Name: Kemirgenler ve İnsanlar Burun Koku Kök Hücreler Yalıtımlı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Keşfedin burun koku mukozası biyopsisi yöntemiyle sıçan ve insanlardan yetişkin kök hücre izolasyonunu. Bu güvenli teknik, sinir sistemi hasarının onarımı ve beyin hastalıklarında biyobelirteç tespiti için umut vadediyor.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, mali ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les Miyopatiler), PACA ve Irme Feder (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l&#39;Encéphale) tarafından desteklenmiştir. Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Enstitüsü) minnetle zaman atlamalı kayıt sırasında onu etkin yardım için teşekkür ederim.

1. Sıçanlar Koku Mukoza Koleksiyonu <ol><li> Temiz bir kültür kaput DMEM / HAM F12 kültür ortamı ile dolu üç adet 35 mm Petri kapları hazırlayarak başlayın. </li><li> Herhangi bir ötenazi yöntemi kurumun hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından önceden onaylanmış ve kalifiye personel tarafından yürütülen olmalıdır. Sıçan gibi ketamin / xylazine anestezi sodyum pentobarbital veya diğer enjektabl formları ile derin anestezi girdikten sonra, başını kesmek ve cilt çıkarın. Uçucu anestezikler kaçınılmalıdır. Anestezi yeterliliği dekapitasyon önce ayak tutam tarafından değerlendirilecektir. Makas ile alt çene çıkarın ve bir rongeur yardımı ile, her iki tarafta da yüz kasları yok. </li><li> Dişlerin arkasından başlayarak, bir rongeur nazal kavite, bir defada bir tarafı kaplayan kemik çıkarın. Turuncu / kahverengi organları burun arkasında bulunan koku alma konkalar görüş haline gelir. </li><li> İncelikli bir forseps ile konkalar atın. Dik plaka, kribriform plaka ve burun boşluğunun tavan ark: 26 iğne kullanarak, üç satır boyunca doku keserek septum yatarken koku mukozası izole. </li><li> Her iki tarafta biyopsileri toplayın ve bir DMEM / HAM F12 dolu Petri kabı aktarabilirsiniz. Bu prosedür, başlangıcından ötenazi itibaren 10 dakikadan daha uzun sürmemelidir. </li><li> Şimdi, mukus ortadan kaldırmak amacıyla, orta dolu Petri kutularına biyopsileri iki kez transfer. </li></ol> 2. İnsanlar Koku Mukoza Koleksiyonu <ol><li> Bu prosedür, ilgili yerel etik kurul (lar) uygun bir Kulak Burun Boğaz (KBB) cerrah tarafından gerçekleştirilen olmalı, ve her ayaktan bilgilendirilmiş onam formu imzalamanız gerekir. </li><li> 0 ° veya 30 ° rijit endoskop (4 mm çapında) kullanarak, her iki burun boşlukları varsayılan polip ya da herhangi bir inflamatuar lezyon varlığı incelemek ve değerlendirmek. Septum sapma dikkate alarak, en iyi nazal kavite seçin. </li><li> Bir pamuk aplikatör kullanarak, 10 dakika boyunca, adrenalin, lidokain gibi lokal anestezi uygulanır. </li><li> Throughcut etmoid forseps ile orta konka medial kök veya dorsomedial alanda septum ya bir iki milimetre kare biyopsi toplamak. </li><li> Olfaktör biyopsi sonra 1 ml DMEM / HAM F12 ile dolu 2 ml steril bir tüp içine, steril bir iğne kullanılarak aktarılır. Ters tüp İpucu biyopsi kültür ortamında dalmış olduğundan emin olun. </li><li> Buzdolabında bir kap içinde tüp takın ve araştırma laboratuvarı taşıma. Bu aşamada, biyopsi karşılaştırmalı moleküler çalışmalar için özel beyin hastalıkları odaklanmış veya kök hücre üretmek için işlenen tek başına kullanılabilir. </li></ol> 3. İnsan ve Rat Mukoza Koku Kök Hücre İzolasyonu <ol><li> DMEM / HAM F12 biyopsileri yıkayın. 37 1 saat için 1 ml dispase II çözeltisi (2.4 IU / ml) ile dolu bir Petri kabındaki biyopsileri inkübe ° C </li><li> Sonra, bir Kırınan ters ışık ile bir diseksiyon mikroskobu altında, mikro spatula kullanarak temel lamina propria olfaktör epitel kaldırılır. </li><li> Olfaktör epitel çizgili olan lamina propria ile karşılaştırıldığında daha ince ve siyah arka plan üzerine yarı saydam görünen turuncu / kahverengi. Beyaz bir arka plan üzerinde, epitel ve lamina propria, kahverengi, gri görünüyor. </li><li> Saflaştırılmış sonra, lamina propria DMEM / HAM F12 ile dolu bir Petri kabı içine aktarın. </li><li> Doku kemirgen ise, lamina propria, iki adet 25 gauge iğne ile küçük parçalar halinde kesin. Daha sonra, 1 ml kollajenaz IA ile dolu bir 15 ml tüp parçaları aktarın. </li><li> Tüp içinde, steril bir plastik pipet kullanarak, doku ayrıştırmaları. Sonra az 10 dakika, 37 tüp inkübe ° C </li><li> Ayrışma sonlandırmak için tüp hafifçe rock ve 9, Ca-özgür ve Mg-free PBS ml ve 5 dakika boyunca 200 g