek. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Bizim SKN-1 testinin kromozomal olarak entegre bir çift muhabiri suşu (VP596) kullanır. Şekil 1'de gösterildiği gibi, solucanlar sayıda reçete hacmi de ilişkilidir. De ortalama Şekil 2A ve 2B, toplam GFP ve RFP floresan görüldüğü gibi son derece iyi bir 384 plaka iyi çapında tekrarlanabilir. RFP çapında 384 kuyu: GFP floresan doğrusal Pdop-3 ile korele: un bağlı Pgst-4 Şekil 2C, gösterilmiştir. Değişkenliği azaltmak için RFP muhabiri: GFP / RFP bir oranı olarak ifade edildiğinde, floresan Pdop-3 yeteneğini gösteren 384 plaka (2B Şekil 2A varyasyon katsayısı karşılaştırmak) karşısında kuyudan yüksek tekrarlanabilir hale gelir . Şekil 3 ile RFP GFP göreli indüksiyon gösterildiği gibi bir SKN-1 ksenobiyotik aktive (38 mcM juglone'un) 384 plaka boyunca son derece sağlam ve tekrarlanabilir. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 hacim karşı solucanlar sayısı vazgeçtik. Worms yaklaşık 2/μl seyreltilir ve bir stereomikroskopta manuel sayım için 24 plaka halinde dağıtıldı. N = 8 kuyu hacim başına. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Toplam 384 plaka boşaltılan solucanlar floresan tekrarlanabilir. Worms, yaklaşık 2.5/μl ve 30 ul seyreltilir 384 plaka her kuyuya dağıtılır oldu. Tüm kuyuların GFP (A) ve TTT (B) floresan varyasyon katsayısı% 9 altında vardı. (C) GFP floresan yüksek RFP floresan ilişkilidir. (D)% 6 altında RFP için GFP oranı hesaplanması için varyasyon katsayısı azaltılmış (A, B, ve D) Düz çizgiler anlamına gelir gösterir ve kırık çizgiler, ortalamanın altında veya üstünde üç standart sapma gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Pgst-4 Şekil 3 Etkinleştirme: GFP sağlam ve tutarlı. Yaklaşık 75 L4 solucanlar 384 plaka ve 38 mcM juglone'un tüm kuyulara dağıtıldı diğer her sütun eklendi. GFP ve RFP floresan inkübasyon 21 saat sonra ölçüldü. Ortalama bağıl floresan tüm kontrol oranları (1.0) ve juglone'un kuyuları (8,9) katı çizgilerle işaretlenmiştir. Ortalama kontrol yukarıdaki üç standart sapma ve juglone'un ortalama altında kırık hatları ile işaretlenmiştir.

<ol><li>Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-throughput+screen+identifies+inhibitors+of+the+Schistosoma+mansoni+redox+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade.</a> PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).</li>
<li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+small+animal+models%2C+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li>
<li>Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+a+versatile+platform+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery.</a> Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).</li>
<li>WormBase [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbase.org">http://www.wormbase.org</a> (2012).</li>
<li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).</li>
<li>Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WD40+repeat+protein+WDR-23+functions+with+the+CUL4%2FDDB1+ubiquitin+ligase+to+regulate+nuclear+abundance+and+activity+of+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).</li>
<li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide-responsive+genes+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).</li>
<li>Tullet, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+inhibition+of+the+longevity-promoting+factor+SKN-1+by+insulin-like+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans.</a> Cell. 132, 1025-1038 (2008).</li>
<li>Oliveira, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-adapted+stress+and+longevity+gene+regulation+by+Caenorhabditis+elegans+SKN-1%2FNrf%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf.</a> Aging Cell. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8, 258-269 (2009).</li>
<li>Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+chemoprevention+mechanisms+mediated+through+the+Keap1-Nrf2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway.</a> Antioxid Redox Signal. , (2010).</li>
<li>Kwak, M. K., Kensler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+NRF2+signaling+for+cancer+chemoprevention%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).</li>
<li>Leiser, S. F., Miller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+signaling%2C+a+mechanism+for+cellular+stress+resistance+in+long-lived+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice.</a> Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).</li>
<li>Link, C. D., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+transgenes+for+study+of+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).</li>
<li>Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1%2FNrf2+inhibits+dopamine+neuron+degeneration+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+methylmercury+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity.</a> Toxicol Sci. , (2010).</li>
<li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+inexpensive+method+to+screen+for+common+foods+that+reduce+the+action+of+acrylamide%2C+a+harmful+substance+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food.</a> Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).</li>
<li>Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+extrasynaptic+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).</li>
<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%2C+a+Practical+Guide%22">C. elegans, a Practical Guide</a>. , Oxford University Press. (2005).</li>
<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).</li>
</ol>

