Kemirgenler ve İnsanlar Burun Koku Kök Hücreler Yalıtımlı

Bu prosedürün genel amacı, moleküler anomalileri belirlemek veya patolojik ya da travmaya uğramış beyni onarmak amacıyla sıçanlardan veya insanlardan nazal olfaktör kök hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle nazal kaviteden olfaktör mukoza biyopsilerinin cerrahi olarak toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, altta yatan lamina propriadaki ektomezenkimal kök hücrelere odaklanmak için olfaktör epitel ve onun epitel kök hücreleri elenir; sonrasında kemirgen dokusu disosiye edilerek veya cam lam altında kültüre edilen insan implantlarından dışarı büyüyen hücreler toplanarak bu hücreler izole edilir.

Prosedürün son adımı, nöron benzeri hücrelere farklılaşmayı tetikleyerek kök hücre kürelerini büyütmektir. Nihayetinde tüm olfaktör mukozanın eksplantasyonu ile bireyselleştirilmiş kök hücreler elde edilir. Yüzer küreler veya nöron benzeri hücreler, beyin hastalıklarındaki moleküler belirteçlerin tanımlanmasında veya sinir sistemindeki hasarın onarılmasında kullanılabilir.

Olfaktor mukozadan insan ve kemirgen nazal kök hücrelerini izole etme yöntemini açıklıyoruz. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kök hücrelerin sinir dokusuna ait olması, her canlı bireyde kolayca erişilebilir olması ve patolojik beynin teşhisi veya onarımı için kullanılabilmesidir. Bir KBB cerrahı olarak, çeşitli klinik çalışmalar için yüzlerce nazal biyopsi gerçekleştirdim.

Prosedür güvenlidir ve uygulanabilir. Ve lokal genel anestezi. İnsan veya rod, nazal veya faktör kök hücre kültürleri konusunda uzmanlığa sahip genç bir bilim insanıyım.

Bunlar yüksek hazırlama hızı sergiler ve nöral hücre tiplerine farklılaşma eğilimine sahiptirler. Amnezi ve nörodejeneratif hastalıkların hayvan modellerinde etkili oldukları kanıtlanmıştır. Mukozanın toplanmasından önce, temiz bir kültür kabininde DMEM-F12 kültür ortamı hazırlanmış 3 adet 35 milimetrelik Petri kabı hazır bulundurulur.

Şimdi, sodyum pentobarbital ile sıçanın derin anesteziye girdiğini ayak parmağı sıkıştırma testiyle doğruladıktan sonra, dekapitasyon yoluyla ötanazi yapın. Kafayı izole edin ve deriyi soyun. Alt çeneyi makasla çıkarın ve kendi penseti yardımıyla, ön dişlerin arkasından başlayarak her iki taraftaki yüz kaslarını temizleyin.

Ron Jur kullanarak, burun boşluğunu örten kemiği her seferinde bir taraf olacak şekilde çıkarın. Burun arka kısmında yer alan turuncu-kahverengi organlar şeklinde olfaktör konkalar görünür hale geldiğinde, konkaları penset yardımıyla dikkatlice uzaklaştırın.

26 gauge bir iğne kullanarak; dokuyu perpendicular plate arkı, CRI form plate ve burun boşluğu tavanı boyunca üç hat üzerinden keserek septum üzerinde yer alan olfaktör mukozayı izole edin. Her iki taraftan biyopsiler toplayın ve bunları A-D-M-E-M ham F 12 ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın. Bu prosedür, ötanazyanın başlangıcından itibaren 10 dakikadan fazla sürmemelidir.

Şimdi mukusu temizlemek için, ilgili yerel etik kurulların belirlediği kurallar çerçevesinde, biyopsileri besiyeri dolu Petri kaplarına iki kez aktarın. Bu işlem bir kulak burun boğaz cerrahı tarafından gerçekleştirilmeli ve her ayaktan hastanın, 0 veya 30 derecelik rijit bir endoskop kullanılarak yapılan işlem için bilgilendirilmiş onam formunu imzalamış olması gerekir. Her iki burun boşluğunu inceleyin ve polip veya herhangi bir enflamatuar lezyon varlığı olup olmadığını değerlendirin.

Septum devyasyonunu dikkate alarak en uygun burun boşluğunu seçin. Pamuklu bir aplikatör kullanarak, derin bir kesiyle birlikte epinefrinli lidokain gibi lokal bir anesteziyi 10 dakika boyunca uygulayın. Etmoid pensle, orta konkanın medial yönündeki kökünden veya septumun dorsal medial bölgesinden iki kare milimetrelik bir biyopsi alın.

Burada kök bölgesinden alınan biyopsiyi gösteriyoruz. Olfaktör biyopsi daha sonra steril bir iğne kullanılarak, içine 1 mL DMEM hem F 12 doldurulmuş steril 2 mL'lik bir tüpe aktarılır. Biyopsinin kültür ortamına tamamen daldığından emin olmak için tüpü ters çevirin.