santrifüj ekleyin. </li><li> Plastik kültür kaplarına% 10 fetal sığır serumu, antibiyotik ve plaka ile desteklenmiş DMEM / HAM F12 kültür ortamı içinde hücre pelletini tekrar. </li><li> Şimdi, doku, insan ise, sonra 200 ila 500 mikron arasında değişen, kalınlığı 3 ila 4 adet lamina propria dilim. </li><li> Kendi 2 cm çapında kültür çanak içine her şerit yerleştirin ve steril 1.3 cm çapında cam kapak fişleri ile doku kapağı. </li><li> Sonra, her kültürün çanak kültür ortamı ul 500 (% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotik ile desteklenmiş DMEM / HAM F12) ekleyin. </li><li> Ya da doku tipi için, her 2 ila 3 gün kültür ortamı yenilemek. </li><li> Beş ila yedi gün sonra, kök hücre kültürü çanak işgal etmeye başlayacak ve iki hafta sonra konfluent olmalıdır. , Geçiş ulaştı ve kültür şişeler hücrelere transfer olduğunda confluency. </li></ol> 4. Küre Oluşumu ve Nöronal differeKoku Kök Hücreler, ntiation <ol><li> Kök hücre küre oluşturmak için, 37 şişeler az iki saat inkübe ° C poli-L-lisin. (METİN: 5 g/cm2). </li><li> Tedavi şişeler santimetre kare başına 16.000 hücre yoğunluğu hücreleri Plaka. </li><li> Her iki günde tamamlanan orta santimetrekare başına 0.2ml (DMEM / HAM F12, insülin, transferrin, selenyum (ITS-X,% 1), EGF (50 ng / ml) ve FGF2 (takviye ile hücreleri beslemek, 50 ng / ml)). </li><li> Iki ila beş gün sonra, kayan hücre küre ve ya yeniden plakalı toplamak veya hücre tedavisi hayvan modelleri aşılama önce onları ayrıştırmaları. </li><li> Nöron-benzeri hücreler içine koku alma kök hücrelerin ayırt etmek için, B-27, penisilin, streptomisin, glutamin ve glutamat içeren Neurobasal ortamda 21 gün için onları yetiştirmek. </li><li> Daha sonra her 3 günde bir orta değişiklikler yapmak. Nöron benzeri hücreler 2-3 hafta sonra görünmelidir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Burun insan eksplant outgrowing kök hücreler (Şekil 2A) hızlı bölünen ve confluency 1-2 hafta içinde ulaşılabilir. Stemness, bir anahtar özelliği, nestin ifade değerlendirildi (Şekil 2B). EGF (50 ng / ml) ve FGF2 (50 ng / ml) ile desteklenmiş bir serum serbest kültür ortamı ile poli-L-lizin büyüdüğü zaman, koku kök hücreler küre (Şekil 2C) neden olmaktadır. Serum içeren kültür ortamında yetişen yeni kaplama küre GFAP-ifade hücreleri (~% 50), tubulin ifade hücreleri (~% 10-15) ve O4 ifade hücreleri (~% 2-5) 9 (Rakamlar ortaya çıkmasına neden 2D-F). Ancak, küre-kökenli hücreler kaderi değiştirilebilir. Örneğin, B27 ve glutamat, β-III tubulin (Şekil 2G) ve map2 (Şekil 2H) ifade nöron-benzeri hücreler içine burun koku kök hücrelerin çoğu ile desteklenmiş bir Neurobasal kültür ortamında büyüdü. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, deney Genel şeması . Olfaktör mukoza biyopsileri, sıçan ve insan nazal kavite eksize. Eksplantlarındaki beyin hastalıkları biyobelirteçleri belirlenmesine yönelik karşılaştırmalı moleküler çalışmalar için başlı başına kullanılabilir. Lamina propria ve nöro-epitel arasındaki etkileşimler, koku alma kök hücreleri izole etmek için, 45 dakika sonra, bir mikro-spatula ile epitel kaldırılır dispase II enzim bozulur ve. Kemirgen koku alma kök hücreler daha kollajenaz IA ile lamina propria dissociating tarafından seçilir. Outgrowing kök hücrelerin bütün istila kadar insan doku, koku alma lamina propria adet cam lamel altında kültüre. Çoğalması sonra, uygun bir kültür ortamı kullanılarak, koku kök hücreler küre üretebilir veya nöron hücrelerine ayırt. Olfaktör kök hücreler için kullanılabilir) onarım beyin hastalıkları ya da travma veya ii) merkezi sinir sistemi hastalıkları moleküler belirteçleri tespit. Çizimler Servier Tıp Sanat yardımı ile yapılır. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2, burun, insan koku alma kök hücreleri Kültür ve farklılaşma . Serum içeren ortamda yetiştirilen lamina propria eksplant (A) büyüyen insan kök hücreleri, hızla bölünerek. Kök hücreler, stemness işaretleyici nestin (B) ifade eder. Poli-L-lisin kaplı plastik kaplama ve EGF ve FGF2 ile desteklenen bir serum serbest kültür ortamında yetiştirilen, koku kök hücreler küre (C) oluşturur. Küre kökenli hücrelerin, serum içeren kültür ortamında kaplama, doğuran GFAP-ifade hücreleri (~% 50), tubulin ifade hücreleri (~% 10-15) ve O4 ifade hücreleri (~% 2-5) 9 (DF). B27 ve glutamat ile desteklenmiş bir Neurobasal kültür ortamında yetişen, β-III tubulin (G) ve map2 (H) ifade nöron-benzeri hücrelere farklılaşırlar.