Biz kültür için bir yöntem mevcut ve transgenik nematodların çok sayıda dağıtım. Kültür solucanları için kullanılan ekipman, moleküler klonlama gerçekleştiren laboratuarlar için standart ve sıvı taşıma ve çok sayıda mikropleytin işleme laboratuarları için standart floresan ekipman. Diğer çok sayıda canlı C. dağıtım yöntemleri elegans pahalı ekipmanlar 19 sıralama parçacık gerektirir. Pgst-4: GFP tahlil kap &#39;n&#39; yaka transkripsiyon faktörlerinin küçük molekül modülatörler için...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> LB besiyeri </td><td> Araştırma Ürünler International Corp </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Terrific suyu </td><td> Araştırma Ürünler International Corp </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy ™ HT Multi-mode Mikroplaka Okuyucu </td><td> BioTek </td><td></td><td> Filtreler: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo seçin Dispenseri </td><td> BioTek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solucan dağıtım şişesi </td><td> Güney Scientific Inc, Micanopy, FL </td><td></td><td> Özel (352) 284-2531 toplandı </td></tr><tr><td> 384 mikroplaka </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Nefes sızdırmazlık bandı </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-hidroksi-p-naphthoqinone) juglone&#39;un </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglone&#39;un DMSO içinde çözülür </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans transgenik suşu </td><td> Yazarın laboratuvarı </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4: GFP ve Pdop-3: RFP </td></tr></tbody></table>

floresan ile yüksek verim tarama ve biyoalgılayıcı c. elegans suşlarının

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Yüksek verim tarama (HTS), biyolojik süreçler kimyasal modülatörleri tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Ancak, hücre kültürü modelleri kullanarak ekranlar tanımlanan birçok bileşikler genellikle, in vivo 1-2 toksik ya da farmakolojik olarak inaktif olarak bulunmuştur . Tüm hayvan modellerinde de Eleme Bu tuzaklardan kaçınmak ve ilaç geliştirme yolunu düzene yardımcı olabilir. C. elegans, iyi HTS için uygun bir çok hücreli bir model organizmadır. Küçük (&lt;1 mm) ve ekonomik kültürlü ve sıvılarda reçete edilmesi C. elegans, ilaç modu-aksiyon 3 hızlı ve ayrıntılı kimlik izin, en deneysel olarak izlenebilir hayvan modellerinde de biridir. Biz kültür için bir protokol tanımlayan ve C floresan suşları dağıtım kimyasal kütüphaneleri veya belirli bir gen ifadesini değiştiren çevresel kirleticiler tespit yüksek verim tarama için elegans. Çok sayıda gelişimsel senkronize solucanlar, sıvı kültüründe yetişen hasat, yıkanmış ve belirli bir yoğunlukta asılı. Worms peristaltik bir sıvı dağıtıcı kullanarak siyah, düz tabanlı 384-kuyucuğu sonra eklenir. Küçük moleküllerin kimyasal bir kütüphane ya da test örnekleri (örneğin, su, gıda, veya toprak), solucanlar ile kuyu eklenebilir. In vivo olarak, gerçek zamanlı floresan bir floresan mikroplak okuyucu ile ölçülür . Bu yöntem, C herhangi bir indüklenebilir gen adapte edilebilir uygun bir muhabir kullanılabilir olduğu elegans. Birçok indüklenebilir stres ve gelişim transkripsiyonel yollar C ile tanımlanır elegans ve GFP transgenik muhabiri suşları zaten onları 4 pek çok var. Uygun transgenik gazetecilere ile kombine edildiğinde, yöntem yolağı modülatörleri ekrana veya çevresel kirleticiler için sağlam bir biyosensör deneyleri geliştirmek için kullanılabilir. Biz C. göstermektedir elegans kültür ve dağıtım protokolü bir HTS testi ile C. izlemek için geliştirilen elegans kap &#39;n&#39; yaka transkripsiyon faktörü SKN-1. SKN-1 ve memeli homologu Nrf2 5-10 ve ksenobiyotik oksidatif stres sırasında sitoprotektif genler aktif hale getirin. Nrf2 memeliler, kanser nörodejenerasyon ve kronik inflamasyon gibi pek çok yaşa bağlı bozukluklar korur ve büyük bir kemoterapötik hedef 11-13 haline gelmiştir. Tahlil -4 SKN-1 hedef geni gst 14 GFP transgenik muhabiri dayalı , glutatyon-s transferaz 6 kodlar. Gst -4 muhabiri SKN-1 etkinleştirin ve akrilamid ve metil-civa 15-16 gibi kirleticilerin düşük seviyelerde tespit etmek için kullanılan olabilir ksenobiyotik ve oksidatif kimyasallar için de bir biyosensör.