Tüpü soğutmalı bir kaba yerleştirin ve araştırma laboratuvarına taşıyın. Bu aşamada biyopsi, belirli beyin hastalıklarına odaklanan karşılaştırmalı moleküler çalışmalar için olduğu gibi kullanılabilir veya kök hücre üretimi için işlenebilir. İnsan veya sıçan biyopsilerini yıkayın ve DMEM ham F 12 ile bir mililitre dis paste ile doldurulmuş bir Petri kabında inkübe edin.

Bir saat boyunca 37 °C'de iki solüsyonla bekletin. Ardından, insan veya sıçan olfaktör epiteli, kırılmış ters ışıklandırmaya sahip bir diseksiyon mikroskobu altında, mikro spatula kullanılarak alttaki lamina propria'dan ayrılır. Olfaktör epitel siyah bir arka plan üzerinde yarı saydam görünürken, lamina propria beyaz bir arka plan üzerinde çizgili turuncu-kahverengi görünür.

Saflaştırıldıktan sonra epitel gri, lamina propria ise kahverengi görünür; lamina propriayı DMEM/F-12 ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın. Eğer doku bir kemirgenden geliyorsa, lamina propriayı iki adet 25 gauge iğne ile küçük parçalara bölün. Ardından parçaları, içinde 1 mL kollajenaz 1 A bulunan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dokuyu ayrıştırmak için steril plastik bir pipet kullanın.

Ardından tüpü 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Disosiasyonu sonlandırmak için tüpü nazikçe sallayın, kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ekleyin ve 200 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini kültür ortamında resüspande edin ve plastik kültür kaplarına ekleyin.

Şimdi, eğer doku insan dokusuysa, limonu uygun şekilde üç veya dört parçaya bölün. Her bir şeridi, dört kuyucuklu bir plaka içerisindeki iki santimetre çapındaki kendi kuyucuğuna yerleştirin ve dokuyu steril 1,3 santimetre çapındaki cam lamellerle örtün.

Ardından, her iki doku tipi için her bir kültür kabına 500 µL kültür ortamı ekleyin. Kültür ortamını her iki ila üç günde bir yenileyin. Beş ila yedi günlük kültürleme süresinden sonra, kök hücreler kültür kabını istila etmeye başlayacaktır.

Ve iki hafta sonra, hücreler konfluen hale gelmelidir. Konfluens sağlandığında, hücreleri pasajlayın ve kök hücre küreleri oluşturmak için kültür flasklarına aktarın.

Hücreleri iki günde bir, santimetrekare başına 16.000 hücre yoğunluğunda ön işlem görmüş flasklara yeniden ekleyin. Hücreleri, santimetrekare başına 0,2 mililitre takviyeli ortam ile besleyin. İki ila beş gün sonra, yüzen hücre kürelerini toplayın ve greftleme işleminden önce bunları ya yeniden ekleyin ya da disocie edin.

Koku alma stem hücrelerini nöron benzeri hücrelere farklılaştırmak için geliştirilmiş bir hücre tedavisi hayvan modeli. Hücreleri; B 27, penisilin, streptomisin, glutamin ve glutamat içeren nörobazal medyumda 21 gün boyunca kültüre edin ve ardından her üç günde bir medyum değişimi yapın. Nöron benzeri hücreler, ekimden sonraki beş ila yedi gün içinde, yani iki ila üç hafta sonra ortaya çıkmalıdır.

İnsan nazal olfaktör kök hücreleri eksplanttan dışarı büyümüş ve hızla çoğalmıştır. Tam konfluens bir veya iki hafta içinde sağlanabilirdi. Kök hücrelerin temel bir özelliği olan yuva oluşturma ve ekspresyonu; EGF ve FGF 2 ile takviye edilmiş serumsuz bir kültür ortamında polilizin üzerinde büyütüldüklerinde değerlendirildi, olfaktör kök hücreler sferler oluşturdu ve bu sferler serum içeren kültüre ekildiğinde gelişim gösterdi.

Besiyerinde, yaklaşık %50 GFAP eksprese eden hücreler, %15'e kadar tubulin eksprese eden hücreler ve %5'e kadar oligo-4 eksprese eden hücreler içeren hücre popülasyonları oluşturdular. Küreden türetilen hücreler takviyeli nöro-bazal kültür besiyerinde büyütüldüğünde, popülasyonun çoğu beta-üç tubulin eksprese eden nöron benzeri hücrelere dönüştü. Aynı nöron benzeri hücreler map2'yi de eksprese etti.

Böylece, kök hücrelerin kaderi bir sömestr içinde değiştirilebilir. Bu teknik, dört haftadan kısa bir sürede kolayca milyonlarca kök hücre üretebilir ve klinisyenlerin gelecekte otolog hücre transplantasyonu gerçekleştirmesine olanak tanır. Nazal refrakter biyopsiler, biyobelirteçlerin ve beyin hastalıklarının tanımlanmasında oldukça yararlıdır.

Yakın zamanda otizm için yeni aday genler bulma konusunda başarılı olduk. Otistik ve kontrol grubu bireylerden oluşan bir olfaktör kök hücre bankası kurmuş bulunmaktayız ve bu yapı diğer insan beyin bozukluklarını kapsayacak şekilde genişletilebilir.