<ol><li>Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+techniques+for+biopsy+and+culture+of+human+olfactory+epithelial+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).</li>
<li>Ronnett, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+biopsies+demonstrate+a+defect+in+neuronal+development+in+Rett%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome.</a> Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).</li>
<li>Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+adhesion%2C+proliferation+and+death+in+neural+cultures+from+adults+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia.</a> Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).</li>
<li>Matigian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific%2C+neurosphere-derived+cells+as+models+for+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders.</a> Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).</li>
<li>Arnold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+epithelium+amyloid-beta+and+paired+helical+filament-tau+pathology+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease.</a> Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).</li>
<li>Boone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+stem+cells%2C+a+new+cellular+model+for+studying+molecular+mechanisms+underlying+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia.</a> PLoS One. , (2010).</li>
<li>McCurdy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+alterations+in+biopsied+olfactory+neuroepithelium+in+schizophrenia+and+bipolar+I+disorder+using+cell+culture+and+gene+expression+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses.</a> Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).</li>
<li>Roisen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+olfactory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Adult human olfactory stem cells.</a> Brain Res. 890, 11-22 (2001).</li>
<li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem+cells+from+adult+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa.</a> Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).</li>
<li>Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+nonepithelial+multipotent+cells+in+the+embryonic+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa.</a> Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).</li>
<li>Delorme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+nose+harbors+a+niche+of+olfactory+ectomesenchymal+stem+cells+displaying+neurogenic+and+osteogenic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties.</a> Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).</li>
<li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+olfactory+neural+progenitors+rescue+axotomized+rodent+rubrospinal+neurons+and+promote+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery.</a> Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).</li>
<li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+olfactory+neural+progenitors+promote+axotomized+rubrospinal+tract+axonal+reinnervation+and+locomotor+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery.</a> Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).</li>
<li>Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Effects+of+Adult+Human+Olfactory+Stem+Cells+on+Early-Onset+Sensorineural+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+mucosa+is+a+potential+source+for+autologous+stem+cell+therapy+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease.</a> Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).</li>
<li>Nivet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+nasal+olfactory+stem+cells+restores+neuroplasticity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li>
<li>Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+in+human+paraplegia%3A+a+3-year+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial.</a> Brain. 131, 2376-2386 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan teknikleri nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların yanı sıra, patolojik ya da travmatize beyin tamiri için bir araç nedenleri içine kemirgen ve insan olfaktör mukoza klinik araştırmalar için yararlı bir model. Protokol nispeten basittir ve deneyimli bir hücre biyoloğu tarafından kolayca yapılabilir. Biyopsi ve kültür teknikleri için başarı oranı yüksektir. Kritik adımlar <ul><li> Kemirgen olfaktör mukoza toplanması için, ötanazi ve son koku doku eksizyonu arasında 10 dakikalık bir zaman sınırı geçmemek üzere tavsiye edilir. </li><li> Kemirgen koku alma lamina propria ayrılma genellikle 10 dakika sonra elde edilir. kollajenaz IA kuluçka. Değilse, lamina propria float undissociated bit, 200 g santrifüj ve mekanik bir zamanda yeni hücreler replating önce Pasteur pipeti kullanarak kayan lamina ayrıştırmaları süpernatantı gün sonra toplamak için önerilir. Zaten bağlı hücreleri içeren ilk sıra taze kültür ortamı ile doludur. </li><li> Kemirgen doku daha küçük olan insan lamina propria, için, biz bir enzimatik ayrılma önermiyoruz. Doku dilimlenmiş ve her eksplant, plastik tabak alt ve cam lamel arasına yerleştirilir. Başarılı kültürler, kalınlık aralığı 200 ila 500 mikron eksplantlar içerir. </li></ul> Olası değişiklikler <ul><li> Geçerli protokol in vitro olfaktör nöronların üretmek için biraz değiştirilmiş olabilir. Bu amaçla, nöro-epitel kaldırılmaz ve tüm koku mukozası bir McIlwain kıyıcı (200 mikron kalınlığında) ile dilimlenmiş. Her eksplant, bir tabak içinde kaplama, kısmen bir saat süreyle kurutulur ve sonra FCS içeren kültür ortamı ile sulandırılır. Ilk gün kaplama sırasında, epitelyal ve mezenkimal hücreler eksplant büyür. Daha sonra, bu hücre tabakasının üstüne nöron atalarıdır göç ve nöronlar farklılaşırlar. </li><li> Koku alma kök hücrelerin Arıtma flow sitometri kullanılarak elde edilebilir. Özgül yüzey belirteçleri kağıdı 11 karakterizasyonu yayınlanan listeye alınabilir. </li><li> Nakli deneyleri için, koku alma kök hücre GFP pozitif sıçanlarda bir yük kullanmak mümkündür. Bu sıçan suşu (Sprague Dawley, eGFP PGK organizatörü tarafından yönlendirilen) ITERT (Nantes, Fransa) mevcuttur. Koku alma, insan kök hücreleri, GFP geninin eklemek için, biz lentivirüs enfeksiyon dayalı bir yöntem kullanabilirsiniz. </li><li> Bu yazıda, koku alma ekto mezenkimal kök hücreleri üzerinde odaklanmıştır. Ancak, faiz, koku alma ensheathing hücreleri, başka bir hücre tipi, aynı doku arındırılmalıdır. Biz onların toplama ve arıtma 1,17 için bir yöntem tanımlanmış ve paraplejik hastaların 18 faz I / IIa klinik çalışma için insan burun ensheathing hücreleri kullandı. </li><li> Mezenkimal kök hücre süper ailesinin bir üyesi olarak, OE-MKH adipositler, osteosit ve miyositler 11 ayırt etmek için, uygun kültür koşulları altında edebiliyoruz. </li></ul> Gelecekteki uygulamalar <ul><li> Biz zaten, otizm, bipolar bozukluk, ailesel disotonomi, Parkinson hastalığı, Alzheimer ve şizofreni 2-7 hastalarda hücresel ve moleküler anomaliler çalışma insan koku alma biyopsi kullanmışlardır . Teorik olarak, tüm beyin hastalıkları, burun biyopsileri ya da periferik koku alma kök hücreler kullanılarak incelenebilir. </li><li> Kemirgen ve insan burun koku alma kök hücreler zaten amnezi, Parkinson hastalığı, koklear hasar ve omurilik travması 12-16 hayvan modellerinde aşılı olmuştur. Alzheimer hastalığı, beyin iskemi, Multipl skleroz hayvan modellerinde bu hücrelerin nakli için akla. </li></ul>