Sıvı tabanlı kültür ve dağıtımı için bir prosedür<em&gt; C. elegans</emFloresan muhabiri proteinleri ifade&gt; suşları pahalı sıralama ekipman gerektirmez açıklanmıştır. Bu yaklaşım çok sayıda indüklenebilir uygulanabilir<em&gt; C. elegans</em&gt; Ilaç keşfi veya bulaşanların biyoalgı için genlerin.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

Yüksek kapasiteli tarama (HTS), biyolojik süreçlerin kimyasal modülatörlerini belirlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Ancak, ... içerisinde tanımlanan birçok bileşik

Bu video, kimyasal kütüphanelerin yüksek kapasiteli taraması veya kimyasal ya da çevresel ajanların spesifik protein aktivitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek amacıyla çevresel kirleticilerin tespiti için floresan CL gans suşlarının kültürü ve dağıtımıyla ilgili bir yöntemi göstermektedir. CL elgan'da, önce solucanlar için besin olarak bakteriyel kültürler hazırlanır ve GFP transgenik senkronize solucanlar kültüre edilir.Ardından 0,5 ila 2 milyon solucan toplanır, yıkanır ve 3 adet 84 kuyucuklu mikrotitrasyon plakasına paylaştırılır; daha sonra kimyasal bir kütüphaneden alınan küçük moleküller veya su, gıda veya toprak gibi test örnekleri solucanlara eklenir. Son olarak, solucanların floresan seviyeleri bir mikroplaka okuyucu ile ölçülür.Floresans yoğunluklarının veri analizi, indüklenebilir transkripsiyonel yolları modüle eden veya çevresel kirleticilerin tespitine olanak tanıyan küçük moleküllerin ortaya çıkarılmasını sağlar. Bu tekniğin, in vitro ve hücre kültürü tabanlı assayler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, in vivo ortamda toksik veya inaktif olan bileşiklerle zaman kaybının önlenmesidir. Bu yüksek kapasiteli yöntem, çeşitli indüklenebilir yolları modüle eden küçük moleküllerin tanımlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntem küçük molekül kütüphanelerinin yüksek verimli taraması için geliştirilmiş olsa da, gıda ve çevresel örneklerdeki kontaminanların biyosensörle tespitinde de uygulanabilir. Prosedür, laboratuvarım teknikeri Andrew Dine ve laboratuvarım doktora sonrası araştırmacısı Q long tarafından gösterilecektir. Bakteriyel solucan yemini önceden hazırlayın.500 mililitre, mililitre başına 50 mikrogram streptomisin ile desteklenmiş terrific broth'un, beş mililitre doygun e coli OP 50 ile inokülasyonu yaparak başlayın. Kültürü bir çalkalayıcıya yerleştirin ve 37 °C'de gece boyunca büyütün.Ertesi gün, kültürü 10 adet 50 mililitrelik tüpe bölün. Ardından tüpleri soğutmalı bir santrifüje yerleştirin ve 2, 500 RCF hızında 20 dakika boyunca döndürün. Döndürme işleminin ardından, her bir bakteri peletini 10 mililitre sıvı nematod büyüme besiyerine veya NGM'ye resüspande edin.Süspansiyonları yatay olarak çalkalayın. Bakterileri yeniden süspande etmek için 15 dakika boyunca orbital çalkalayıcı kullanın. Ardından, bakteri kültürünü 4 °C'de 20 dakika boyunca 2,500 RCF'de santrifüjleyin.NGM'yi dekante edin ve bakteri peletini tartın. Ardından, eşit hacimde NGM tamponu ekleyin ve peletleri vorteksleyerek yeniden süspande edin. Son olarak, yeniden süspande edilen bakteri kültüründen üç mililitreyi 15 mililitrelik tüplere paylaştırın ve ihtiyaç duyulana kadar minus 20 degrees Celsius'ta saklayın.Bu gösterimde, stres indükleyen Xeno Duke kredisinin transkripsiyon faktörü Sskn one üzerindeki etkisi bir örnek olarak ölçülecektir. Sskn one'ın, oksidatif ve xenobi stresleri sırasında sitoprotektif genleri aktive ettiği bilinmektedir. İki floresan konstrükt taşıyan Trenchgenic c gans hattı VP 5 96'nın büyük ölçekli bir kültürü hazırlanır.VP 5 96 solucanları, transkripsiyon faktörünün aktivitesini izlemek için kullanılan GFP'yi yönlendiren GST dört promotörü ile Sskn bir ve solucan sayısı normalizasyonu için standart olarak kullanılan RFP'yi yönlendiren DOP üç promotörünün her ikisini de eksprese eder.DOP three, bir dopamin reseptörü promotörüdür ve vücut genelindeki nöronlarda konstitütif olarak eksprese edilir. Örnekte, ksenobiyotik maddelerin sskn one'ı güçlü bir şekilde aktive ettiği ve GS T four promotöründen eksprese edilen GFP miktarını artırdığı göz önüne alındığında, kültürleri hazırlamak için 150 milliliters N NGM tamponu, 1.5 milliliters LB, 150 microliters 1 molar kolesterol ve 75 microliters 100 milligrams per milliliter Streptomisin'i birleştirerek başlayın. LB eklemek, solucanların cam ve plastik malzemelere yapışmasını önlemeye yardımcı olur, ancak bu miktar bakteriyel büyümeyi desteklemek için yeterli değildir.Karışımı sterilize etmek için filtreleyin, ardından bir litrelik steril bir erlene aktarın ve GR yetişkin solucanlarından yumurtaların salınması için erleni kenara alın. Solucanları santrifüjleyerek ve süpernatant berraklaşana kadar NGM besiyerini yenileyerek bakterileri solucanlardan yıkayın. Solucanları steril suda yeniden süspanse ederek ikinci kez yıkayın ve santrifüjleme işleminin ardından tekrar santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve tüpü 3,75 mililitre steril su ile doldurun. Bir mililitre ev tipi çamaşır suyu ve 250 mikrolitre 10 normal sodyum hidroksit ekleyip tüpü hemen beş ila altı kez tersyüz ederek karıştırın. Solucanlar çamaşır suyuna dört dakika boyunca maruz kaldıktan sonra tüpü bir rotatora yerleştirin.Tüpü bir stereo mikroskobun altına yerleştirin. Yetişkinlerin çoğu lizis olmuş olmalıdır. Lizis gerçekleştikten sonra kalan yetişkin solucanların lizisine yardımcı olmak için tüpü 15 ila 20 kez kuvvetlice sallayın; toplam beş dakika tamamlandığında, tüp dolana kadar steril su ekleyin.Yumurtaları toplamak için tüpü beş altı kez alt üst ederek karıştırın. Tüpü 500 RCF'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Yumurtaları, 10 mililitre steril su içerisinde yeniden süspanse ederek, santrifüjleyip süpernatantı uzaklaştırarak üç kez yıkayın.Ardından, 100 µL'lik yumurta örneğini 10 mL NGM tamponu ekleyerek 100 kat seyreltin. Daha sonra, mikroskop altında bir Petri kabı kapağına beşer µL'lik üç alikot pipetleyin. Üç ayrı beş µL'lik alikottaki yumurta sayısını sayın.Toplam yumurta sayısını tahmin etmek için, NGM tamponu içeren erlene 200.000 ile 2 milyon arasında yumurta ekleyin ve kültürü 20 °C'de 100 RPM hızında çalkalayın. Yumurtalar erlene eklendikten en az 16 saat sonra, süspansiyon halindeki solucan kültüründen yaklaşık 0,5 mL almak için steril serolojik pipet kullanın.Steril bir Petri kabı kapağına üç adet beş µL damla pipetleyin. Solucanları felç etmek için kapağı bir ila iki dakika boyunca -20 °C dondurucuya yerleştirin; solucanlar felç olduktan sonra, toplam sayıyı tahmin etmek için bir stereo mikroskop yardımıyla beş µL başına düşen ortalama canlı yumurtadan çıkmış solucan sayısını sayın.Daha önce hazırlanmış olan dondurulmuş OP 50 bakteri kültürünü birkaç dakika boyunca tezgah