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td colspan="3"> Koku mukozasının sıçanlarda Tahsil </td></tr><tr><td> DMEM / HAM F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> Pentobarbital Sodyum </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> 26 iğne </td><td> Terumo </td><td> NN-2613R </td></tr><tr><td> Forseps </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> İnsanlarda olfaktör mukoza Koleksiyonu </td></tr><tr><td> Rijit endoskop </td><td> Karl Storz veya Richard Wolf Tıp </td><td></td></tr><tr><td> Lidokain </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Epinefrin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut etmoid forseps </td><td> Karl Storz veya Richard Wolf Tıp </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Koku alma kök hücrelerinin izolasyonu </td></tr><tr><td> Dispase II. </td><td> Roche </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> Diseksiyon mikroskobu </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mikro spatula </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz IA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> Fetal buzağı serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> Cam lamel </td><td> Knittel&#39;in Glaser </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> Küre oluşumu ve nöronal farklılaşma </td></tr><tr><td> Poli-L-lisin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-1274 </td></tr><tr><td> İnsülin transferrin selenyum (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> AGF </td><td> Ar-Ge Sistemleri </td><td> 236-EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> Ar-Ge Sistemleri </td><td> 233-FB </td></tr><tr><td> Neurobasal orta </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B-27 Serum-Alerjik Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> Glutamat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr></tbody></table>