üzerinde bekleterek çözdürün. Ardından, her 500.000 çıkmış solucan başına üç mililitre %50 OP 50 ekleyin. Balonu 20 °C'de 100 RPM hızında çalkalayın.Solucanlar yaklaşık 51 saat içinde L4 larva ve genç yetişkin evrelerine gelişecektir. İnkübasyon boyunca bakteri miktarını görsel muayene ile izleyin. Ortam berraklaşırsa daha fazla bakteri ekleyin.Süspansiyon halindeki solucan kültüründen yaklaşık 0.5 millilitersini standart bir NGM agar plakasına aktarmak için steril bir serolojik pipet kullanın. Solucanların çoğunun L4 larvaları ve genç yetişkinler olduğundan emin olmak için onları bir stereo mikroskop altında inceleyin; parlak alan mikroskobisi altında, L4 larvalarının vücutlarının ortasında ventral bir şeffaf nokta bulunur. Genç yetişkinler ise biraz daha büyük olacaktır ve şeffaf noktaları bulunmayacaktır.Ardından, solucan kültürünü steril 50 milliliter tüplere çekin. Tüpleri çeker ocak içindeki bir tüp rafına yerleştirin ve çatlamamış yumurtaların veya gelişmeyen solucanların çökmesine izin verin. Bunlar, gelişmiş solucanlara göre daha yavaş çöker.10 dakika sonra, çatlamamış ve gelişmemiş solucanları içeren süpernatantı aspire ederek uzaklaştırın; her pelete yaklaşık 10 milliliters NGM tamponu ekleyin ve tüpleri hafifçe çalkalayarak solucanları süspande edin. Tüm solucanları tek bir 50 milliliters tüpte toplayın. Sallanan kovalı santrifüjde 500 RCF'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin.Ardından, solucanları yıkamak için 50 mililitre %1lb'li NGM içinde yeniden süspande edin. Bakterileri uzaklaştırmak için bu işlemi üç ila dört kez tekrarlayın. Tüpü, NGM artı LB tamponu ile 50 mililitreye tamamlayın.Bunu, içinde manyetik karıştırıcı çubuk bulunan özel bir solucan dağıtım balonuna boşaltın ve bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin. Dağıtım balonu ve dağıtıcı kasetindeki boş alanı doldurmak için minimum yaklaşık 20 milliliters veya 60,000 solucan gereklidir. Daha önce gösterildiği gibi, üç adet beş microliter damladaki solucan sayısını sayın.NGM artı LB içerisinde, beş mikrolitrelik damla başına 12 ila 15 solucan konsantrasyonuna ulaşacak şekilde sayım yapıldıktan sonra, her bir 3 84 kuyucuklu plaka için yaklaşık 35.000 solucan veya 11,5 mililitre süspansiyon halindeki solucan gereklidir. Dispansere 10 mikrolitrelik bir dağıtım kaseti yerleştirin ve %70 etanol ile hazırlama (priming) yaparak sterilize edin. Steril su ile hazırlama yaparak etanolü durulayın.Dağıtıcı kasetin ucunu, manyetik karıştırıcının hareketini bozmayacak şekilde, hemen üzerine gelecek şekilde erlene yerleştirin. Solucanların erlen boyunca süspansiyon halinde kaldığından emin olun. Dağıtıcıyı, düşük hızda ve iki ön darbe (prime ve run) ile solucanları dağıtacak şekilde programlayın. En az 10 milliliters süspansiyon halindeki solucanı dağıtın.Solucanların tüplerde çökelmesini önlemek için, test bileşiklerini halihazırda içeren mikrotitrasyon plakalarını hızla doldurun. Bu aşamada, önceden mikrotitrasyon plakasına yüklenmiş olan test bileşiği kullanılır. Parlama. Kuyucuklarda toz birikmesini önlemek için plakaları nefes alabilen bantla mühürleyin.Plakaları, analiz için uygun sıcaklıktaki bir inkübatör içerisinde yer alan çalkalama platformuna yerleştirin. Hava akışını kısıtlayabileceği için plakaları üst üste istiflemeyin. Her bir kuyucuğun floresan yoğunluğunu uygun emisyon ve eksitasyon dalga boylarında ölçmek için hedef plağı bir mikroplaka okuyucuya yerleştirin.GFP için kullanılan filtreler 485 nm eksitasyon ve 528 nm emisyondur. RFP için kullanılan filtreler ise 540 nm eksitasyon ve 590 nm emisyondur. Plaka okunduktan sonra, GFP'nin RFP'ye oranını hesaplayın ve bireysel işlemlerden kaynaklanan floresan yoğunluğundaki kesin kat farkını belirlemek için bu oranı, aktive edici bileşik içermeyen kontrol kuyucuklarının okumalarıyla normalize edin.Burada gösterilen SSKN deneyi, solucanların stereo mikroskop ile manuel olarak sayıldığı bir suş olan, kromozomal olarak entegre çift raporlama sistemini kullanır. Solucan sayısı, 0,94 R kare değeri ve 0,0001'den küçük p değeri ile dağıtılan hacimle korelasyon göstermiştir. Bu durum, her kuyucuğa dağıtılan solucan sayısının, dağıtılan hacim ayarlanarak kontrol edilebileceğini göstermektedir.Bu şekillerde, solda gösterilen kuyu başına toplam GFP floresansı ve sağda gösterilen kuyu başına RFP floresansı, 384 kuyulu bir plaka genelinde kuyudan kuyuya oldukça tekrarlanabilirdir. XS, her kuyuda ölçülen bağıl floresansı belirtir. Düz çizgiler ortalamaları, kesikli çizgiler ise tüm kuyuların ortalama floresansının üç standart sapma üstünü veya altını göstermektedir; varyasyon katsayısı %9'un altındadır. Bu şekilde gösterildiği üzere, GST 4 promotöründen gelen GFP floresansı, 384 kuyu genelinde DOP 3 promotöründen gelen RFP floresansı ile 0,62 R kare değeri ve 0,0001'den küçük p değeri ile doğrusal olarak koreledir.Bu nedenle, indüklenebilir olmayan RFP raporlayıcısı, indüklenebilir GFP raporlayıcısını normalize etmek için kullanılabilir. GFP'nin RFP floresanına oranı ifade edildiğinde, 384 kuyucuklu bir plaka boyunca kuyucuktan kuyucuğa yüksek düzeyde tekrarlanabilir hale gelir.GFP'nin RFP'ye oranının hesaplanması, varyasyon katsayısını %6'nın altına indirmiş ve burada gösterildiği üzere, DOP üç promoter RFP raporunun değişkenliği azaltma yeteneğini kanıtlamıştır. SK N bir aktive edici ksenobiyotik ile RFP'ye göre GFP indüksiyonu, 384 kuyucuklu bir plaka genelinde güçlü ve yüksek derecede tekrarlanabilirdir; tüm kontrol ve due GLO kuyucuklarının ortalama bağıl floresan oranları düz çizgilerle işaretlenmiştir. Kontrol ortalamasının üç standart sapma üzeri ve dlo ortalamasının üç standart sapma altı kesikli çizgilerle işaretlenmiştir.Tek bir kez öğrenildiğinde, bir solucan kültürü başlatma işlemi birinci günde yaklaşık bir saat sürer; toplama ve dağıtma işlemleri ise uygun şekilde yapıldığında yaklaşık iki saatte tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, başlangıçta en az 60.000 solucan ile başlanması ve dağıtma sırasında solucanların süspansiyon halinde tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedür takip edilerek yapılan taramaların ardından, örneğin diğer indüklenebilir yollar için rapor dizileri, diğer yollar için modülatörler geliştirmek amacıyla uygulanabilir.Bu teknik, yüksek kapasiteli tarama ve biyosensörleme alanlarındaki araştırmacıların, küçük moleküllü yol modülatörlerini hızla tanımlamalarına veya çevresel kirleticileri tespit etmelerine olanak sağlayabilir. Bu videoyu izledikten sonra, indüklenebilir transkripsiyonel yollar için yüksek kapasiteli tarama yaparken veya çevresel kirleticiler için birden fazla örneği test ederken, floresan elegan suşlarının nasıl kültüre edileceği, dağıtılacağı ve ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