kemirgenler ve İnsanlar burun koku kök hücreler yalıtımlı

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

Olfaktör mukoza, burun boşluğunda bulunan tespit kokuları sorumlu. Aynı zamanda dış ortama maruz kalan ve yaşayan her bireyin kolayca erişilebilir sadece sinir doku. Sonuç olarak, bu doku patolojik beyin moleküler anomalileri tespit veya hücre tedavisi için yetişkin kök hücrelerin izole amaçlayan herkes için eşsizdir. Beyin hastalıklarının moleküler anormallikler genellikle post-mortem toplanan sinir doku örnekleri kullanılarak çalışıldı. Ancak, bu malzeme, çeşitli sınırlamalar vardır. Buna karşılık, koku mukoza, kolay erişilebilir ve güvenli bir şekilde, koku alma 1 duyusunun kaybı olmadan biyopsi olabilir. Buna göre, koku mukozasının bir gelişimsel çalışmada hangi yetişkin insan (örneğin, otizm, şizofreni) 2-4 veya nörodejeneratif (örneğin Parkinson, Alzheimer) 4,5 hastalıkların bir &quot;açık pencere&quot; sağlar. Karşılaştırmalı moleküler çalışmalar nöron 3,7 4,6 ya da in vitro deneylerde ya Olfaktör mukoza için kullanılabilir . Olfaktör epitel de bir sinir doku viral enfeksiyonlar bakteri, kirlilikten zarar görmüş olduğunu, yerini her geçen gün yeni nöron üretir. Bu kalıcı nöron atalarıdır sürekli değil, aynı zamanda, yani mukoza, neuroepithelium ve altta yatan lamina propria 8-10 iki bölmeleri içinde ikamet eden kök hücre . Yakın zamanda lamina propria bulunan yetişkin kök hücreleri arındırmak için bir yöntem geliştirdi ve kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BM-MSC) yakından ilişkili olduğunu göstermiştir ettikten sonra, biz (onlara koku alma ekto mezenkimal kök hücreleri adında OE- MSC) 11. İlginçtir ki, BM-MKH karşılaştırıldığında, OE-MKH yüksek proliferasyon oranı yükseltilmiş clonogenicity ve sinir hücrelerine ayırt etmek için bir eğim gösterilecek. Biz, şizofreni ve Parkinson hastalığı 4 yeni aday genler açıklayacak adanmış çalışmalar yapmak, bu özellikleri avantaj sağladı. Biz ve diğerleri de omurilik travma 12,13, koklear hasar 14 OE-MKH sonra ya da Parkinson hastalığı 15 veya 16 amnezi bir hayvan modellerinde, hücre tedavisi için aday umut verici olduğunu göstermiştir . Bu çalışmada, sıçanlarda ve insanlarda koku alma mukoza biyopsi yöntemleri mevcut. Toplandıktan sonra, lamina propria enzimatik bir enzimatik veya enzimatik olmayan bir yöntem kullanarak saflaştırılmış epitel ve kök hücreleri ayrılır. Koku alma kök hücreler Saf sonra ya çok sayıda büyümüş ve sıvı azot banked veya küreler oluşturacak şekilde uyarılmış veya sinir hücrelerine ayırt edilebilir. Bu kök hücreler karşılaştırmalı omics (proteomik, genomik transcriptomic epigenomic) çalışmaları için de kullanılabilir.

Biz burada, sıçan ve insan burun boşlukları olfaktör mukoza biyopsi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu biyopsiler, beyin hastalıkları moleküler anomaliler tespit edilmesi ya da beyin travması / hastalık hayvan modellerinde hücre nakli için kullanılabilir multipotent yetişkin kök hücreleri izole ya için de kullanılabilir.

Kemirgenler ve İnsanlar Burun Koku Kök Hücreler Yalıtımlı

Burun boşluğunda yer alan olfaktör mukoza, kokuların tespitinden sorumludur. Ayrıca, dış ortama maruz kalan tek sinir dokusudur...