high-throughput-screening-biosensing-with-fluorescent-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

Kaynak: Anderson, Q. L. ve diğerleri. Yüksek verimli, Yüksek içerikli, Sıvı bazlı bir C. elegans Patosystem. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, konakçı-patojen etkileşimleri sırasında gen yıkımlarını incelemek için Caenorhabditis elegans kullanan yüksek verimli bir tarama yöntemini göstermektedir. Patojen kaynaklı solucan öldürmenin etkilerini değerlendirmek için devrilme solucanlarının hazırlanması ve bunların tahlil plakalarına aktarılması prosedürünü özetlemektedir.

C. elegans Knockdown'ların Taranması için Çok Kuyulu Sıvı Bazlı Bir Test

Kaynak: Ali, I. ve diğerleri. Caenorhabditis elegans sağlığına etkisi olan mikrobiyal izolatların yüksek verimli taraması. J. Vis. Exp. (2022)Bu video, Caenorhabditis elegans'ta bağırsak bakterilerinin stres direncini nasıl etkilediğini değerlendirmek için yüksek verimli bir floresan testi göstermektedir. Patlamış bağırsak granüllerinden mavi floresansı takip ederek, test bakterilerine maruz kalan solucanlarda daha erken ölüm sinyallerini ortaya çıkarıyor.

Mikrop-Solucan Etkileşimlerini İncelemek İçin Yüksek Verimli Floresan Tahlil

Niceliksel kemotaktik tepkiyi değerlendirmek için bir...

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Model organizma Caenorhabditis elegans'ta mitokondriyal inhibitörlerin etkilerinin in vivo tespiti ve potansiyel arttırıcı bileşiklerin tanımlanması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu protokol, mitokondriyal fonksiyonu modüle eden bileşikler için ilaç kütüphanelerini taramak için kullanılabilir.

Bir taranabilir<em&gt; İn Vivo</em&gt; Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Burada biz hızla nematodunun büyüme medya agar, yüzlerce Caenorhhabditis elegans tutarlı numaraları iyi başına 96-şey kültür plakaların üretimi için basit bir protokol tanımlamak. Bu kültürler tüm canlıların fenotipik tarama için yararlıdır. Yanlısı uzun ömürlü efektleri için ekran kimyasallara bu kültürler kullanarak üzerinde odaklanabilir.

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Burada bir uyarlanabilir, tüm ana bilgisayar, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri çalışma ve ilaç keşfi için kullanılması için kullanılması gereken yüksek içerik tarama aracı bir protokol açıklayın.

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Bağırsak mikropları, konakçılarının sağlığını spesifik veya korunmuş mekanizmalar yoluyla olumlu veya olumsuz yönde etkileyebilir. Caenorhabditis elegans , bu tür mikropları taramak için uygun bir platformdur. Mevcut protokol, solucan sağlığı için bir vekil olarak kullanılan nematod stres direnci üzerindeki etki için 48 bakteri izolatının yüksek verimli taramasını açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Health Üzerinde Etkisi Olan Mikrobiyal İzolatların Yüksek Verimli Taraması

Burada, geniş alan mikroskobu görüntülerinde tek tek solucanların otomatik segmentasyonu için geliştirdiğimiz bir derin öğrenme sistemi olan SegElegans'ın daha sonra ImageJ gibi görüntü analiz yazılımlarında kullanılmak üzere etkin bir şekilde kullanılmasına ilişkin talimatlar sunuyoruz. Sistemi hem çevrimiçi hem de çevrimdışı kullanmanın yollarını sunuyoruz.

SegElegans Kullanarak C. elegans Floresan Görüntülerinin Otomatik Analizi

Öğrenin, yüksek verimli tarama ve çevresel biyoalgılama için C. elegans'ın floresan suşlarını nasıl kültüre edip dağıtacağınızı. Bu yöntem, canlı organizmada gen ifadesi değişikliklerini ölçerek güvenilir sonuçlar sunar.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

Daha fazla video keşfet