Bu prosedürün genel amacı, moleküler anomalileri belirlemek veya patolojik ya da travmaya uğramış beyni onarmak amacıyla sıçanlardan veya insanlardan nazal olfaktör kök hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle nazal kaviteden olfaktör mukoza biyopsilerinin cerrahi olarak toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, altta yatan lamina propriadaki ektomezenkimal kök hücrelere odaklanmak için olfaktör epitel ve onun epitel kök hücreleri elenir; sonrasında kemirgen dokusu disosiye edilerek veya cam lam altında kültüre edilen insan implantlarından dışarı büyüyen hücreler toplanarak bu hücreler izole edilir.Prosedürün son adımı, nöron benzeri hücrelere farklılaşmayı tetikleyerek kök hücre kürelerini büyütmektir. Nihayetinde tüm olfaktör mukozanın eksplantasyonu ile bireyselleştirilmiş kök hücreler elde edilir. Yüzer küreler veya nöron benzeri hücreler, beyin hastalıklarındaki moleküler belirteçlerin tanımlanmasında veya sinir sistemindeki hasarın onarılmasında kullanılabilir.Olfaktor mukozadan insan ve kemirgen nazal kök hücrelerini izole etme yöntemini açıklıyoruz. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kök hücrelerin sinir dokusuna ait olması, her canlı bireyde kolayca erişilebilir olması ve patolojik beynin teşhisi veya onarımı için kullanılabilmesidir. Bir KBB cerrahı olarak, çeşitli klinik çalışmalar için yüzlerce nazal biyopsi gerçekleştirdim.Prosedür güvenlidir ve uygulanabilir. Ve lokal genel anestezi. İnsan veya rod, nazal veya faktör kök hücre kültürleri konusunda uzmanlığa sahip genç bir bilim insanıyım.Bunlar yüksek hazırlama hızı sergiler ve nöral hücre tiplerine farklılaşma eğilimine sahiptirler. Amnezi ve nörodejeneratif hastalıkların hayvan modellerinde etkili oldukları kanıtlanmıştır. Mukozanın toplanmasından önce, temiz bir kültür kabininde DMEM-F12 kültür ortamı hazırlanmış 3 adet 35 milimetrelik Petri kabı hazır bulundurulur.Şimdi, sodyum pentobarbital ile sıçanın derin anesteziye girdiğini ayak parmağı sıkıştırma testiyle doğruladıktan sonra, dekapitasyon yoluyla ötanazi yapın. Kafayı izole edin ve deriyi soyun. Alt çeneyi makasla çıkarın ve kendi penseti yardımıyla, ön dişlerin arkasından başlayarak her iki taraftaki yüz kaslarını temizleyin.Ron Jur kullanarak, burun boşluğunu örten kemiği her seferinde bir taraf olacak şekilde çıkarın. Burun arka kısmında yer alan turuncu-kahverengi organlar şeklinde olfaktör konkalar görünür hale geldiğinde, konkaları penset yardımıyla dikkatlice uzaklaştırın.26 gauge bir iğne kullanarak; dokuyu perpendicular plate arkı, CRI form plate ve burun boşluğu tavanı boyunca üç hat üzerinden keserek septum üzerinde yer alan olfaktör mukozayı izole edin. Her iki taraftan biyopsiler toplayın ve bunları A-D-M-E-M ham F 12 ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın. Bu prosedür, ötanazyanın başlangıcından itibaren 10 dakikadan fazla sürmemelidir.Şimdi mukusu temizlemek için, ilgili yerel etik kurulların belirlediği kurallar çerçevesinde, biyopsileri besiyeri dolu Petri kaplarına iki kez aktarın. Bu işlem bir kulak burun boğaz cerrahı tarafından gerçekleştirilmeli ve her ayaktan hastanın, 0 veya 30 derecelik rijit bir endoskop kullanılarak yapılan işlem için bilgilendirilmiş onam formunu imzalamış olması gerekir. Her iki burun boşluğunu inceleyin ve polip veya herhangi bir enflamatuar lezyon varlığı olup olmadığını değerlendirin.Septum devyasyonunu dikkate alarak en uygun burun boşluğunu seçin. Pamuklu bir aplikatör kullanarak, derin bir kesiyle birlikte epinefrinli lidokain gibi lokal bir anesteziyi 10 dakika boyunca uygulayın. Etmoid pensle, orta konkanın medial yönündeki kökünden veya septumun dorsal medial bölgesinden iki kare milimetrelik bir biyopsi alın.Burada kök bölgesinden alınan biyopsiyi gösteriyoruz. Olfaktör biyopsi daha sonra steril bir iğne kullanılarak, içine 1 mL DMEM hem F 12 doldurulmuş steril 2 mL'lik bir tüpe aktarılır. Biyopsinin kültür ortamına tamamen daldığından emin olmak için tüpü ters çevirin.Tüpü soğutmalı bir kaba yerleştirin ve araştırma laboratuvarına taşıyın. Bu aşamada biyopsi, belirli beyin hastalıklarına odaklanan karşılaştırmalı moleküler çalışmalar için olduğu gibi kullanılabilir veya kök hücre üretimi için işlenebilir. İnsan veya sıçan biyopsilerini yıkayın ve DMEM ham F 12 ile bir mililitre dis paste ile doldurulmuş bir Petri kabında inkübe edin.Bir saat boyunca 37 °C'de iki solüsyonla bekletin. Ardından, insan veya sıçan olfaktör epiteli, kırılmış ters ışıklandırmaya sahip bir diseksiyon mikroskobu altında, mikro spatula kullanılarak alttaki lamina propria'dan ayrılır. Olfaktör epitel siyah bir arka plan üzerinde yarı saydam görünürken, lamina propria beyaz bir arka plan üzerinde çizgili turuncu-kahverengi görünür.Saflaştırıldıktan sonra epitel gri, lamina propria ise kahverengi görünür; lamina propriayı DMEM/F-12 ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın. Eğer doku bir kemirgenden geliyorsa, lamina propriayı iki adet 25 gauge iğne ile küçük parçalara bölün. Ardından parçaları, içinde 1 mL kollajenaz 1 A bulunan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dokuyu ayrıştırmak için steril plastik bir pipet kullanın.Ardından tüpü 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Disosiasyonu sonlandırmak için tüpü nazikçe sallayın, kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ekleyin ve 200 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini kültür ortamında resüspande edin ve plastik kültür kaplarına ekleyin.Şimdi, eğer doku insan dokusuysa, limonu uygun şekilde üç veya dört parçaya bölün. Her bir şeridi, dört kuyucuklu bir plaka içerisindeki iki santimetre çapındaki kendi kuyucuğuna yerleştirin ve dokuyu steril 1,3 santimetre çapındaki cam lamellerle örtün.Ardından, her iki doku tipi için her bir kültür kabına 500 µL kültür ortamı ekleyin. Kültür ortamını her iki ila üç günde bir yenileyin. Beş ila yedi günlük kültürleme süresinden sonra, kök hücreler kültür kabını istila etmeye başlayacaktır.Ve iki hafta sonra, hücreler konfluen hale gelmelidir. Konfluens sağlandığında, hücreleri pasajlayın ve kök hücre küreleri oluşturmak için kültür flasklarına aktarın.Hücreleri iki günde bir, santimetrekare başına 16.000 hücre yoğunluğunda ön işlem görmüş flasklara yeniden ekleyin. Hücreleri, santimetrekare başına 0,2 mililitre takviyeli ortam ile besleyin. İki ila beş gün sonra, yüzen hücre kürelerini toplayın ve greftleme işleminden önce bunları ya yeniden ekleyin ya da disocie edin.Koku alma stem hücrelerini nöron benzeri hücrelere farklılaştırmak için geliştirilmiş bir hücre tedavisi hayvan modeli. Hücreleri; B 27, penisilin, streptomisin, glutamin ve glutamat içeren nörobazal medyumda 21 gün boyunca kültüre edin ve ardından her üç günde bir medyum değişimi yapın. Nöron benzeri hücreler, ekimden sonraki beş ila yedi gün içinde, yani iki ila üç hafta sonra ortaya çıkmalıdır.İnsan nazal olfaktör kök hücreleri eksplanttan dışarı büyümüş ve hızla çoğalmıştır. Tam konfluens bir veya iki hafta içinde sağlanabilirdi. Kök hücrelerin temel bir özelliği olan yuva oluşturma ve ekspresyonu; EGF ve FGF 2 ile takviye edilmiş serumsuz bir kültür ortamında polilizin üzerinde büyütüldüklerinde değerlendirildi, olfaktör kök hücreler sferler oluşturdu ve bu sferler serum içeren kültüre ekildiğinde gelişim gösterdi.Besiyerinde, yaklaşık %50 GFAP eksprese eden hücreler, %15'e kadar tubulin eksprese eden hücreler ve %5'e kadar oligo-4 eksprese eden hücreler içeren hücre popülasyonları oluşturdular. Küreden türetilen hücreler takviyeli nöro-bazal kültür besiyerinde büyütüldüğünde, popülasyonun çoğu beta-üç tubulin eksprese eden nöron benzeri hücrelere dönüştü. Aynı nöron benzeri hücreler map2'yi de eksprese etti.Böylece, kök hücrelerin kaderi bir sömestr içinde değiştirilebilir. Bu teknik, dört haftadan kısa bir sürede kolayca milyonlarca kök hücre üretebilir ve klinisyenlerin gelecekte otolog hücre transplantasyonu gerçekleştirmesine olanak tanır. Nazal refrakter biyopsiler, biyobelirteçlerin ve beyin hastalıklarının tanımlanmasında oldukça yararlıdır.Yakın zamanda otizm için yeni aday genler bulma konusunda başarılı olduk. Otistik ve kontrol grubu bireylerden oluşan bir olfaktör kök hücre bankası kurmuş bulunmaktayız ve bu yapı diğer insan beyin bozukluklarını kapsayacak şekilde genişletilebilir.

isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Farenin tükürük bezi kök hücrelerin izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol açıklanmıştır. Yöntemi, enzimatik ve mekanik sindirim istihdam ve hücrelerin kök hücre özelliklerini içeren salispheres izolasyonu izin verir.

Fare Tükürük Bezi Kök Hücre İzolasyonu

Bu video, yetişkin fare beyninden lateral ventrikül duvarlarını izole etmek ve tek hücreler elde etmek için enzimatik doku ayrışması gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Bu hücreler daha sonra nöral kök hücrelerin proliferasyonunu seçici olarak artıran ve bunların oligodendrositlerin ve astrositlerin ko-kültürlerine farklılaşmasını teşvik eden spesifik kültür koşullarına tabi tutulur.

Yetişkin fare nöral kök hücrelerinden karışık oligodendrosit ve astrosit kültürü elde edilmesi

Koku ensheathing hücreleri (OECS), birincil koku nöronların büyümesine izin vermek nöral tepe hücreleri bulunmaktadır. Bu özel özellik, hücresel nakli için de kullanılabilir. Burada bir gırtlak sinir yaralanması modelinde OECS kullanımına göre hücre transplantasyonu bir model mevcut.

Periferik Sinir Hasarı Sonrası Fonksiyonel Kurtarma Değerlendirmesinde Koku Ensheathing Hücre Nakli

Yetişkin beyin hasat nöral kök hücreler sinir sistemi gelişiminin temel araştırma rejeneratif tıpta potansiyel klinik uygulamaları keşfetmek için çeşitli uygulamalar kullanılmaktadır artmaktadır. Bu deneysel sonuçların ses için kritik bu hücreleri büyümek için kullanılan yalıtım ve kültür koşullarında titiz kontrolü yapar.

Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen

Yetişkin memeli omuriliği, kültürde izole edilebilen ve genişletilebilen nöral kök/progenitör hücreler (NSPC'ler) içerir. Bu protokol, erişkin omuriliğinin periventriküler bölgesinden sıçandan ve insan organ nakli donörlerinden üretilen NSPC'lerin toplanmasını, izolasyonunu, kültürünü ve geçişini açıklar.

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Tip 2 inflamasyonda rol oynayan Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2'ler), esas olarak helmint enfeksiyonuna, alerjik hastalıklara, metabolik homeostaza ve doku onarımına yanıt olarak katılır. Bu çalışmada, ILC2'leri murin burun mukozasından izole etmek ve CD226 ekspresyonunu saptamak için bir prosedür gösterilmiştir.

CD226 Ekspresyonunu Saptamak için Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin Fare Burun Mukozasından İzolasyonu

Canlı sıçanların beyinlerinden nöral kök hücrelerin ve oligodendrosit progenitör hücrelerinin izolasyonu için bir yöntem burada deneysel olarak ayrıntılı olarak sunulmaktadır. Refahlarından ödün vermeden bu hücrelerin aynı hayvanlardan birden fazla toplanmasına izin verir.

Canlı Sıçanlardan Nöral Kök Hücrelerin ve Oligodendrosit Progenitör Hücrelerin İzolasyonuna Yönelik "Beyin Sağım" Yöntemi

Burada, erişkin murin subventriküler bölgesinden izole edilen genişletilmiş nöral kök hücrelerde (NSC'ler) gen iletim verimliliğini artırmak için tasarlanmış bir nükleofeksiyon sistemini açıklıyoruz. Bulgular, bu yöntemin NSC'lerde gen bozulmasını önemli ölçüde iyileştirdiğini, geleneksel transfeksiyon protokollerinin etkinliğini aştığını ve hücre sağkalım oranını artırdığını göstermektedir.

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Bu makale, tek çekirdekli RNA dizilimi amacıyla murin koku alma epitelinin diseksiyonu ve dissosiyasyonu için kolaylaştırılmış bir protokol sağlar.

Tek çekirdekli süspansiyonlar için fare koku alma epitelinin hızlı diseksiyonu ve ayrışması

Keşfedin burun koku mukozası biyopsisi yöntemiyle sıçan ve insanlardan yetişkin kök hücre izolasyonunu. Bu güvenli teknik, sinir sistemi hasarının onarımı ve beyin hastalıklarında biyobelirteç tespiti için umut vadediyor.

Kemirgenler ve İnsanlar Burun Koku Kök Hücreler Yalıtımlı

Daha fazla video keşfet